PLoS ONE: Sonic Hedgehog-Signalweg ist unverzichtbar für die Pflege von Krebsstammzellen-ähnlichen Zellen in menschlichen Magen Cancer

Abstrakt

Abnormal Aktivierung des Sonic-Hedgehog (SHH) Weg hat sich in einer Vielzahl von Krebserkrankungen des Menschen beschrieben worden und in Krebsstammzellen (KSZ), aber die Rolle der SHH Weg in Magen CSCs nicht berichtet worden. In dieser Studie untersuchten wir die Möglichkeit, die abnormale Aktivierung des SHH-Weg die Eigenschaften des Magen CSCs gehalten. Erstens haben wir identifiziert Krebs stielartigen Zellen (CSLCs) aus menschlichen Magenkrebszelllinien (HGC-27, MGC-803 und MKN-45) mit tumorsphere Kultur. Im Vergleich mit anhaftenden Zellen hatten die schwebenden tumorsphere Zellen mehr selbst erneuernden Kapazität und Chemoresistenz. Die Zellen CSCs Marker (CD44, CD24 und CD133) waren auch deutlich mehr in tumorsphere Zellen als in anhaftenden Zellen exprimiert. Noch wichtiger ist, zeigten in vivo-Xenotransplantat-Studien, daß Tumoren mit 2 x 10 ^{4 tumorsphere Zellen erzeugt werden können, die weniger 100fach als die für Tumoren durch adhärente Zellen Animpfen erforderlich war. RT-PCR und Western-Blot zeigte nächstes dass die Expressionsniveaus von Ptch und Gli1 (SHH Stoffwechselweg Zielgene) in tumorsphere Zellen signifikant höher waren als in adhärenten Zellen. Die Ergebnisse der quantitativen Echtzeit-PCR waren ähnlich denen von RT-PCR und Western-Blot. Eine weitere Analyse ergab, dass durch Cyclopamin oder 5E1 blockiert SHH Weg eine höhere Reduzierung der Selbsterneuerungskapazität von HGC-27 tumorsphere Zellen als die von anhaftenden Zellen verursacht. Wir fanden auch, dass SHH-Weg stark verbessert, die Wirksamkeit von Chemotherapeutika in HGC-27 tumorsphere Zellen in vitro und in vivo blockieren, hatte aber keine signifikante Wirkung in adhärenten Zellen. Schließlich haben wir isoliert die tumorspheres von Magenkrebs Probe, diese Zellen hatten auch Chemoresistenz und tumorigenen Kapazität und SHH Weg gehalten, um die Magen CSLCs Eigenschaften von tumorsphere Zellen aus primären Tumorproben. Abschließend unsere Daten legten nahe, dass SHH Weg für die Wartung von CSLCs in der menschlichen Magenkrebs wesentlich war}

Citation:. Song-Z, Yue W, Wei B, Wang N, Li T, Guan L, et al. (2011) Sonic Hedgehog-Signalweg ist unverzichtbar für die Pflege von Krebsstammzellen-ähnlichen Zellen in der menschlichen Magenkrebs. PLoS ONE 6 (3): e17687. doi: 10.1371 /journal.pone.0017687

Editor: Mikhail Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Vereinigte Staaten von Amerika

Empfangen: 27. November 2010; Akzeptiert: 10. Februar 2011; Veröffentlicht: 4. März 2011

© 2011 Song et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit wurde von der National High Technology Research und Development Program von China (È6AA402A04,È6AA02A107), der großen staatlichen Grundlagenforschung Programm von China (È9CB521704) und der National Nature Science Foundation of China (Ĵ72468,Ĵ73031) unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

CSCs spielen eine wichtige Rolle bei der Krebsentstehung, diese Subpopulation innerhalb Tumor besitzt die Eigenschaften von sich selbst erneuernden Kapazität, Chemoresistenz und tumorigenen Kapazität somit eine entscheidende Rolle bei der Initiierung, Progression und ein erneutes Auftreten von Krebs spielen. Untersuchen und die Manipulation der biochemischen Wege in diesen Merkmalen beteiligt ist eine der besten Möglichkeiten, um CSCs beitragen, die zur Entwicklung neuer Medikamente und Behandlungsverfahren. SHH-Weg spielt eine wichtige Rolle in vielen KSZ wie Glioblastom Stammzellen [1], [2], CD34 + leukämische Zellen, [3], [4] und der Brust KSZ [5], zusätzlich ist es von entscheidender Bedeutung für die Entwicklung und Homöostase von Magen-Drüse [6], abnorme Aktivierung des SHH Weg in Magenkrebs führen kann [7], [8], aber die Rolle der SHH Weg im Magen-CSCs ist nicht klar.

SHH Weg in Säugerzellen wird durch Liganden vermittelten Shh [9]. In Abwesenheit von Shh hemmt die Transmembranrezeptor gepatchten (Ptch) die Aktivität eines anderen Transmembranprotein, Smoothened (Smo), was zu einer Inaktivierung von SHH Stoffwechselweg [9], [10]. Bindung von Shh auf Ptch hebt den inhibitorischen Effekt von Ptch und Smo wird dereprimiert und dadurch aktivierenden Transkriptionsfaktor Gli (Gli1, Gli2 und Gli3) [9], [10]. Gli1 ist ein starker Aktivator der positive nachgeschalteten Zielgene und ist selbst eine Transkriptions Ziel von SHH-Weg [11]. Daher wird Gli1 ein Marker für SHH Weg abnormen Aktivierung betrachtet [10], [12]

Vor kurzem verschiedene Arten von CSCs oder CSLCs wurden von bösartigen Tumoren identifiziert und isoliert [13] - [25].. In Magenkrebs, methodologisch, ist es schwierig, CSCs von Zelllinien oder Tumorgewebeproben zu isolieren und zu verstärken. In der heutigen Zeit, CD44 die nützlichsten Marker für prospektive Reinigung von Magen CSCs zu sein scheint, ist es jedoch nicht sehr spezifisch für Magen-KSZ [26].

In dieser Studie isolierten wir CSLCs von menschlichen Magen Krebszelllinien (HGC-27, MGC-803 und MKN-45) tumorsphere Kultivierung in serumfreiem Medium und die Selbsterneuerungskapazität, Chemoresistenz und tumorigenen Kapazität der tumorsphere Zellen identifiziert; Als nächstes wir die Expression von SHH-Weg-verwandte Moleküle, einschließlich Shh, Ptch, Smo, Gli1 und Gli2 in tumorsphere Zellen und adhärente Zellen, insbesondere die Expression von Ptch und Gli1.Then suchten wir blockiert SHH Stoffwechselweg von Cyclopamin oder Tomatidin Steuer, 5E1 oder kontrollieren PBS zu untersuchen, ob die Eigenschaften der CSLCs in tumorsphere Zellen durch abnormale Aktivierung des SHH Weg beibehalten wurden. Schließlich verwendeten wir Proben Magenkrebs die funktionalen Aspekte der SHH Weg in Magen CSLCs zu analysieren.

Cyclopamine ist ein zellpermeables Steroidalkaloid. Es stört Cholesterin-Biosynthese und antagonisiert spezifisch SHH-Signalweg durch direkte Interaktion mit Smo (geglätteten), eine entfernte Verwandte von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren. Es ist ein wertvolles Werkzeug, um die Beteiligung von SHH-Signalisierung in der Entwicklung von verschiedenen Tumoren für die Untersuchung. Tomatidin ist ein Steroid-Alkaloid, das strukturell Cyclopamin ähnelt, aber es fehlt die Fähigkeit SHH-Signalisierung zu hemmen. Es kann als Negativkontrolle verwendet werden. 5E1 ist ein Anti-Hh monoklonalen Antikörper, der die SHH und IHH Aktivität neutralisiert.

Ergebnisse |

1. Tumorsphere Zellen besitzen die Eigenschaften von CSLCs

Wir wuchsen HGC-27, MGC-803 und MKN-45-adhärenten Zellen in einem serumfreien Medium in dem Abschnitt Verfahren beschrieben. Nach 7 Tagen wurden tumorspheres bestehend aus etwa 50 bis 100-Zellen beobachtet (Fig. 1A).

Die selbst erneuernden Kapazität dieser tumorspheres sie in einzelne Zelle beurteilt wurde durch Dissoziieren und wächst bei einer klonalen Dichte von 1,000 Zellen pro Milliliter. Nach 2 Wochen Bildung einzelne Zelle, abgeleitet von HGC-27 tumorsphere Zellen erzeugten Unter tumorspheres bei 41,83% ± 3,13% im Vergleich zu 8,17% ± 2,40% der anhaftenden Zellen zudem in MGC-803 und MKN-45, die Unter tumorspheres Rate von tumorsphere Zellen waren ebenfalls höher als die von anhaftenden Zellen. (Fig. 1B). Diese Daten legten nahe, dass das Selbsterneuerungskapazität tumorsphere Zellen war signifikant höher als die von anhaftenden Zellen. Tumorsphere Zellen auch eine erhöhte Fähigkeit zeigte Kolonien unter Verankerung unabhängigen Bedingungen in einem Standard-Soft-Agar-Test nach 14 Tagen in HGC-27 und MKN-45 (Fig. 1C) zu bilden.

Wir führten auch eine Grenzverdünnung HGC-27 tumorsphere Zellen und anhaftenden Zellen-Assay für Sphäroiden Bildung jeweils unter Verwendung. Wie in Tabelle S1 gezeigt ist, etwa 27-35% der Zellen konnten tumorsphere Sphäroide erzeugen, während weniger als 5% der adhärenten Zellen Sphäroide nach 3 Wochen Kultur erzeugen könnte. Daher ist in den HGC-27 tumorsphere Zellen, konnten wir schätzen, dass die Sphäroide bildenden Zellen Population ein Maximum von 35% besteht.

Chemoresistenz ein weiteres Merkmal des CSCS ist, so haben wir untersucht, ob ein Unterschied in der Chemoresistenz bestand zwischen tumorsphere Zellen und adhärenten Zellen. Die Ergebnisse zeigten, dass nach 48 Stunden tumorsphere Zellen im Vergleich zu adhärenten Zellen unter den gleichen Bedingungen erheblich höhere Beständigkeit gegenüber Medikamenten nachgewiesen (Fig. 1D). Wir haben auch Chemoresistenz von HGC-27 tumorsphere Zellen und adhärente Zellen auf verschiedene Konzentrationen von Arzneimitteln beurteilt jedoch sowohl tumorsphere Zellen und adhärente Zellen zeigen, nicht signifikant Chemoresistenz gegen Medikamente in einer dosisabhängigen Weise (Fig. S1).

Als nächstes untersuchten wir die Expression von CD44 in dissoziierten tumorsphere Zellen und adhärenten Zellen unter Verwendung von Immunfluoreszenz-Assays und western-Blot. Die Ergebnisse zeigten, dass die Zellen CD44 waren signifikant in tumorsphere Zellen als in adhärenten Zellen (Fig. 2A) exprimieren. Außerdem wurde durch Western-Blot untersucht, die Expression anderer CSCs Markern (CD24 und CD133) in tumorsphere Zellen und adhärente Zellen, verglichen mit tumorsphere Zellen wurde die Expression von CD24 signifikant niedriger in adhärenten Zellen, während die Expression von CD133 ähnlich war (Fig 2B.). Ferner wir HGC-27 Zellen durch FACS für CD44 Sortier fraktioniert, fanden wir, dass CD44 (+) Zellfraktion mehr Sphäroid Kolonien im Vergleich mit CD44 erzeugen könnte (-) Zellfraktion ferner die Größe des Sphäroids Kolonien von CD44 (+) Zellen war größer als diejenigen, die aus CD44 (-) (Fig. 2C). Zellen

2. Tumorsphere Zellen Tumoren bei Xenotransplantation

Für Xenograft Studien, die gleiche Anzahl erzeugen könnte (2 x 10 ^{4, 2 × 10 5, 2 × 10 6, 2 x 10 7) frisch tumorsphere Zellen oder Kontrolle anhaftenden Zellen dissoziiert injiziert sc in jede Maus (6 Mäuse pro Gruppe). Die Ergebnisse zeigten, dass Tumoren mit 2 x 10 4 tumorsphere Zellen erzeugt wurden, die bei 100-fach weniger als die für Tumor seeding erforderlich durch adhärente Zellen (Tabelle 1). Außerdem tumorsphere Zellen erzeugt subkutanen Tumoren mit größerem Volumen und kürzerer Zeit im Vergleich mit denen, erzeugt von adhärenten Zellen (Fig. 3A, B). Somit bestätigte subkutane Injektion von geringen Anzahl von tumorsphere Zellen, dass die Sphäroid-Zellen in Nacktmäusen stärker tumorigenen Kapazität beibehalten als anhaftenden Zellen}

H &. E Prüfung von abgeleiteten Xenografts HGC-27 tumorsphere Zellen zeigten, dass diese Tumoren eng ähnelte dem ursprünglichen humanen Tumor, vor allem differenzierte Zellen (Abb. 3C) enthält. Wichtig ist, tumorspheres wieder abgeleitet von den xenotransplantierten Tumoren (Fig. 3D) werden konnte, und sie konnten Tumor bilden wieder (Fig. 3E). Diese Daten zeigten daher, dass die tumorsphere Zellen CSLCs dargestellt, die tumorigenen Kapazität hatte.

3. SHH Weg war höher in tumorsphere Zellen exprimiert als in adhärenten Zellen

Um die Verbindung zwischen SHH Weg und CSLCs Eigenschaften von tumorsphere Zellen untersuchen wir zunächst die mRNAs Expression von SHH-Weg-verwandte Moleküle untersucht, einschließlich Shh, Ptch, Smo, Gli1 und Gli2 durch RT-PCR. Die Ergebnisse zeigten, dass alle der mRNAs in hoher HGC-27 exprimiert wurden tumorsphere Zellen. Im Vergleich mit tumorsphere Zellen, die Expressionsniveaus von Shh, Ptch, Smo und Gli1 waren signifikant niedriger als bei adhärenten Zellen, während die Expression von Gli2 ähnlich waren Zellen tumorsphere. In MGC-803 und MKN-45, die Expression von Shh, Ptch und Gli1 waren auch deutlich niedriger in adhärenten Zellen als in tumorsphere Zellen, während die Expression von Smo und Gli2 keinen signifikanten Unterschied zwischen adhärenten Zellen hatten und tumorsphere Zellen (Fig . 4A).

In SHH Weg, Zielgene Ptch und Gli1 sind, werden sie als wichtige Marker der SHH Weg abnormen Aktivierung betrachtet. So untersuchten wir weiterhin die Expressionsniveaus von Ptch und Gli1 durch Western-Blot und quantitative Echtzeit-PCR.

Wenn Western-Blot unter Verwendung fanden wir, dass die Expression von Ptch und Gli1 waren ebenfalls höher in tumorsphere Zellen als in adhärenten Zellen (Fig. 4B). Wir untersuchten als nächstes die Expressionsniveaus von Ptch und Gli1 in Xenotransplantaten von HGC-27 durch quantitative Echtzeit-PCR. Quantitative Echtzeit-PCR-Analysen von SHH Zielgenen (PTCH und GLI1) zeigte die gleichen Ergebnisse der oben semi-quantitative RT-PCR (Fig. 4C).

4. SHH Weg Blockierung reduziert die Selbsterneuerungskapazität und Chemoresistenz von HGC-27 tumorsphere Zellen

für eine mögliche Rolle von SHH Weg in sich selbst erneuernden Kapazität von tumorsphere Zellen zu testen, verwendeten wir cyclopamine oder Steuer Tomatidin, 5E1 oder Steuer PBS den Weg zu versperren.

die Ergebnisse zeigten, dass Cyclopamin Behandlung für die Bildung von Unter tumorspheres in HGC-27 tumorsphere Zellen in einer dosisabhängigen Art und Weise zu einer signifikant Kapazitätsverringerung geführt, aber keine solche Wirkung wurde in adhärenten Zellen (Fig. 5A) beobachtet. Wir weiter ausgewertet, ob die Behandlung mit Cyclopamin die Kolonien Bildungskapazität von HGC-27 tumorsphere Zellen durch Verankerung -unabhängigen Wachstumstest beeinflussen würde. In ähnlicher Weise wurde die Fähigkeit zur Bildung von Kolonien mehr in den tumorsphere Zellen in einer dosisabhängigen Art und Weise relativ zu den adhärenten Zellen verringert (Fig. 5B).

Als nächstes untersuchten wir die Wirkung von SHH-Weg auf Chemoresistenz von HGC -27 tumorsphere Zellen behandelten wir die dissoziierten Zellen mit Cyclopamin oder Steuer Tomatidin für 48 Stunden und dann Medikamentenresistenz von tumorsphere Zellen bewertet. Wenn Cyclopamin durch Medikamente gefolgt wurde, führte die Behandlung in einer insgesamt deutlich Zelltod Rate verbessert. Die besten Ergebnisse wurden erzielt, wenn cyclopamine mit Oxaliplatin und Mitomycin kombiniert wurde (Abb. 5C). Kein solcher synergistischer Effekt wurde in adhärenten Zellen nach Exposition gegenüber Medikamenten mit Cyclopamin 48 Stunden (Fig. 5D).

beobachteten wir untersucht auch die Wirkung von verschiedenen Konzentrationen von Cyclopamin (2,5 uM, 5 uM, 10 uM) auf den Zelltod. Die Ergebnisse zeigten, dass Cyclopamin allein Zellen tumorsphere eine kleine, aber konsequente Verringerung der Lebendzellzahl machen könnte. Verglichen mit HGC-27 tumorsphere Zellen wurde die Wirkung von Cyclopamin auf Zelltod zu adhärenten Zellen mehr an Bedeutung (Fig. 5C, D).

Wenn SHH Weg wurde von 5E1 blockiert oder PBS-Kontrolle, die Ergebnisse der Selbst -renewing Kapazität und Chemoresistenz von tumorsphere Zellen und adhärente Zellen waren ähnlich denen blockiert durch Cyclopamin oder Tomatidin Steuerung (Fig. S2).

5. SHH Signalweg blockiert verbesserte Ansprechen des Tumors auf Arzneimittel in vivo

Zur Überprüfung dieser Hypothese in vivo, wir untersucht, ob SHH Weg verbesserte Chemotherapie Wirksamkeit blockieren, cyclopamine oder Kontrolle Tomatidin verwendet wurde SHH Weg Antworten zu hemmen. HGC-27 tumorsphere Zellen wurden in die beiden hinteren Flanken von Nacktmäusen wachsen, bis der größere Durchmesser des Tumors etwa 2 mm erreicht. Die Mäuse wurden dann 3 Wochen mit Cyclopamin oder Tomatidin Steuer 24 Stunden vor Oxaliplatin Lieferung zweimal pro Woche behandelt. Bei allen behandelten Mäusen mit Oxaliplatin behandelten Tumoren waren deutlich kleiner als die nicht mit Oxaliplatin behandelt. Außerdem Tumoren signifikant höhere Hemmung des Tumorwachstums zeigten, wenn sie mit Oxaliplatin in Kombination mit Cyclopamin behandelt wurden, die Tumorantwort auf chemotherapeutische Medikament von Cyclopamin verstärkt wurde (Fig. 6A, B). Wir untersuchten auch, ob SHH Weg durch 5E1 blockiert oder Kontrolle PBS in vivo Chemotherapie Wirksamkeit verbessert, die Ergebnisse zeigten, dass 10 &mgr; g /ml 5E1-Behandlung zu einer signifikant größeren Hemmung des Tumorwachstums als die nur geführt, behandelt mit Oxaliplatin (Fig. 6A, B).

Diese Daten legen nahe, dass, obwohl Standard-Chemotherapeutika Tumorauswuchs während der Behandlung verzögert, wenn sie mit Cyclopamin oder 5E1 kombiniert wurden, wurde die Wirksamkeit der Chemotherapie erheblich verbessert und auch mehr nachhaltig nach Unterbrechung der Behandlung.

Als nächstes zu untersuchen, ob in vivo SHH Weg blockiert auf HGC-27 tumorsphere Zellen eine spezifische Wirkung hatte. Die Mäuse wurden nur Cyclopamin an der rechten Hinterflanke oder Steuer Tomatidin am linken hinteren Flanke (zweimal pro Woche für 3 Wochen) behandelt, wenn Tumoren von HGC-27 tumorsphere Zellen etwa 2 mm erreicht wird, nach 3 Wochen führten wir eine Grenzverdünnungsassay für Sphäroide Bildung mit Tomatidin Verwendung mit cyclopamine behandelten Tumorzellen und behandelt sind. Wie in Tabelle S2 gezeigt ist, etwa 9-15% der Zellen von xenotransplantierten mit Tomatidin behandelten Tumors konnte Sphäroide erzeugen, während weniger als 2,5% der Zellen von xenotransplantierten mit Cyclopamin behandelt Tumorsphäroide erzeugen könnte. Daher blockiert SHH Weg in vivo konnte die Zahl der Magen CSLCs reduzieren.

6. SHH Weg die Magen CSLCs Eigenschaften von tumorsphere Zellen aus primären Tumorproben beibehalten

Um zu bestimmen, ob SHH Weg in den Magen-CSCs Eigenschaften von tumorsphere Zellen von Magenkrebsgewebe beteiligt sein könnten, verwendeten wir primären Magenkrebs Proben der zu analysieren funktionelle Aspekte des SHH-Weg im Magen CSLCs.

First wuchsen wir frisch bulk Zellen von Magenkrebs Proben in serumfreiem Medium dissoziiert in dem Abschnitt Verfahren beschrieben, nach 10 Tagen, tumorspheres beobachtet wurden (Fig. 7A, B). Dann untersuchten wir Chemoresistenz und tumorigenen Kapazität der tumorsphere Zellen von Magenkrebsgewebe. Die Ergebnisse zeigten, dass tumorsphere Zellen von Magenkrebsgewebe zu Drogen als bulk-Zellen unter den gleichen Bedingungen (Fig. 7C) wesentlich größeren Widerstand gezeigt. Außerdem frisch dissoziierten bulk Zellen von Magenkrebs Proben bei 2 injiziert × 10 ^{7 Zellen pro Maus fähig waren subkutane Tumoren aufzubauen, während weniger als 2 × 10 4 der tumorsphere Zellen von Magenkrebs Proben bilden könnten Tumoren (Tabelle 1), die Xenotransplantate Tumoren, die von der Injektion von tumorsphere Zellen führte präsentiert die gleichen Merkmale wie Histopathologie ihrer jeweiligen menschlichen Tumor (Fig. 7F). Diese Ergebnisse zeigten, dass tumorsphere Zellen von Magenkrebsgewebe die Merkmale CSLCs besaß. Als nächstes haben wir beobachtet, um die Wirkung von Shh Stoffwechselweg Blockierung auf Chemoresistenz von tumorsphere Zellen in vitro und Tumorantwort auf Arzneimittel in vivo. Die Ergebnisse zeigten, dass Cyclopamin oder 5E1 konnte in einem deutlich verbesserten Gesamt Zelltod Rate führte (Abb. 7D) und der Tumor Reaktion auf Arzneimittel (Abb. 7E).}

Diskussion

CSCs teilen viele Eigenschaften mit Gewebestammzellen, wie beispielsweise Selbsterneuerung, Proliferation, Chemoresistenz, und das Wachstum von Tumoren [27] für den Erhalt, in erster Linie verantwortlich [28]. Viele Forscher haben Sortierfluoreszenzaktivierte Zell verwendet zu identifizieren und zu isolieren, KSZ und festgestellt, dass diese Zellen Sphären in spezialisierten serumfreien Medium bilden können. In dieser Studie haben wir den umgekehrten Weg von tumorsphere Zellen zu entwickeln und dann zu bestimmen, ob diese Zellen CSCs Eigenschaften erworben.

Wir haben ein definiertes serumfreies Medium, bestehend aus EGF, FGF-2, B-27 Ergänzung und N-2 Supplement Magenkrebszelllinien zu erhalten. Diese Bedingungen verwendet worden, bevor endogene neuralen Stammzellen /Vorläuferzellen und Tumorstammzellen aus menschlichen Tumoren und Tumorzelllinien zu erhalten. Beispielsweise Kondo et al. [24] charakterisiert die C6 Ratten Tumorzelllinie in vitro und in vivo und beobachtet, von der gut charakterisierten Seitenpopulation abgeleitet eine kleine Population von stielartigen Zellen. Setoguchi et al. [29] zeigten, Krebs stielartigen Zellpotential in anderen Krebszelllinien, einschließlich der MCF7-Brustkrebslinie, B104 Neuroblastom, und HeLa-Adenokarzinom.

Bei unserem Experiment haben wir drei Magenkrebs-Zelllinien (HGC- 27, MKN-45 und MGC-803) zur Kultur tumorspheres. HGC-27-Zelllinie wurde durch die Kultur des metastasierenden Lymphknoten von einem Magenkrebspatienten diagnostiziert histologische als undifferenziertes Karzinom festgestellt. MKN-45 wurde aus dem schlecht differenzierten Adenokarzinom des Magens einer 62-jährigen Frau gegründet. MGC-803 ist ein epithelial schlecht differenzierten menschlichen Magen schleimig-Adenokarzinom-Zelllinie von einem 74-jährigen Mann.

Zwei unterschiedliche Ansätze haben in der Regel verwendet CSCs in veröffentlichten Studien [30], [31] zu identifizieren . Eine davon ist ein in vitro-Verfahren als "Sphäroid Koloniebildung", und die andere ist in vivo Verfahren, das die Implantation von Kandidaten CSCs unter der Haut von immundefizienten Mäusen.

Die erste Methode beinhaltet in Kulturschalen Kandidaten CSCs Züchten speziell beschichteten für noncell Befestigung mit serumfreiem Medium, das den epidermalen Wachstumsfaktor und basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor. Das Wachstum der kugelförmigen Kolonien nach einigen Wochen wird als indikativ für Selbsterneuerungsfähigkeit und würde mit einem CSC Phänotyp konsistent sein. Das letztere Verfahren Einwachsen von Zellen in immundefizienten Mäuse-benötigt wahre Tumorigenität zu demonstrieren und wird allgemein als der Goldstandard für die Existenz des CSCS erweist. Eine Reihe von Studien haben vorgeschlagen, dass diese beiden Ansätze liefern im allgemeinen ähnliche Ergebnisse in CSCs Kandidaten für viele feste Tumore auszuwerten.

Derzeit Magen CSCs nicht spezifische Oberfläche Hersteller haben, so haben wir tumorsphere Zellen entwickelt und dann bestimmt, ob diese Zellen CSCs erworbene Eigenschaften, einschließlich sich selbst erneuernden Kapazität, Chemoresistenz und tumorigenen Kapazität.

Unsere Daten zeigten, dass Magenkrebs-Zelllinien (HGC-27, MGC-803, MKN-45) in einem definierten serum gewachsen freies Medium könnte tumorspheres bilden, die Zellen wie CSLCs verhalten enthalten. In vitro zeigte tumorsphere Zellen eine erhöhte Fähigkeit Kolonien in Weichagar unter Verankerung unabhängigen Bedingungen und eine erhöhte Fähigkeit zur Bildung Unter tumorspheres zu bilden. Wir zeigten auch, dass die Selbsterneuerungsfähigkeit hatte Durchlässe 2 bis 8 (von 44,5% bis 70,5%), eine Zunahme Unter tumorspheres der HGC-27 tumorsphere Zellen zu bilden, und dann gehalten es einen relativ stabilen Anteil nach 8 oder mehr Durchgänge, wenn sie bei klonaler Dichte (Fig. S3) gezüchtet. Diese Daten legen nahe, dass die proliferative Potential von tumorsphere Zellen wurde nach längerer Passagen beibehalten. Darüber hinaus schlug tumorsphere Zellen in vitro waren resistenter gegen Oxaliplatin und Mitomycin Vergleich zu adhärenten Zellen, diese Daten, dass tumorsphere Zellen von angereichertem Anzahlen von CSLCs bestehen, die potentiell machte sie weniger anfällig für die Wirkungen von sowohl Oxaliplatin und Mitomycin. In vivo konnte tumorsphere Zellen Tumoren bei Xenotransplantation mit einer höheren Rate als adhärenten Zellen generieren. Außerdem tumorsphere Zellen erzeugt subkutanen Tumoren mit größerem Volumen und kürzerer Zeit im Vergleich mit denen von anhaftenden Zellen erzeugt wird, ist wichtig, tumorspheres wieder abgeleitet von den xenotransplantierten Tumoren werden konnte, und sie konnten Tumor wieder bilden, vorgeschlagen, diese Daten, dass tumorspheres in CSLCs angereichert .

In unserer Studie anhaftenden Zellen enthielt vermutlich einen relativ geringen Anteil an CSCs, da kein Verfahren zur Isolierung oder Entfernung dieser Zellen verwendet wurde. Es kann argumentiert werden, dass es diese kleine Population von CSCs ist, die für die Tumorbildung verantwortlich ist. Unabhängig davon, mehr CSCs in den tumorsphere Zellen evident waren, die ihre mehr aggressives Verhalten erklären kann.

Als nächstes untersuchten wir, ob die Eigenschaften von CSLCs in tumorspheres durch abnormale Aktivierung des SHH Weg beibehalten wurden. Zunächst haben wir gezeigt, dass die mRNA-Expressionsniveaus von SHH-Weg-verwandte Moleküle (Shh, Ptch und Gli1) in tumorsphere Zellen signifikant höher waren als in adhärenten Zellen, während hohe Gli2 in beiden Zellen exprimiert wurde. Wir weiterhin die Expressionsniveaus von SHH Stoffwechselweg Zielgene untersucht (Ptch und Gli1) durch Western-Blot und quantitative Echtzeit-PCR, die Ergebnisse waren ähnlich denen von RT-PCR. Zweitens, die Hemmung der SHH Signalweg-Aktivität von Cyclopamin oder 5E1 führte zur Selbsterneuerung Kapazität verringert und erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Drogen in HGC-27 tumorsphere Zellen, aber diese Effekte wurden nicht in anhaftenden Zellen ausgeprägt. In vivo, bei allen behandelten Mäusen mit Oxaliplatin behandelten Tumoren waren deutlich kleiner als die nicht mit Oxaliplatin behandelt, nach der Behandlung mit Cyclopamin oder 5E1, wurde die Tumorantwort auf chemotherapeutische Arzneimittel verbessert. Diese Daten legen nahe, dass, obwohl Standard-Chemotherapeutika Tumorauswuchs während der Behandlung verzögert, wenn sie mit cyclopamine kombiniert wurden, wurde die Wirksamkeit der Chemotherapie erheblich verbessert und auch mehr nachhaltig nach Unterbrechung der Behandlung.

Schließlich haben wir primären Magenkrebs verwendet Proben, die die funktionalen Aspekte der SHH Weg in Magen CSLCs zu analysieren. Die Ergebnisse zeigten, dass tumorsphere Zellen von Magenkrebs Probe hatte auch Chemoresistenz und tumorigenen Kapazität, außerdem Weg Blockierung SHH reduziert die Chemoresistenz von tumorsphere Zellen und verstärkte Ansprechen des Tumors auf Arzneimittel in vivo.

Wie für Chemoresistenz, mehrere Merkmale von CSCs können sie schwer machen, zu beseitigen. CSCs sind relativ ruhig, und dies ermöglicht es ihnen, von Chemotherapien zu entkommen, die normalerweise aktiv proliferierender Zellen abzielen. Außerdem ist, wie für ihre normalen Gegenstück dargestellt ist, haben CSCs vorgeschlagen worden, eine hohe Expression von Multidrug-Transporterfamilie Gene aufweisen, wahrscheinlich in effizienter Efflux von chemotherapeutischen Arzneimitteln und angeborene multidrug resistance resultierenden Zusätzlich Signalwege, wie Wnt, Hedgehog oder Notch, sind in CSCs, die zu Tumorentwicklung dysreguliert. Die Entwicklung eines effizienten therapeutischen Ansatz würde erfordern daher die Identifizierung von unverwechselbaren molekularen Wege aktiv in CSCs und die Identifizierung von Mitteln, die entweder die Proliferation Block CSC oder CSC Differenzierung induzieren, wodurch die Empfindlichkeit gegenüber Chemotherapeutika verbessern. Also, wichtige Faktoren, die Chemoresistenz von CSCs sind intrinsische Faktoren zu beeinflussen. Die Mikro oder Nische, kann die Fähigkeit von CSCs beeinflussen zu vermehren, wandern oder eindringen. Die Nische ist eine Verankerungsstelle für CSCs und Adhäsionsmoleküle oder Mikroumgebungs lösliche Moleküle, wie Wachstumsfaktoren und Zytokine, kann wesentlich zur refractoriness zur Therapie beitragen. Obwohl die Hemmung der SHH Weg durch Cyclopamin oder 5E1 eine nützliche Strategie sein würde, in unserer Studie haben wir gezeigt, dass Rezeptorkomponente Ptch und Transkriptionsfaktor Gli1 wurden hoch auch in tumorsphere Zellen exprimiert wird. So Ptch oder Gli1 könnte ein alternatives Ziel für die Behandlung von Magenkrebs. Eine mögliche Strategie ist small interfering RNA (siRNA) oder shRNA spezifisch für Ptch oder Gli1, aber Magen CSLCs in tumorsphere Zellen zu verwenden, die nicht vollständig gereinigt worden, wir müssen weiter die Magen CSLCs reinigen, so wird diese Arbeit in unserem weiter getan werden Studie.

Abschließend haben wir gezeigt, dass SHH Weg in die Selbsterneuerung, Proliferation, Medikamentenresistenz und tumorigenen von tumorsphere Zellen beteiligt sein könnten und legen nahe, dass bei der Hemmung der SHH Wege eine rationale Therapieansatz darstellen Ziel gerichtet Strategien Magen-CSCs.

Materialien und Methoden

Tierethikerklärung

Männliche athymische Nacktmäuse (nu /nu), 6 bis 8 Wochen alt, wurden von Peking Vital-Fluss erhalten Lab Tier Technology Co. Ltd (SCXK JING 2007-0001) und wurden unter keimfreien Bedingungen in der Barrieretieranlage untergebracht. Alle Mäuse wurden unter genehmigten Richtlinien für Labortierzentrum der Akademie der Military Medical Sciences (SYXK Juni 2002-001) durchgeführt.

Kultur von adhärenten Zellen, tumorspheres und Unter tumorspheres

Menschliche Magenkrebs Zelllinien (HGC-27, MGC-803 und MKN-45) von Peking Union Medical College erhalten wurde, in 1640-Medium kultiviert, das 10% fötales Rinderserum (FBS) enthält, und bei der Dichte von 1 × 10 ^{6 lebenden Zellen ausplattiert pro 75-cm 2 Kolben. Wenn die Zellen befestigt sind, wir sie auf Konfluenz passagiert. Tumorspheres wurden hergestellt, indem die anhaftenden Zellen in serumfreiem 1640-Kulturmedium mit 1% N-2 Supplement (Invitrogen), 2% B-27 Supplement (Invitrogen), 1% Antibiotikumgemisch (Gibco), 20 ng /ml humanem FGF abgeleitet -2 (Chemicon) und 100 ng /ml EGF (Chemicon), und die anhaftenden Zellen wurden in 24-Well-Ultra-Low-Befestigungsplatte (Corning) bei 500 Zellen pro Vertiefung plattiert. 2 Wochen später wurden die Platten für tumorspheres Bildung analysiert und wurden mit einem inversen Mikroskop (Olympus) bei 40 × und 100-facher Vergrößerung quantifiziert.}

Nach der primären tumorspheres die Größe von etwa 200 bis 500 Zellen pro Kugel erreicht, die tumorspheres wurden in einer Dichte von 1000 Zellen pro Milliliter und 100 ul Einzelzellsuspension wurde in jede Vertiefung der 24-Well ultraniedrigen Befestigungsplatte (Corning) in serumfreiem Medium oben beschrieben beimpft dissoziiert. Jede Vertiefung wurde für einzelne Zelle untersucht, und nur die Vertiefungen, die einzelne Zelle enthielten, wurden markiert. 2 Wochen später wurden die Vertiefungen für die Unter tumorspheres Bildung analysiert. Normale anhaftenden Zellen wurden als Kontrolle für die Fähigkeit zur Bildung Unter tumorspheres verwendet. Um die Verbindung zwischen SHH Weg zu testen und die Bildung von Unter tumorspheres behandelten wir die dissoziierten Zellen mit Cyclopamin (2,5 uM, 5 uM, 10 uM) oder Steuer Tomatidin, 5E1 (10 ug /ml) oder Kontrolle PBS und beobachtet die Bildung Unter tumorspheres.

Magenkrebs Gewebeprobe

die menschlichen frisch, sterile Proben Magenkrebsgewebe wurden in Übereinstimmung mit den ethischen Normen des institutionellen Ausschusses für Humanexperiment von 15 Patienten (Alter Bereich 70-85 Jahre) eine Magenkrebs Resektion, nach Einverständniserklärung der Patienten (Tabelle S3) zu erhalten.

Dann Kontamination zu vermeiden, wurden die Proben in 95% Ethanol für 2-3 sec eingetaucht und gewaschen mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) und Antibiotika mehrmals um das Blut zu entfernen. Nach diesen wurde die Oberfläche der Krebsgewebeproben entnommen und die inneren Teile wurden in 1-3 mm geschnitten ^{3 große Stücke. Dann wurden sie in Kollagenase und Dispase-Lösung bei 37 ° C verdaut, nach 4 h Inkubation wird die Lösung, die die verdaute Gewebe enthielt, wurde zentrifugiert, um die Kollagenase-Lösung zu entfernen. Das Zellpellet wurde einmal mit 1640-Medium gewaschen, bevor sie in serumfreiem 1640-Medium, enthaltend 1% N-2 Supplement, 2% B-27 Supplement, 1% antibiotische Mischung, 20 ng /ml humanem FGF-2, 100 ng aufgehängt ist /ml EGF und in 24-Well-Ultra-Low-Befestigungsplatte plattiert. Alle Kulturen wurden bei 37 ° C in Inkubatoren mit angefeuchteter Luft und 5% CO _2.}

Anchorage unabhängigen Wachstumstest

Für die Beobachtung der sich selbst erneuernden Kapazität weiter, weich geliefert inkubiert Agar-Assay wurde verwendet, um die Bildung von Kolonien tumorsphere Zellen und adhärente Zellen unter verankerungsunabhängigen Bedingungen zu bestimmen. Jedes Well einer Sechs-Well-Platte wurde mit 1 ml 10% FBS-1640-Medium mit 1% Agarose beschichtet. Nach 20 min Inkubation bei 37 ° C, zu gleichen Teilen (500) von tumorsphere Zellen oder anhaftende Zellen wurden in 1 ml 10% FBS-1640-Medium mit 0,5% Agarose zugesetzt. Um die Verbindung zwischen SHH Weg zu testen und die Kolonien Bildung unter verankerungsunabhängigen Bedingungen behandelten wir die dissoziierten Zellen mit Cyclopamin (2,5 uM, 5 uM, 10 uM) oder Steuer Tomatidin, 5E1 (10 ug /ml) oder PBS steuern.

• PLoS ONE: Wnt /β-Catenin Signaling Verstärkt Cyclooxygenase-2 (COX-2) Transkriptionsaktivität in Magenkrebszellen
• PLoS ONE: A Computational Methode zur Vorhersage von Excretory Proteine ​​und Anwendung auf die Identifizierung von Magenkrebs-Marker im Urin