PLoS ONE: Hemming av JAK2 /STAT3 Pathway Reduserer Gastric Cancer Growth in vitro og in vivo

Abstract

Signal Svinger og Activator av transkripsjon-3 (STAT3) er konstitutivt aktivert i mange kreftformer hvor det fremmer vekst, betennelse, angiogenese og hemmer apoptose. Vi har vist at STAT3 er konstitutivt aktivert i human magekreft, og at kronisk IL-11-drevet STAT3 transkripsjonen aktivitet induserer gastrisk tumorgenesen i gp130 ^{757FF musemodell av magekreftutvikling. Her viser vi at behandling av menneskelige AGS mage kreftceller med Janus kinase (JAK) inhibitor WP1066 dose- og tidsavhengig hemmer STAT3 fosforylering, sammen med redusert JAK2 fosforylering, redusert spredning og økt apoptose. I tillegg er anvendelse av intraperitoneal WP1066 i 2 uker, redusert gastrisk tumorvolumet med 50% i gp130 757FF mus som faller sammen med redusert JAK2 og STAT3 aktivering sammenlignet med vehikkelbehandlede, littermate kontroller. Gastriske svulster fra WP1066- behandlede mus hadde redusert polymorfonukleære inflammasjon, som faller sammen med inhibering av en rekke proinflammatoriske cytokiner, inkludert IL-11, IL-6 og IL-1β, så vel som vekstfaktorer Reg1 og amfiregulin. Disse resultater viser at WP1066 kan blokkere proliferasjon, redusere betennelse og indusere apoptose i mage-tumorceller ved å hemme STAT3 fosforylering, og at mange cytokiner og vekstfaktorer som fremmer gastrisk tumorvekst er regulert av STAT3-avhengige mekanismer. WP1066 kan danne grunnlag for fremtidige behandlingsformer mot magekreft}

Citation. Judd LM, Menheniott TR, Ling H, Jackson CB, Howlett M, Kalantzis A, et al. (2014) Hemming av JAK2 /STAT3 Pathway Reduserer Gastric Cancer Vekst In Vitro Hotell og In Vivo
. PLoS ONE 9 (5): e95993. doi: 10,1371 /journal.pone.0095993

Redaktør: Rupesh Chaturvedi, Vanderbilt University School of Medicine, USA

mottatt: 21 januar 2014; Godkjent: 01.04.2014; Publisert: 07.05.2014

Copyright: © 2014 Judd et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Dette prosjektet ble støttet av midler fra; NHMRC Australia (www.nhmrc.gov.au) prosjektstøtteǽ165 NIH /NCI USA (nih.gov; www.cancer.gov) melanom SPORE P50 CA093459-06, NIH /NCI USA (nih.gov; www.cancer. gov) hjernen SPORE 2 P50 CA127001-06. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Waldemar Priebe holder patenter og har en økonomisk interesse i utviklingen av sammensatte WP1066 som følger; W.Priebe, N.Donato, M.Talpaz, S, Szymanski, I. Fokt, A. Levitzki Forbindelser for behandling av celleproliferative sykdommer. Forener States Patent WO /2005/058829 12/01/2004. Merk også at forfatterne har gitt en endret uttalelse av konkurrerende interesser vedrørende patent på WP1066 holdt av W. Priebe. Forfatterne erklærer også at "dette ikke endrer vår tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer".

Innledning

Av de sju Signal Svinger og Activator av transkripsjon (STAT) familiemedlemmer , STAT3 har vært mest konsekvent innblandet i en rekke vanlige kreftformer hos mennesker, inkludert; lunge, bryst, eggstokk, prostata og tykktarm [1], [2], [3], [4]. Dette gjelder også i human magekreft [5], [6], [7], hvor STAT3 aktivering av kronisk fosforylering på tyrosin (Y) bor 705 har vært knyttet til økt vekst, angiogenese, invasjon og metastasering av den primærcancer [ ,,,0],6], [7], [8]. Således kan inhibering av STAT3 transkripsjonen aktivitet i human magekreft tilveiebringe et mulig middel for å redusere høy sykelighet og forlenge livet blant magekreftpasienter over hele verden.

I fravær av funksjonelle mutasjoner i genet STAT3, aberrant STAT3 aktivitet er forårsaket av vedvarende aktivitet fra oppstrøms tyrosinkinaser, og /eller ved unscheduled- eller over-ekspresjon av stimulerende ligandene [9], [10], [11]. Dette er klart eksemplifisert i gp130 ^{757F /F musemodell av magekreftutvikling, hvori et Phe for Tyr substitusjon på 757 stilling på den intracellulære armen av IL-6-familien aliserte reseptor-gp130 samtidig forhindrer SHP2 og SOCS3 bindende , noe som resulterer i hemming av ras /MAP kinase signaloverføring, og hyperaktiveringen av STAT3 av konstituerende fosforylering [23], [24], [26]. Nylig har vi og andre har vist at det i mage tumorer, signifikant økning i transkripsjon sammenfallende med økt ekspresjon av gp130 ligand IL-11 i humane magekreft og musemodeller av denne sykdommen [5], [12], [13]. I det sistnevnte IL-6 er unnværlig, men IL-11 er absolutt nødvendig for tumorgenesen [12], [13]. I tillegg har IL-11 /STAT3 blitt vist å være en viktig drivkraft for atrofisk gastritt, den første forstadier lesjon av magen etter kronisk infeksjon av bakterien Helicobacter pylori product: [14].}

hittil har en rekke kinaser blitt rapportert å indusere STAT3 aktivitet følgende ligand /reseptor-binding, men bare JAK1 og JAK2 står for STAT3 fosforylering ved dokking med IL-11 /gp130-reseptor-komplekset [15] og av disse er IL-11 /gp130 preferensielt binder JAK2 [16]. Disse observasjoner tyder på at JAK2 og STAT3 liggende lovende mål for utforming av terapeutiske antagonister for å undertrykke IL-11 /STAT3 signalering i human magekreft.

Nylig den koffein syrederivat WP1066, strukturelt beslektet med lav potens tyrosinkinaseinhibitor AG490 , har vist seg å være en meget potent hemmer av JAK2 /STAT3 veien i transform hjerne glioma [17] og renal karsinom [18]-cellelinjer, som fører til vekst inhibering og induksjon av klassiske pro-apoptotiske reaksjonsveier. I tillegg er WP1066 effektiv in vivo
mot svært maligne melanomer og leukemier som er positive for den JAK2-V617F + mutasjon, som fremmer konstitutive JAK2 kinase-aktivering [19], [20], [21], [22 ]. Upubliserte studier indikerer at WP1066 er ikke en ATP-kompetitiv hemmer, og kan blokkere uttrykk for fosforylert JAK2 og STAT3; i tillegg kan p-STAT3-Y705 inhiberes uavhengig av JAK2 status. Dermed presenterer WP1066 en unik mulighet til å hemme både p-JAK og p-STAT3, og deretter sterkt blokkerer JAK2 /STAT3 signalveien og STAT3 transkripsjonen aktivitet.

For å teste ideen om dual blokade av JAK2 og STAT3 aktivering i magen og påfølgende magekreft utvikling, har vi brukt både in vitro Hotell og in vivo
tilnærminger for å vurdere om WP1066 kan redusere eller blokkere gastrisk tumorvekst gjennom hemming av JAK2 /STAT3 aktivitet, og andre nær beslektede onkogene signaliseringsreaksjonsveier. Her viser vi at WP1066 hemmer effektivt STAT3 fosforylering, og induserer apoptose i en magekreft cellelinje, og at det kan hemme gastrisk tumorvekst in vivo
ved å blokkere induksjonen av nøkkel STAT3-regulerte gener.

Materialer og metoder

Utarbeidelse og oppbevaring av kinase hemmere

Inhibitor WP1066 ble utviklet og syntetisert av Waldemar Priebe og kolleger ved University of Texas MD Anderson Cancer Center, og nåværende lager ble levert høflighet Houston Pharmaceuticals Inc, Houston, Texas, USA. Stocks ble resuspendert i Hybri-Max DMSO og lagret ved -20 ° C. Aksjer var engangsbruk, og ikke fryses etter tining.

In vitro Kultur

AGS celler (ATCC, Manassas, VA, USA) celler ble opprettholdt i et fullstendig medier som inneholder RPMI + Glutamax ( Gibco Life Sciences, Invitrogen OR, USA) media supplert med 10% føtalt bovint serum, 50 IE penicillin ved 37 ° C i 5% CO _{2-95% luft.}

Western Blotting

protein ekstrakter ble utarbeidet med enten TRIzol reagens (Life Technologies, Vic, Australia) i henhold til produsentens instruksjoner og protein pellets ble resuspendert i 1% natriumdodecylsulfat inneholder 2 mmol /l Na _{3VO 4 eller RIPA buffer. Aliquoter (30 ug) ble underkastet natriumdodecylsulfat /polyacrylamidgelelektroforese. Membranene ble blokkert og inkubert ved 4 ° C over natten i skummet melk med følgende antistoffer; STAT3, py (705) STAT3, ERK1 /2, Pt (202), Y (204) ERK1 /2, AKT, PS (473) AKT, JAK2, py (1007), Y (1008) JAK2 (Cell signalering,Α2,Α4S,Α1,Ύ2Ƶ7,Ο2,ƕ8,ŷ2,ŷ1,ł9,Ź1), GAPDH (Abcamδ5). Membraner ble inkubert med peroksyd-konjugert sekundært antistoff (Dako, polyklonalt svin anti kanin HRP-konjugert, # P0399) og visualisert ved forsterket kjemiluminescens (Amersham, Buckinghamshire, UK). For analyse bånd ble kvantifisert ved hjelp av Mengde En programvaresystem (Biorad) og fosforylerte proteiner uttrykt som en andel av GAPDH fra et duplikat membran. Minst n = 8 prøver ble vurdert av enten behandling.}

Cell Counting av Haemocytometry

Celler ble sådd på 5 × 10 ^{4 celler /ml i 24-brønners format i fullstendig media og tillatt å vokse uforstyrret i 24 timer. Celler ble behandlet med en passende konsentrasjon av WP1066 eller DMSO som kontroll for 0-360 min. Etter behandling ble cellene løsnet ved behandling med trypsin-EDTA 0,25% (Sigma), farget med trypan-blått 0,4% (Sigma) ved en 1:01 fortynning i 5 minutter ved 4 ° C, og regnet på et hemocytometer.}

karboksyfluorescens diacetat succinimidylester (CFSE) Farging

Hvis du vil merke AGS celler med CFSE ble cellene løsner ved behandling med trypsin-EDTA 0,25% (Sigma) og resuspendert i forvarmet PBS /0,1% BSA i en tetthet av 1 × 10 ^{6 celler /ml. 10 mM CFSE fargestoff (Invitrogen) ble fremstilt i henhold til produsentens protokoll, deretter 5 ul /ml ble tilsatt og blandet grundig ved å snu opp for å sikre ensartet merking av celler. Prøvene ble inkubert ved 37 ° C i 10 minutter, reaksjonen ble stanset ved tilsetning av 5 volumdeler iskald media og inkubert i 5 minutter på is. Prøvene ble deretter vasket 5 ganger i media og belagt på 2 × 10 5 celler /brønn (6-brønns retter). En prøve av celler ble tatt etter utplating og merket med 100 ug /ml propidiumjodid (PI) og analysert ved strømningscytometri for ensartethet og intensiteten av merking. Cellene ble deretter dyrket i komplett medium i 48 timer hvoretter de ble behandlet med eller uten passende WP1066 (5 pM) ved 37 ° C med 5% CO _{2 95% luft i 18 timer. Cellene ble deretter trypsinisert som ovenfor og resuspendert i fullstendig medium, som er merket med 100 ug /ml PI, og analysert ved hjelp av strømningscytometri ved 488 ηM. Data ble registrert ved hjelp av BD FACS diva (BD Biosiences) programvarepakken og analysert av Modfit LT programvarepakke (VSH).}}

Annexin V Farging

AGS celler ble dyrket i fullstendig media på 2 × 10 ^{5-celler /brønn på 6-brønners plater med DMSO (bærerkontroll), eller WP1066 (5 uM), eller etoposid (200 uM, positiv kontroll) ved 37 ° C med 5% CO _{2 95% luft uforstyrret i 24 timer. Cellene ble deretter behandlet som følger; vasket i iskald PBS, trypsinisert som ovenfor, og celletettheten bestemt ved haemocytometry før resuspensjon i Annexin bindingsbuffer til 1 x 10 6 celler /ml. 100 ul av dette preparat ble tatt og inkubert med 5 ul av komponent A (Annexin Fluor 488 annexin-V-komponenten, 25 mM HEPES, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4, 0,1% bovint serumalbumin) og 1 pg /ml av PI i 15 minutter ved romtemperatur i mørke. Prøvene ble deretter blandet med 400 ul av Annexin bindingsbuffer og analysert ved strømningscytometri. Hensiktsmessige kontroller +/- reaksjonskomponentene var forberedt på å justere for skjevheter i gating. Data ble registrert ved hjelp av BD FACS diva (BD Biosiences) programvarepakken.}}

Etikk erklæringen

Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med den australske Kode for omsorg og bruk av dyr til vitenskapelige formål (7 ^{th edition), og etter godkjenning fra Murdoch Child Research Institute dyreetikk komité (søknad # A583). Alle forsøk ble gjennomført for å redusere ubehag i disse minimalt invasive prosedyrer.}

In vivo
Eksperimenter

gp130 ^{757F /F mus har blitt beskrevet tidligere [23]. Kort, diskrete antrum svulster utvikle ved 4 ukers alder og vokser raskt til ca 12 uker. De rekapitulere de utviklingstrekk i intestinal-type adenokarsinom i ventrikkel, inkludert submucosal invasjon, men ikke metastasise [24]. Dyrene ble plassert i en SPF-anlegget på Murdoch Barn Research Institute og bekreftet å være fri for Helicobacter pylori
. Tre grupper av mus ble vurdert for tumor utvikling: 1) 8 uke gammel gp130 757F /F mus som fikk ingen behandling (n = 10); 2) gp130 757F /F-mus som mottok WP1066 fra 8 til 10 uker gamle (n = 10); og 3) gp130 757F /F-mus som mottok DMSO kjøretøy fra 8 til 10 uker gamle (n = 8). Før eksperimentering alle dyr ble vurdert for velvære, veid og behandlingsvolum beregnet deretter. Kontrolldyr fikk tilsvarende volum av DMSO kjøretøy til WP1066-behandlede dyr. Mus mottok 2 initiale intra-peritoneal injeksjon av WP1066 ved 10 mg /kg hver 48 timer for å akklimatisere dem til effekten av behandlingen, og deretter mottok 5 injeksjoner av WP1066 ved 20 mg /kg hver 48. time for å fullføre to ukers diett. Intra-peritoneal injeksjonssteder ble vekslet gjennom fire kvadrantene i magen av mus. Ved avslutningen av forsøket, ble musene avlivet, og magene resected for fotografering og vev samling.}

Makroskopisk og Histologisk Assessment

magene var raskt dissekert langs mindre kurvatur, låste ut, fotografert og fiksert i 4% bufret paraformaldehyde før behandlingen. Parafinsnitt (4 mikrometer) ble farget med hematoksylin og eosin (H & E). Morfometrisk analyse ble utført ved hjelp av open-source ImageJ programvare (http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html). For arealmålinger, ble bilder av mageslimhinnen manuelt skissert med programvaren tegneverktøy og kvantifisering program som brukes til å generere målinger

In vivo
Immunohistochemistry &.; Kvantifisering

Immunhistokjemisk analyse ble utført med antistoffer for Ki-67 (PharmingenȦ609) og aktivert caspase 3 (Cell Signal TechnologyϤ1). Antigen gjenfinning ble utført ved å koke seksjoner i 30 minutter i 10 mM sitronsyre (pH 6,0). Farging ble gjennomført med passende artsspesifikke biotinylerte sekundære antistoff (DAKO, Danmark), og avidin biotinylert pepperrotperoksydase makromolekylære kompleks (Vector Laboratories, Burlingame, CA), 3,3'-diaminobenzidin (Sigma, St. Louis, MI) og motfarget med hematoxylin. For Ki-67 kvantifisering, en blindet observatør telles antall fargede celler per kjertel i flere deler per dyr ved hjelp ImageJ som før. Data ble uttrykt som antall Ki-67 positive celler per kjertel. For aktivert caspase 3 kvantifisering, en blindet observatør telles antall fargede celler per område av slimhinnen i 4 tilfeldige områder med godt orientert antrum per dyr ved hjelp ImageJ som før. Data ble uttrykt som antall aktiverte caspase 3 positive celler per område av slimhinnen

Semi-kvantitativ Morfometrisk Analyse av Betennelse

Betennelse ble vurdert ved hjelp av mikroskopi blindt på H &. E-farget seksjoner. Antrum tumorvev ble analysert og minst 3 strimler pr dyr (n = 7) ble gitt en semi-kvantitativ stillingen i henhold til graden av inflammatoriske celler fra minimum til maksimum = 0 = 3. Lymphoplasmocytic og polymorfonukleære infiltrat ble vurdert hver for seg. De gjennomsnittlige verdiene ble så sammenlignet for statistisk analyse.

Real-Time (Q) -PCR Analyse

RNA ble ekstrahert med TRIzol reagens (Life Technologies, VIC, Australia) i henhold til produsentens instruksjoner. Total RNA (3 ug) ble reverstranskribert inn i cDNA ved anvendelse av Moloney murin leukemivirus revers transkriptase (Promega, Madison, WI) primet med 0,3 pg oligo (dT). Q-PCR primere ble utformet ved hjelp PRIMER EXPRESS (Applied Biosystems) (tabell 1). SYBR grønn kjemi (Applied Biosystems) ble anvendt sammen med L32 som normaliserings. PCR-betingelsene var 95 ° C i 10 min, deretter 40 sykluser med 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 15 sekunder; Reaksjonene ble kjørt på en Applied Biosystems AB7500 RT PCR maskin. Resultatene ble analysert ved hjelp av sekvensdetektoren programvare, og relative ganger forskjellen ble bestemt ved anvendelse av ΔΔCt metode som er beskrevet av produsenten.

Statistical Analysis

Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnittet . Verdier oppnådd fra kvantitativ analyse av genekspresjon eller antallet fargede celler ble sammenlignet mellom prøvene ved ANOVA, og hvor en statistisk signifikant forskjell ble funnet enkeltgrupper ble videre analysert med den passende parametriske og ikke-parametrisk statistikken ved hjelp av Sigmastat statistisk pakke. Statistisk signifikans ble definert som p≤0.05.

Resultater

WP1066 Raskt Undertrykker Fosforylert Y (705) STAT3 og induserer fosforylering av ERK1 /2 i AGS Cells

JAK- STAT svei og den ERK1 /2 pathway er de to store signaltransduksjonsveier nedstrøms av gp130. Disse to banene har gjensidige og inverse regulerende virkninger på hverandre, best demonstreres ved den negative regulering av pSTAT3 etter ERK1 /2-aktivering [47].

WP1066 dose-respons-eksperimenter ble utført ved behandling av AGS-celler med 0- , 1, 2 eller 5 uM WP1066 i 60 min og måling av fosforylering av JAK2, STAT3, ERK1 /2 og SHP-2. Som ventet ble pJAK2 sterkt hemmet av WP1066 ved alle konsentrasjoner testet og ved > 80% ved 5 mikrometer. 5 uM WP1066 også ga maksimal inhibering av pSTAT3 og gjensidig aktivering av pErk1 /2 (Fig. 1A) med en reduksjon i total STAT3 ved 5 uM eller høyere konsentrasjoner (data ikke vist). Sammenfallende med økningen i Perk, pSHP2 aktivisering var doseavhengig forbedret etter WP1066 administrasjon (Fig. 1a).

For tidskurs studier AGS celler ble behandlet for 0-360 min med fem mikrometer WP1066 og fosforylering av JAK2, STAT3, ERK1 /2 og SHP-2 ble analysert ved Western blotting (fig. 1B). WP1066 behandling resulterte i en rask hemming av pJAK2, med et fall 75% etter 30 minutter og et maksimum 90% fall etter 60 min. Deretter ble cellene utvinnes og tilbakeføres til basal fosforylering av JAK2 360 min. Mønsteret for redusert STAT3 aktivering avspeilet den av JAK2 fosforylering. I motsetning til dette ble ERK1 /2 fosforylering markert økt respons på WP1066 behandling, med en 250% økning etter 15 min, og en maksimal 460% økning etter 60 min, før retur til basalnivåer av 360 min. SHP2 aktivering tett fulgt endringene i ERK uttrykk med maksimal induksjon ved 60 min.

WP1066 hemmer AGS Vekst gjennom bekjempelse av spredning og induksjon av apoptose

Aktivert STAT3 er en etablert driver av menneskelig magekreftcelle vekst og proliferasjon [5], og langvarig aktivering av ERK1 /2 induserer apoptose av gastriske epitel-celler [25]. Etter å ha vist at WP1066 regulerer STAT3 og ERK1 /2 signalisering i en gjensidig måte, testet vi hvorvidt det kan også forstyrre cellevekst og induserer apoptose av AGS celler.

Behandling av AGS celler med fem mikrometer WP1066 (Fig. 2A ) resulterte i en betydelig reduksjon i celletallet i forhold til DMSO kontroller (DMSO, 100% ± 3,14 vs. WP1066, 36,02% ± 3,18, p < 0,05). For å bestemme om denne reduksjon i celletallet var på grunn av endret celleproliferasjon eller apoptose, eller en kombinasjon av begge deler, ble CFSE og Annexin V-farging utført på behandlede celler. AGS celler behandlet med WP1066 ble mer intenst merket med CFSE enn de som ble behandlet med DMSO, viser redusert antall celledelinger og dermed spredning (Fig. 2B). I tillegg, ble en større andel av AGS celler behandlet med WP1066 merket med Annexin V (figur 2C) sammenlignet med celler behandlet med DMSO, noe som viser at den WP1066 også indusert apoptose i AGS celler (WP1066; 1,3 gangers økning; p = 0,049).

WP1066 Blocks gastric tumor Vekst i gp130 ^{757FF mus ved bekjempelse av tumor Cell Proliferation og Forbedring av apoptose}

gp130 ^{757FF mus utvikler distale mage svulster preget av forhøyet mage IL-11 STAT3 drevet aktiverings [12], [13]. Siden pJAK2 og p-STAT3 er blokkert av WP1066 in vitro
, testet vi om WP1066 vil også blokkere mage svulst utvikling in vivo
. Behandling av gp130 757FF mus 3 ganger per uke for 2 uker med 10-20 mg /kg WP1066 betydelig redusert magetumorvekst med 47% fra 42.11 ± 3.21 mm 2 til 22.36 ± 3.64 mm 2 ( p. < 0,05) (figur 3A-D). DMSO behandlede tumorer var ikke annerledes til svulster hos 8 uker gamle mus, ved hvilken alder WP1066 behandling startet, bekrefter at gastrisk tumorvekst er relativt stabil fra 8-10 uker [27], og at WP1066 behandling faktisk forårsaker svulst regresjon i stedet stasis (fig. 3A-D).}

For å finne ut om spredning ble endret i mage svulster, Ki-67 positive celler /kjertelen ble kvantifisert i det behandlede kohort. WP1066 behandling signifikant redusert gastrisk epitelcelleproliferasjon (DMSO 62 ± 7,7 vs. WP1066 41,6 ± 6,5 Ki-67 fargede celler /kjertel, s < 0,05, Fig. 3E-G), som viser at WP1066 kan hemme tumorvekst ved inhibering av celleproliferasjon. For å vurdere virkningene av WP1066 for tumorcelle-apoptose, ble seksjoner fra den WP1066 eller DMSO-behandlede kullene farget med et antistoff mot spaltede kaspase 3, en markør for celledød ved apoptose (Fig. 3 H, I). Det var betydelig mer apoptotiske profiler i WP1066-behandlede svulster enn kontrollene, viser en klar pro-apoptotisk effekt av WP1066 (WP1066 25,25 ± 5,32 vs DMSO 2,65 ± 0,76 fargede celler /mm ^{2 slimhinner, p < 0,05, Fig. 3J ).}

WP1066 er spesielt rettet mot JAK2 og STAT3 Fosforylering skal utelates Gastric tumorgenesen i gp130 ^{757FF mus}

Fordi gp130 ^{757FF mus utvikler svulster i respons til konstitutiv gp130 aktivering [20] , testet vi om WP1066 undertrykket nedstrøms signalveier in vivo.
WP1066 behandling i 2 uker resulterte i en reduksjon på 25% i den relative mengde av totale STAT3 i antral slimhinnen sammenlignet med DMSO behandlede grupper (fig. 4A) . Den totale mengde av JAK2, AKT og ERK1 /2 ble ikke endret ved WP1066 behandling. Dette tyder på at kronisk behandling av gp130 757FF mus med WP1066 undertrykker ekspresjon av STAT3.}

Immunoblot-analyse av signaleringsaktivering viser en signifikant reduksjon i pJAK2 (80,12% ± 5,70 for DMSO-kontroll), pY705 STAT3 (26,84 % ± 7,2 DMSO kontroll, fig. 4B) og pErk1 /2 (72,66% ± 5.23.of DMSO kontroll, fig. 4B). AKT-fosforylering ble ikke endret ved WP1066 behandling. Redusert aktivering av JAK2 og STAT3 er i samsvar med in vitro
data og kjente effektene av WP1066.

WP1066 Trykt inflammatorisk respons i Antral slimhinnene i gp130 757FF Mus

Siden en kronisk inflammatorisk reaksjon i magen er avgjørende for tumorutvikling [27], testet vi om en del av den virkemåte av WP1066 er å undertrykke den STAT3-mediert betennelsesreaksjon, som normalt bidrar til tumorprogresjon. Histologisk analyse viste at polymorfonukleære infiltrering inn i antrum av WP1066 behandlede mus var betydelig mindre enn i kontrollmusene (figur 5A;. DMSO 2.45 ± 0.24 vs WP1066 1,46 ± 0,22, p 0,05), mens lymphoplasmocytic infiltrat var ikke forskjellig mellom de to grupper (fig. 5B; DMSO 1,73 ± 0,16 vs WP1066 1,32 ± 0,20, p > 0,05).

Siden mage betennelse er vanligvis formidlet av et lite antall viktige proinflammatoriske cytokiner og enzymer, målte vi uttrykket av en utvalgt gruppe av disse ved Q-PCR i DMSO og WP1066-behandlede mager. Ekspresjon av alle proinflammatoriske mediatorer med unntak av IFNy, TNFa og iNOS ble signifikant hemmet av WP1066 behandling som følger; IL-6 (Fig. 5C, 6,0 ± 2,6 ganger), IL-11 (Fig 5D,. 8,7 ± 3,4 ganger), IL-1α (Fig 5E,. 10.9 ± 4.3) fold), IL-1β (Fig 5F.; 3 ± 0,9 ganger) og COX2 (fig 5G,. 2,94 ± 1,05). Derfor WP1066 inhibering av STAT3 aktivitet og tumorprogresjon var delvis på grunn av redusert polymophonuclear infiltrering og redusert STAT3 avhengig transkripsjon av pro-inflammatoriske IL-6, IL-11, IL-1a, IL-1 p og COX2 gener.

WP1066 hemmet uttrykk av amfiregulin i Antral slimhinnene i gp130 ^{757FF Mus}

effekten av WP1066 behandling på uttrykk for vekstfaktor ligander er kjent for å spille en rolle i vekst og differensiering av magen og i utviklingen av gp130 ^{757FF svulster ble også vurdert. WP1066 hemmet ekspresjon av amfiregulin (1,85 ± 0,60 fold, p 0,05), men ikke HB-EGF (Fig. 6) i antral slimhinnen hos behandlede mus. I tillegg magen proliferative ligand og STAT3-regulert gen Reg1 viste en sterk inhibitorisk trend etter WP1066 behandling sammenlignet med DMSO kontroll antrum (figur 6;. P = 0,069).}

diskusjon

i denne studien viser vi at WP1066 doseavhengig hemming av JAK2 /STAT3 signalveien i humane magekreft (AGS) celler, med en derav følgende 60% reduksjon i celleformering, og en mindre økning i apoptose. Mekanismen for dette er sannsynligvis på grunn av den dual inhibering av fosforylerte former av JAK2 og STAT3 derved redusere STAT3 transkripsjonen aktivitet, som har blitt vist i flere kreftcellelinjer inkludert gliom [17], [28], [29], myeloid leukemi [ ,,,0],30], og føflekkreft [20]. På den annen side, WP1066 anvendelse resulterte i en tilsvarende økning av ERK1 /2 aktivisering sammenfallende med øket pSHP2, fosfatasen er ansvarlig for aktivering av ras /MAP kinase signalveien. En lignende observasjon med hensyn til ERK-aktivering har blitt gjort for andre cancercellelinjer avledet fra nyrekarsinom [18], og gliom [28]. Derfor, på tvers av regulering av STAT3 og ERK-mediert signalisering på nedstrømssiden av IL-6-familien cytokiner synes å forekomme ofte i noen områder av vev og cellelinjer [31].

WP1066 var også effektiv når det gis in vivo
, hvor det blokkerte STAT3 aktivering (75%) i gp130 ^{757FF mus antrum tumorer, og også redusert total STAT3 protein, noe som tyder på at det kan redusere ekspresjonen av Stat3
genet i mager av behandlede mus. Dette støttes av eksistensen av konsensus nettsteder for aktivert STAT3 bindende for Stat3
promoter, med aktivering av Stat3
genet som demonstrert ved hjelp av mutant Stat3
promoter-reporter konstruerer og EMSA [48] eller brikke-seq [49], og antyder at WP1066 kan hemme autokrin aktivering av STAT3 etter hemming av JAK2 /STAT3 fosforylering.}

som forventet, pJAK2 nivåer ble også redusert i nærvær av WP1066 i magen. I motsetning til effekten av WP1066 in vitro,
ERK1 /2-aktivering i magen på WP1066 behandlede mus var svakt redusert. Grunnen til denne forskjellen kan være todelt; for det første, in vivo
eksponering for WP1066 ble kronisk forhold til akutt eksponering in vitro
; for det andre, eksponering in vivo
er mer komplisert med flere potensielle signalveier som benytter felles signal transduksjon molekyler. Likevel redusert aktivering av JAK2 og STAT3 er i tråd med den etablerte rollen disse cytokin /vekstfaktor signaliserer komponenter i magekreft progresjon [5], [27] og viser at in vivo, etter og da isolert fra effekten av H.pylori
infeksjon, er det overveiende endret aktivering av STAT3, og ikke ERK1 /2 som er avgjørende for tumorutvikling.

Sammenfallende med inhibering av STAT3 aktivitet, anvendelse av WP1066 i bare 2 uker in vivo
resulterte i en 50% reduksjon i tumorområdet ledsaget av en tilsvarende reduksjon i proliferasjon målt ved hjelp av Ki-67-farging, og en samtidig økning i tumorcelle-apoptose målt ved hjelp av aktivert kaspase 3 farging. Denne hemning av tumorvekst Parallelt med a > 40% reduksjon i polymorfonukleære celletall, og den opp-regulering av tilhørende pro-inflammatoriske cytokiner, inkludert IL-1α, IL-1, så vel som COX2, som alle fremme gastrisk tumorgenesen. Derimot WP1066 hadde ingen effekt på IFNy, TNFa, og iNOS uttrykk i samsvar med mangel på reduksjonen i lymfocytter og makrofager (lymphoplasmocytic infiltrasjons) over behandlings tidsforløpet. Inhiberingen av IL-1β etter pSTAT3 inhibering av WP1066 er spesielt viktig, fordi IL-1β er en viktig regulator av mavesyresekresjon, er en potent promoter av tumorvekst i en transgen musemodell av magekreft [33], og som en integrert del av NLRP3 inflammasome [32]. IL-11 er kjent for å være en endogen stimulator av antral IL-1β uttrykk via STAT3 [13], og vi har demonstrert her at IL-11 blir inhibert av WP1066. Siden IL-11 synes å være oppstrøms av IL-1β i magen, da dette er en plausibel svei for sistnevntes inhibering etter blokkade av STAT3 aktivering.

De inhiberende virkninger av WP1066 i gp130 ^{757FF musemodell av magekreft, rekapitulere og utvide resultatene av STAT3 haploinsufficiency generert genetisk i samme musemodellen [26], så vel som anvendelsen av systemiske antisense oligonukleotider mot STAT3 [12], noe som understreker viktigheten av aktivert STAT3 signale i å tilrettelegge mage tumorgenesen. Gitt viktigheten av IL-11 for å fremme tumor initiering og utvikling [12], [13], og IL-6 i å tilrettelegge lokal polymorfonukleære infiltrering [34] i gp130 757FF mus, er det betydningsfullt at WP1066 effektivt reduserte ekspresjonsnivåene av begge cytokiner sammenfallende med reversering av tumorvekst. Dette støtter det syn at STAT3 regulerer transkripsjonen av både IL-11 og IL-6, eventuelt drives av autokrin tilbakekoplingssløyfer, siden begge cytokiner fortrinnsvis utnytte STAT3 transkripsjon i magen [23].}

Reg1 er et vidt fordelt medlem av Reg genfamilien og for seg kjent gastrisk vekstfaktor, som spiller en fremtredende rolle som en proliferativ og anti-apoptotiske regulator i magen hos både mus [26], [35] og mennesker [36]. Vi har tidligere vist at Reg1 er sterkt indusert i antrum svulster i gp130 ^{757FF mus sammenfallende med IL-6 og IL-11 ekspresjon, og at haploinsufficiency av STAT3 resulterer i redusert ekspresjon av Reg1, noe som tyder på at det er en STAT3 regulert genet [26]. Dette har blitt bekreftet i gastriske cellelinjer hvor IL-11 [37] og IL-6 [36] stimulert fosforylering STAT3 som i sin tur aktiveres Reg1 transkripsjon. Vår nåværende data er i samsvar med disse resultatene, ved at WP1066 viser en sterk tendens til å hemme Reg1 i mage svulster i gp130 757FF mus sammen med IL-6 og IL-11-inhibering.}

• PLoS ONE: CD147 Expression i Human Gastric Cancer er assosiert med tumorresidiv og Prognosis
• PLoS ONE: En MAP3k1 SNP spår Survival of Gastric Cancer i en kinesisk Population