PLoS ONE: Remming van de JAK2 /STAT3 Pathway Vermindert maagkanker Groei In vitro en in vivo

Abstract

Signal Transducer en Activator van de transcriptie-3 (STAT3) wordt constitutief geactiveerde in vele vormen van kanker, waar het de groei, ontsteking, angiogenese stimuleert en remt apoptose. We hebben aangetoond dat STAT3 constitutief wordt geactiveerd menselijke maagkanker en dat chronische IL-11-driven STAT3 transcriptionele activiteit induceert maag tumorigenese in de gp130 ^{757FF muismodel van gastrische kanker. Hier laten we zien dat behandeling van menselijke AGS maagkanker cellen met de Janus Kinase (JAK) remmer WP1066 dosis- en tijdsafhankelijk remt STAT3 fosforylatie, samen met verminderde JAK2 fosforylatie verminderde proliferatie en verhoogde apoptose. Bovendien, de toepassing van intraperitoneale WP1066 gedurende 2 weken, verminderde maag tumorvolume met 50% in de gp130 757FF muis samenvalt met verminderde JAK2 en STAT3 activering vergeleken met met drager behandelde, nestgenoot controles. Maagtumoren van WP1066- behandelde muizen hadden polymorfonucleaire ontsteking, samenvalt met de remming van een groot aantal pro-inflammatoire cytokinen zoals IL-11, IL-6 en IL-1β, verminderd alsook de groeifactoren REG1 en amfireguline. Deze resultaten tonen dat WP1066 proliferatie kan blokkeren, ontsteking en induceren apoptose in gastrische tumorcellen door remming van STAT3 fosforylatie en dat vele cytokines en groeifactoren die de maag tumorgroei promoten geregeld door STAT3-afhankelijke mechanismen. WP1066 kan de basis vormen voor toekomstige therapieën tegen maagkanker vormen}

Visum:. Judd LM, Menheniott TR, Ling H, Jackson CB, Howlett M, Kalantzis A, et al. (2014) Remming van de JAK2 /STAT3 Pathway Vermindert maagkanker Groei In Vitro Kopen en In Vivo
. PLoS ONE 9 (5): e95993. doi: 10.1371 /journal.pone.0095993

Editor: Rupesh Chaturvedi, Vanderbilt University School of Medicine, de Verenigde Staten van Amerika

Ontvangen: 21 januari 2014; Aanvaard: 1 april 2014; Gepubliceerd: 7 mei 2014

Copyright: © 2014 Judd et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Dit project werd ondersteund door fondsen van; NHMRC Australië project (www.nhmrc.gov.au) subsidie ​​ǽ165 NIH /NCI USA (nih.gov; www.cancer.gov) melanoom SPORE P50 CA093459-06, NIH /NCI USA (nih.gov; www.cancer. gov) hersenen SPORE 2 P50 CA127001-06. De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:. Waldemar Priebe houden patenten en heeft een financieel belang in de ontwikkeling van de verbinding WP1066 als volgt; W.Priebe, N.Donato, M.Talpaz, S, Szymanski, I. Fokt, A. Levitzki verbindingen voor de behandeling van celproliferatieve ziekten. Verenigt States Patent WO /2005/058829 12/01/2004. Merk ook op dat de auteurs een gewijzigde verklaring van tegenstrijdige belangen met betrekking tot een patent op WP1066 gehouden door W. Priebe hebben verstrekt. De auteurs verklaren ook dat "dit niet onze naleving van PLOS niet wijzigt ONE beleid op het delen van gegevens en materialen".

Introductie

Van de zeven Signal Transducer en Activator van transcriptie (STAT) gezinsleden , STAT3 is meest consistent geïmpliceerd in een aantal veel voorkomende kankers bij mensen, waaronder; long, borst, eierstok, prostaat en colon [1], [2], [3], [4]. Dit geldt ook in menselijke maagkanker [5], [6], [7], waarin STAT3-activering door chronische fosforylatie bij tyrosine (Y) zijn gehuisvest 705 is gekoppeld aan verhoogde groei, angiogenese, invasie en metastase van de primaire kanker [ ,,,0],6], [7], [8]. Aldus kan remming van STAT3 transcriptionele activiteit in menselijke maagkanker een mogelijke manier om de hoge morbiditeit verschaffen en verlengt levensduur bij maagkanker patiënten wereldwijd.

Aangezien functionele mutaties in het gen STAT3, afwijkende activiteit STAT3 geïnduceerd door aanhoudende activiteit upstream tyrosinekinasen en /of unscheduled- of overexpressie van stimulerende liganden [9], [10], [11]. Dit wordt duidelijk geïllustreerd in de gp130 ^{757F /F muismodel van gastrische kankerontwikkeling, waarbij een Phe voor Tyr substitutie op de 757 positie op de intracellulaire arm van de IL-6 familie signalering receptor gp130 tegelijkertijd voorkomt SHP2 en SOCS3 binding leidt tot een remming van Ras /MAP kinase signaaltransductie en hyperactivation van STAT3 op constitutieve fosforylering [23], [24], [26]. Onlangs wij en anderen hebben aangetoond dat maagtumoren significante toename transcriptie samen met een verhoogde expressie van het gp130 ligand IL-11 in menselijke maagkanker en muismodellen van deze ziekte [5], [12], [13]. In de laatste IL-6 is overbodig, maar IL-11 absoluut nodig voor tumorgenese [12], [13]. Daarnaast is IL-11 /STAT3 aangetoond dat het een belangrijke aanjager van atrofische gastritis zijn, de eerste precancereuze laesie van de maag na chronische infectie met de bacterie Helicobacter pylori
[14].}

tot op heden zijn talrijke kinases gemeld aan STAT3 activiteit na ligand /receptor binding induceren echter alleen JAK1 en JAK2 vertegenwoordigen STAT3 fosforylatie na koppeling met IL-11 /gp130 receptorcomplex [15] en deze IL-11 /gp130 voorkeur bindt JAK2 [16]. Deze waarnemingen suggereren dat JAK2 en STAT3 aanwezig veelbelovende targets voor het ontwerpen van therapeutische antagonisten te onderdrukken IL-11 /STAT3 signalering in menselijke maagkanker.

Onlangs heeft de cafeïne zuur derivaat WP1066, structureel verwant aan de lage potentie tyrosine kinase inhibitor AG490 is aangetoond dat het een zeer krachtige remmer van JAK2 /STAT3 route in getransformeerde hersenen glioma [17] en renale carcinoma [18] cellijnen, wat leidt tot groeiremming en inductie van klassieke pro-apoptotische routes. Daarnaast WP1066 effectief In vivo
tegen zeer kwaadaardige melanomen en leukemie dat positief voor de JAK2-V617F + mutatie, die constitutieve JAK2 kinase-activering [19] bevordert zijn, [20], [21], [22 ]. Ongepubliceerde studies geven aan dat WP1066 geen ATP-competitieve remmer, en kan de expressie van gefosforyleerd JAK2 en STAT3 blokkeren; Bovendien kan p-STAT3-Y705 ongeacht het JAK2 status geremd. Zo WP1066 presenteert een unieke kans om zowel de p-JAK en p-STAT3 te remmen, en vervolgens krachtig te blokkeren JAK2 /STAT3 signaleringsroute en STAT3 transcriptionele activiteit.

Om het idee van de dubbele blokkade van JAK2 en STAT3 activering te testen in de maag en de daaropvolgende maag ontwikkeling van kanker, hebben we zowel gebruikt in vitro Kopen en in vivo
zal gaan beoordelen of WP1066 kunnen vertragen of blokkeren maag tumorgroei door remming van JAK2 /STAT3 activiteit, en andere nauw verwante oncogene signaalwegen. Hier laten we zien dat WP1066 remt effectief STAT3 fosforylatie en induceert apoptose in een maagkanker cellijn, en dat het maag tumorgroei In vivo
blokkeert inductie van key-STAT3 gereguleerde genen.

Materialen en methoden

Voorbereiding en opslag van kinaseremmers

Inhibitor WP1066 werd ontwikkeld en gesynthetiseerd door Waldemar Priebe en collega's aan de Universiteit van Texas MD Anderson Cancer Center, en de actuele voorraad werd geleverd hoffelijkheid van Houston Pharmaceuticals Inc, Houston, Texas, USA. Voorraden werden geresuspendeerd in Hybri-Max DMSO en opgeslagen bij -20 ° C. De voorraden waren slechts voor eenmalig gebruik, en niet opnieuw worden ingevroren na ontdooien.

In vitro Cultuur

AGS-cellen (ATCC, Manassas VA, USA) cellen werden in volledige media die RPMI + Glutamax onderhouden ( Gibco Life Sciences, Invitrogen OR, USA) medium aangevuld met 10% foetaal runderserum, 50 IU penicilline bij 37 ° C in 5% CO _{2-95% lucht.}

Western Blotting

Eiwitextracten werden bereid met hetzij TRIzol reagens (Life Technologies, Vic, Australia) volgens de instructies van de fabrikant en eiwit pellets werden opnieuw gesuspendeerd in 1% natriumdodecylsulfaat met 2 mmol /l Na _{3VO 4 of RIPA buffer. Aliquots (30 ug) werden onderworpen aan natriumdodecylsulfaat /polyacrylamidegelelektroforese. Membranen werden geblokkeerd en geïncubeerd bij 4 ° C overnacht in afgeroomde melk met de volgende antilichamen; STAT3, pv (705) STAT3, ERK1 /2, PT (202), Y (204) ERK1 /2, AKT, PS (473) AKT, JAK2, pv (1007), Y (1008) JAK2 (Cell signalering,Α2,Α4S,Α1,Ύ2Ƶ7,Ο2,ƕ8,ŷ2,ŷ1,ł9,Ź1), GAPDH (Abcamδ5). Membranen werden geïncubeerd met peroxide-geconjugeerd secundair antilichaam (Dako, varkens polyklonaal anti konijn, HRP geconjugeerd, # P0399) en zichtbaar gemaakt met versterkte chemiluminescentie (Amersham, Buckinghamshire, UK). Voor de analyse werden bands gekwantificeerd met behulp van de Quantity One software systeem (Biorad) en gefosforyleerde eiwitten uitgedrukt als een percentage van GAPDH van een duplicaat membraan. Ten minste n = 8 monsters werden beoordeeld door beide behandelingen.}

celtelling met Haemocytometry

De cellen werden geënt bij 5 x 10 ^{4 cellen /ml in 24 putjes in compleet medium en men ongestoord groeien gedurende 24 uur. Cellen werden behandeld met de geschikte concentratie WP1066 of DMSO als controle voor 0-360 min. Na behandeling werden de cellen losgemaakt door behandeling met trypsine-EDTA 0,25% (Sigma), gekleurd met trypan-blauw 0,4% (Sigma) bij een 1:01 verdunning gedurende 5 minuten bij 4 ° C, en geteld op een hemocytometer.}

carboxyfluoresceïne Diacetate succinimidylester (CFSE) Staining

AGS cellen met CFSE labelen werden de cellen losgemaakt door behandeling met trypsine-EDTA 0,25% (Sigma) en geresuspendeerd in voorverwarmde PBS /0,1% BSA bij een dichtheid van 1 x 10 ^{6 cellen /ml. 10 mM CFSE kleurstof (Invitrogen) werd bereid volgens het protocol van de fabrikant en vervolgens 5 gl /ml werd toegevoegd en grondig gemengd door omkeren homogene labeling van cellen te waarborgen. De monsters werden geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 10 minuten, geblust door toevoeging van 5 volumes ijskoude media en gedurende 5 minuten op ijs. De monsters werden vervolgens 5 keer gewassen in media en uitgeplaat met 2 x 10 5 cellen /well (6 putjes). Een monster cellen werd genomen na plateren en gelabeld met 100 ug /ml propidiumjodide (PI) en geanalyseerd door flowcytometrie uniformiteit en intensiteit van de labeling. De cellen werden daarna gekweekt in compleet medium gedurende 48 uur, waarna zij werden behandeld met of zonder geschikte WP1066 (5 uM) bij 37 ° C met 5% CO _{2 95% lucht gedurende 18 uur. De cellen werden vervolgens getrypsiniseerd zoals hierboven en opnieuw gesuspendeerd in compleet medium, gelabeld met 100 ug /ml PI, en middels flowcytometrie geanalyseerd bij 488 nM. De gegevens werden opgenomen met de BD FACS diva (BD Biosiences) software pakket en geanalyseerd door ModFit LT softwarepakket (VSH).}}

Annexine V kleuring

AGS-cellen werden gekweekt in compleet medium bij 2 × 10 ^{5 cellen /putje in 6-well platen met DMSO (carrier controle) of WP1066 (5 uM), of etoposide (200 uM; positieve controle) bij 37 ° C met 5% CO _{2 95% lucht ongestoord gedurende 24 uur. Cellen werden daarna als volgt behandeld; gewassen in ijskoude PBS, zoals boven getrypsiniseerd en celdichtheid bepaald haemocytometry voor resuspensie in Annexine bindingsbuffer tot 1 x 10 6 cellen /ml. 100 pi van dit preparaat genomen en geïncubeerd met 5 gl van Component A (annexine Fluor 488 annexine V component, 25 mM HEPES, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4, 0,1% runderserumalbumine) en 1 ug /ml PI gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker. De monsters werden vervolgens gemengd met 400 ui Annexine bindingsbuffer en geanalyseerd door flowcytometrie. Passende controles +/- reactie componenten bereid waren om te corrigeren voor bias in gating. De gegevens werden opgenomen met de BD FACS diva (BD Biosiences) softwarepakket.}}

Ethics Verklaring

Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de Australische Code voor de verzorging en het gebruik van dieren voor wetenschappelijke doeleinden (7 ^{e editie), en na goedkeuring van de Murdoch Childrens Research Institute Animal Ethics Committee (application # A583). Alle inspanningen werden geleverd om het ongemak te beperken in deze minimaal invasieve procedures.}

In vivo
Experimenten

gp130 ^{757F /F muizen zijn eerder beschreven [23]. Kort samengevat, discrete antrale tumoren door 4 weken oud en snel te groeien tot ongeveer 12 weken. Ze recapituleren de ontwikkelingskenmerken van intestinale-type adenocarcinoom van de maag, met inbegrip van submucosale invasie, maar niet metastaseren [24]. De dieren werden gehuisvest in een SPF faciliteit in de Murdoch Children's Research Institute en bevestigde vrij van Helicobacter pylori
te zijn. Drie groepen muizen werden getest op tumorontwikkeling: 1) 8 weken oude gp130 757F /F muizen die geen behandeling kregen (n = 10); 2) gp130 757F /F muizen die WP1066 ontvangen van 8 tot 10 weken oud (n = 10); en 3) gp130 757F /F muizen die DMSO als vehikel ontvangen van 8 tot 10 weken oud (n = 8). Voorafgaand aan alle dieren experimenten werden beoordeeld op welzijn, gewogen en behandeling volumes dienovereenkomstig berekend. De controledieren ontvingen dezelfde hoeveelheden DMSO voertuig WP1066-behandelde dieren. Muizen ontvingen 2 initiële intraperitoneale injecties WP1066 bij 10 mg /kg elke 48 uur om te acclimatiseren aan de effecten van de behandeling, ontvingen 5 injecties WP1066 bij 20 mg /kg elke 48 uur om de 2 weken te vervolledigen. Intraperitoneale injectieplaatsen afgewisseld met vier kwadranten van de buik van muizen. Aan het einde van het experiment werden de muizen gedood en magen gereseceerd voor fotografie en weefsel collectie.}

macroscopische en histologische Assessment

Magen werden snel ontleed langs de mindere kromming, gespeld out, gefotografeerd en in 4% gebufferde paraformaldehyde opgelost voordat de verwerking. Paraffine secties (4 urn) werden gekleurd met hematoxyline en eosine (H &E). Morfometrische analyse werd uitgevoerd met behulp van open-source ImageJ software (http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html). Voor ruimte metingen, werden beelden van het maagslijmvlies handmatig geschetst met de software tekenprogramma en de kwantificatie programma gebruikt om metingen te genereren

In vivo
Immunohistochemie &.; Kwantificering

Immunohistochemische analyse werd uitgevoerd met antilichamen voor Ki-67 (PharmingenȦ609) en geactiveerd caspase 3 (Cell Signalling TechnologyϤ1). Antigeenterugtrekking werd uitgevoerd door koken secties gedurende 30 minuten in 10 mM citroenzuur (pH 6,0). Kleuring werd aangevuld met passende soortspecifieke gebiotinyleerde secundaire antilichamen (DAKO, Denemarken), avidine en gebiotinyleerd mierikswortelperoxidase macromoleculaire complex (Vector Laboratories, Burlingame, CA), 3,3'-diaminobenzidine (Sigma, St. Louis, MI) en tegengekleurd met hematoxyline. Voor Ki-67 kwantificering, een geblindeerde waarnemer getelde aantal gekleurde cellen per klier in meerdere secties per dier met behulp van ImageJ als voorheen. Gegevens werden uitgedrukt als het aantal Ki-67 positieve cellen per klier. Voor geactiveerde caspase 3 kwantificeren, een geblindeerde waarnemer telden het aantal gekleurde cellen per oppervlakte van het slijmvlies in 4 willekeurige gebied van goed georiënteerd antrum per dier met behulp van ImageJ als voorheen. Gegevens werden uitgedrukt als het aantal geactiveerde caspase 3 positieve cellen per hectare mucosa

Semi-kwantitatieve morfometrische analyse van ontsteking

Ontsteking werd gemeten met microscopie op een blinde manier op H &.-Gekleurde secties. Antrale tumorweefsels werden geanalyseerd en minimaal 3 strips per dier (n = 7) kregen een semikwantitatieve score volgens de mate van ontstekingscellen van minimum = 0 tot maximale = 3. Lymphoplasmocytic en polymorfonucleaire infiltraat werden onafhankelijk beoordeeld. De gemiddelde waarden werden vervolgens vergeleken voor statistische analyse.

Real-Time (Q) -PCR analyse

RNA werd geëxtraheerd met TRIzol reagens (Life Technologies, Vic, Australia) volgens de instructies van de fabrikant. Totaal RNA (3 ug) werd reverse getranscribeerd in cDNA met behulp Moloney murine leukemievirus reverse transcriptase (Promega, Madison, WI) geprimed met 0,3 ug oligo (dT). Q-PCR primers werden ontworpen met behulp PRIMER EXPRESS (Applied Biosystems) (Tabel 1). SYBR green chemie (Applied Biosystems) werd gebruikt met L32 als normalizer. De PCR-omstandigheden waren 95 ° C gedurende 10 min, vervolgens 40 cycli van 95 ° C gedurende 15 sec en 60 ° C gedurende 15 seconden; de reacties werden uitgevoerd op een Applied Biosystems AB7500 RT PCR machine. Resultaten werden geanalyseerd met sequentiedetector software en relatieve voudig verschillen werden bepaald met de ΔΔCt werkwijze zoals beschreven door de fabrikant.

Statistische analyse

De gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde . Waarden verkregen van de kwantitatieve analyse van genexpressie of het aantal gekleurde cellen werd vergeleken tussen de monsters door ANOVA, en waarbij een statistisch significant verschil gevonden individuele groepen werden verder geanalyseerd met het geschikte parametrische en niet-parametrische toets met de Sigmastat statistisch pakket. Statistische significantie werd gedefinieerd als p ≤ 0,05.

Resultaten

WP1066 snel onderdrukt Gefosforyleerd Y (705) STAT3 en induceert fosforylering van ERK1 /2 in AGS Cells

De JAK- STAT route en het ERK1 /2 route zijn de twee belangrijkste signaaltransductie routes voorbij gp130. Deze twee trajecten hebben wederzijdse en inverse regulerende effecten op elkaar, het best aangetoond door de negatieve regulatie van pSTAT3 na ERK1 /2 activatie [47].

WP1066 dosis-respons experimenten werden uitgevoerd door het behandelen van AGS cellen met 0 uitgevoerd , 1, 2 of 5 uM WP1066 gedurende 60 min en het meten van fosforylatie van JAK2, STAT3, ERK1 /2 en SHP-2. Zoals verwacht werd pJAK2 sterk geremd door WP1066 bij alle geteste concentraties en van > 80% bij 5 uM. 5 pM WP1066 gaf maximale remming van pSTAT3 en wederzijdse activering van ERK1 /2 (Fig. 1A) met een verlaging van de totale STAT3 bij 5 uM of hogere concentraties (gegevens niet getoond). Samenvalt met de stijging van de vaste vergoedingen, pSHP2 activering werd dosis-afhankelijk verbeterde na WP1066 toediening (Fig. 1A).

Voor tijdsverloop studies, AGS cellen werden behandeld voor 0-360 min met 5 uM WP1066 en fosforylering van JAK2, STAT3, ERK1 /2 en SHP-2 werden geanalyseerd door Western blotting (Fig. 1B). WP1066 behandeling resulteerde in een snelle remming van pJAK2, met een daling van 75% in 30 minuten en ten hoogste 90% daling van 60 min. Daarna de cellen teruggewonnen en teruggevoerd naar basale fosforylering van JAK2 360 min. Het patroon van verminderde STAT3 activering gespiegeld die van de JAK2 fosforylering. Daarentegen werd ERK1 /2 fosforylering aanzienlijk stijgen na WP1066 behandeling, met een stijging van 250% 15 min en een maximale 460% toename van 60 minuten, voordat hij terugkeerde naar basale niveaus van 360 min. SHP2 activering op de voet gevolgd veranderingen in de ERK expressie met maximale inductie bij 60 min.

WP1066 remt AGS Groei door bestrijding van proliferatie en inductie van apoptose

Actieve STAT3 is een gevestigde bestuurder van menselijke maagkanker cel groei en proliferatie [5], en langdurige activering van ERK1 /2 induceert apoptose van maagepitheelcellen [25]. Heeft aangetoond dat WP1066 regelt STAT3 en ERK1 /2 signalering in een wederkerige manier, we getest of het ook kan verstoren celgroei en apoptose van AGS cellen.

Behandeling van AGS cellen met 5 uM WP1066 (Fig. 2A ) resulteerde in een aanzienlijke vermindering van het aantal cellen ten opzichte van controle (DMSO DMSO, 100% ± 3,14 vs. WP1066; 36,02 ± 3,18%, p < 0,05). Om te bepalen of deze vermindering van het aantal cellen was vanwege veranderde celproliferatie of apoptose, of een combinatie van beide werd CFSE en Annexine V kleuring uitgevoerd op behandelde cellen. AGS cellen behandeld met WP1066 werden intenser gelabeld met CFSE dan behandeld met DMSO, aanwijzingen voor verminderde aantal celdelingen en derhalve proliferatie (fig. 2B). Bovendien, een groter deel van AGS cellen behandeld met WP1066 werden gemerkt met Annexine V (figuur 2C) in vergelijking met cellen behandeld met DMSO, waaruit blijkt dat de WP1066 ook geïnduceerde apoptose in AGS cellen (WP1066; 1,3 voudige toename, p = 0,049).

WP1066 Blocks Gastric tumorgroei in gp130 ^{757FF Mice door Onderdrukking van tumor Cell proliferatie en versterking van apoptose}

gp130 ^{757FF muizen ontwikkelen distale maag tumoren gekenmerkt door verhoogde maag IL-11 gedreven STAT3 activering [12], [13]. Sinds pJAK2 en p-STAT3 worden geblokkeerd door WP1066 In vitro
, we getest of WP1066 ook maagtumor ontwikkeling zou blokkeren In vivo
. Behandeling van gp130 757FF muizen 3 keer per week gedurende 2 weken met 10-20 mg /kg WP1066 significant verminderde maag tumorgroei met 47% van 42,11 ± 3,21 mm 2-22,36 ± 3,64 mm 2 ( p <. 0,05) (figuur 3A-D). DMSO behandelde tumoren waren niet anders dan tumoren waargenomen in 8 weken oude muizen, de leeftijd waarop WP1066 behandeling begonnen, bevestigt dat de maag tumorgroei is relatief stabiel 8-10 weken [27], en dat WP1066 behandeling veroorzaakt eigenlijk tumor regressie in plaats van stasis (Fig. 3A-D).}

Om te bepalen of proliferatie gewijzigd maagtumoren, Ki-67 positieve cellen /klier werden gekwantificeerd in de behandelde cohort. WP1066 verminderde significant maagepitheel celproliferatie (DMSO 62 ± 7,7 vs. WP1066 41,6 ± 6,5 Ki-67 gekleurde cellen /klier, p < 0,05; fig. 3E-G) tonen dat WP1066 tumorgroei kunnen remmen door remming van celproliferatie. Om de effecten van WP1066 op tumorcelapoptose beoordelen coupes van de WP1066 of DMSO behandelde cohorten werden gekleurd met een antilichaam tegen gesplitst caspase 3, een marker van apoptotische celdood (fig. 3H, I). Er waren significant meer apoptotische profielen in-WP1066 behandelde tumoren dan controles, waaruit blijkt een duidelijke pro-apoptotische effect van WP1066 (WP1066 25,25 ± 5,32 versus DMSO 2.65 ± 0.76 gekleurde cellen /mm ^{2 slijmvlies, p < 0,05; fig. 3J ).}

WP1066 Doelen Specifiek JAK2 en STAT3 fosforylering te maag tumorgenese onderdrukken in gp130 ^{757FF Mice}

Omdat gp130 ^{757FF muizen ontwikkelen tumoren in reactie op de constitutieve gp130 activering [20] , testten we of WP1066 onderdrukt stroomafwaartse signaaltransductieroutes in vivo.
WP1066 behandeling 2 weken resulteerde in een afname van 25% in de relatieve hoeveelheid totale STAT3 in het antrale mucosa in vergelijking met DMSO behandelde groep (fig. 4A) . Het bedrag van de totale JAK2, AKT en ERK1 /2 werd niet veranderd door WP1066 behandeling. Dit suggereert dat chronische behandeling van gp130 757FF muizen met WP1066 onderdrukt expressie van STAT3.}

Immunoblotanalyse van signaleringsactiviteit een significante vermindering pJAK2 (80,12 ± 5,70% DMSO controle), pY705 STAT3 (26,84 % ± 7.2 van DMSO controle; fig. 4B) en ERK1 /2 (72.66% ± 5.23.of DMSO controle; fig. 4B). AKT fosforylering werd niet veranderd door WP1066 behandeling. Verminderde activering van JAK2 en STAT3 is in overeenstemming met de In vitro
gegevens en bekende effecten van WP1066.

WP1066 onderdrukt de ontstekingsreactie in de Antral slijmvlies van gp130 757FF Mice

Omdat een chronische ontstekingsreactie van de maag is cruciaal voor tumorontwikkeling [27], testten we of een deel van de werking van WP1066 is de STAT3-bemiddelde inflammatoire reactie, die normaliter bij aan tumorprogressie onderdrukken. Histologische analyse bleek dat polymorfonucleaire infiltratie in het antrum van WP1066 behandelde muizen was beduidend lager dan in de controlemuizen (figuur 5A. DMSO 2,45 ± 0,24 vs WP1066 1,46 ± 0,22, p < 0,05), terwijl lymphoplasmocytic infiltraat verschillend tussen de twee was niet groepen (fig. 5B; DMSO 1,73 ± 0,16 vs WP1066 1.32 ± 0.20, p > 0,05).

Sinds maagontsteking doorgaans wordt gemedieerd door een klein aantal van de belangrijkste pro-inflammatoire cytokines en enzymen, meten we de uitdrukking van een selecte groep van deze door Q-PCR in DMSO en-WP1066 behandelde magen. Expressie van pro-inflammatoire mediatoren met uitzondering van IFNy, TNFa en iNOS significant geremd door WP1066 behandeling als volgt; IL-6 (fig. 5C; 6,0 ± 2,6 maal), IL-11 (figuur 5D,. 8,7 ± 3,4 maal), IL-1α (figuur 5E;. 10,9 ± 4,3) fold), IL-1β (figuur 5F.; 3 ± 0,9 maal) en COX2 (figuur 5G,. 2,94 ± 1,05). Derhalve WP1066 remming van STAT3-activiteit en tumor progressie was deels te danken aan verminderde polymophonuclear infiltratie en verminderde STAT3-afhankelijke transcriptie van ontstekingsbevorderende IL-6, IL-11, IL-1α, IL-1β en COX2-genen.

WP1066 remde de expressie van amfireguline in de Antral slijmvlies van gp130 ^{757FF Muizen}

het effect van WP1066 behandeling op de expressie van groeifactor liganden bekend een rol in de groei en differentiatie van de maag en spelen bij de ontwikkeling van gp130 ^{757FF tumoren werd beoordeeld. WP1066 remde de expressie van amfireguline (1,85 ± 0,60 maal, p <0,05), maar niet HB-EGF (fig. 6) in de antrale mucosa van behandelde muizen. Bovendien, de maag proliferatieve ligand en STAT3-gereguleerde gen reg1 liet een sterke remmende trend na WP1066 behandeling vergeleken met de DMSO controle antrum (figuur 6;. P = 0,069).}

Discussie

in deze studie demonstreren we dat WP1066 dosisafhankelijk remt de JAK2 /STAT3 signaleringsroute in menselijke maagkanker (AGS) cellen, met als gevolg een 60% reductie in celproliferatie en een kleinere toename van apoptose. Het mechanisme hiervoor is waarschijnlijk het gevolg van de dubbele remming van gefosforyleerde vormen van JAK2 en STAT3 daardoor STAT3 transcriptionele activiteit verminderen, zoals aangetoond verscheidene kankercellijnen zoals gliomen [17], [28], [29], myeloïde leukemie [ ,,,0],30], en melanoom [20]. Anderzijds, WP1066 verzoek volgde een wederkerige toename ERK1 /2 activatie samenvalt met verhoogde pSHP2 de fosfatase verantwoordelijk voor het activeren van de Ras /MAP-kinase-signaalroute. Een soortgelijke opmerking met betrekking tot ERK activering is voor andere kankercellijnen afgeleid van renale carcinoma [18] en gliomen [28]. Daarom cross-regulatie van STAT3 en ERK gemedieerde signalering stroomafwaarts van IL-6 familie cytokinen blijkt regelmatig voordoen in een bereik van weefsels en cellijnen [31].

WP1066 was ook effectief bij toediening in vivo
, indien geblokkeerd STAT3 activering (75%) in gp130 ^{757FF muis antral tumoren, alsmede lagere totale STAT3 eiwit, wat suggereert dat expressie van het afnemen Stat3
gen in de magen van behandelde muizen. Dit wordt ondersteund door het bestaan ​​van een consensus plaatsen voor geactiveerde STAT3 bindend voor de Stat3
promotor, met activering van de Stat3
gen zoals aangetoond met behulp van mutant Stat3
promoter-reporter constructen en EMSA [48] of ChIP-seq [49], en stelt WP1066 autocriene activering van STAT3 na remming van JAK2 /STAT3 fosforylatie kunnen remmen.}

Zoals verwacht, pJAK2 toxoid werden gereduceerd in de aanwezigheid van WP1066 in de maag. In tegenstelling tot het effect van WP1066 in vitro,
ERK1 /2 activatie in magen van WP1066 behandelde muizen werd licht gedaald. De reden voor dit verschil kan zijn tweeledig; ten eerste, de In vivo
blootstelling aan WP1066 werd chronische vergeleken met de acute blootstelling In vitro
; ten tweede, de blootstelling In vivo
is complexer met meerdere potentiële signaalwegen gebruik te maken van gemeenschappelijke signaaltransductie moleculen. Toch is de verminderde activering van JAK2 en STAT3 is in overeenstemming met de gevestigde rol van deze cytokine /groeifactor signalering componenten in maagkanker progressie [5], [27] en toont aan dat In vivo,
en wanneer geïsoleerd van de effecten van H. pylori
infectie is hoofdzakelijk gewijzigde activering van STAT3 en niet ERK1 /2 die cruciaal is voor tumorontwikkeling.

Samenvallend met remming van STAT3-activiteit, de toepassing van WP1066 slechts 2 weken in vivo
resulteerde in een afname van 50% in tumorgebied gepaard met een overeenkomstige vermindering in proliferatie gemeten Ki-67 kleuring, en tot een toename van tumorcellen apoptose zoals gemeten door geactiveerde caspase 3 immunokleuring. Deze remming van tumorgroei ging gepaard met een > 40% daling van polymorfonucleaire aantal cellen en de up-regulatie van geassocieerde pro-inflammatoire cytokines zoals IL-1α, IL-1 ß en COX2, die bevorderen maag tumorgenese. Daarentegen WP1066 had geen effect op IFNy, TNFa en iNOS expressie in verhouding met het gebrek aan vermindering van lymfocyten en macrofagen (lymphoplasmocytic infiltratie) via behandeling tijdsverloop. De remming van IL-1β na pSTAT3 remming door WP1066 is bijzonder belangrijk, omdat IL-1β een belangrijke regulator van maagzuursecretie, een krachtige promoter van tumorgroei in een transgeen muismodel van gastrische kanker [33] en een integraal onderdeel van de NLRP3 inflammasoom [32]. IL-11 speelt een endogene stimulator van antrale IL-1β expressie via STAT3 [13], en we hier hebben aangetoond dat IL-11 wordt geremd door WP1066. Aangezien IL-11 wordt stroomopwaarts van IL-1β in de maag te zijn, dan is dit een plausibele route voor remming diens na blokkade van STAT3 activering.

De remmende effecten van WP1066 in de gp130 ^{757FF muismodel van maagkanker, herhalen en uitbreiding van de resultaten van STAT3 haploinsufficiëntie genetisch tijdens hetzelfde muismodel [26], evenals het gebruik van systemische antisense oligonucleotiden tegen STAT3 [12] Dit onderstreept het belang van geactiveerde STAT3 signalering faciliteren maag tumorgenese. Gezien het belang van IL-11 in het bevorderen van de tumor initiatie en ontwikkeling [12], [13], en IL-6 in het faciliteren van lokale polymorphonucleaire infiltratie [34] in het gp130 757FF muis, is het veelzeggend dat WP1066 effectief gereduceerd de expressieniveaus van beide cytokinen samenvallen met omkering van tumorgroei. Dit ondersteunt de opvatting dat STAT3 reguleert de transcriptie van zowel IL-11 en IL-6, mogelijk gereden door autocriene terugkoppelingen, aangezien beide cytokinen voorkeur gebruik STAT3 transcriptie in de maag [23].}

reg1 is een wijd verdeeld lid van de genfamilie Reg en een bekende maag groeifactor, die een belangrijke rol als proliferatieve en anti-apoptotische regulator in de maag van zowel muizen [26] bereikt, [35] en mens [36]. We hebben eerder aangetoond dat REG1 sterk geïnduceerd in antrale tumoren van gp130 ^{757FF muizen samenvalt met IL-6 en IL-11 expressie, en haploinsufficiëntie van STAT3 leidt tot verminderde expressie van REG1, wat suggereert dat het een STAT3-gereguleerde gen [26]. Dit werd bevestigd in de maag cellijnen waarbij IL-11 [37] en IL-6 [36] gestimuleerde STAT3 fosforylatie die weer geactiveerd REG1 transcriptie. Onze huidige gegevens zijn consistent met deze resultaten, dat WP1066 toont een sterke tendens om reg1 inhiberen maagtumoren van de gp130 757FF muis samen met IL-6 en IL-11 remming. H.}

• PLoS ONE: CD147 Expressie in Human MaagKanker wordt geassocieerd met tumorrecidief en Prognosis
• PLoS ONE: Een MAP3k1 SNP voorspelt overleving van maagkanker in een Chinese Population