PLoS One: gátlása a JAK2 /STAT3 Pathway Csökkenti Gyomor rák növekedését in vitro és In Vivo

absztrakt

Signal Transducer és transzkripciós aktivátor-3 (STAT3) van konstitutívan aktivált számos rák, amennyiben ez elősegíti a növekedést , gyulladás, angiogenezis és gátolja az apoptózist. Kimutattuk, hogy a STAT3 van konstitutívan aktivált humán gyomorrák, és, hogy a krónikus az IL-11-vezérelt STAT3 transzkripciós aktivitást indukál gyomor tumorgenesisben a gp130 ^{757FF egérmodelljében gyomorrák fejlődés. Itt megmutatjuk, hogy a kezelés az emberi AGS gyomorrák sejtek Janus-kináz (JAK) inhibitor WP1066 dózis és az idő-függő gátolja STAT3 foszforiláció együtt csökkent JAK2 foszforilációs, csökkent proliferáció és fokozott apoptózist. Ezen túlmenően, alkalmazása intraperitoneális WP1066 2 hétig, csökkentett gyomor tumor térfogata 50% -kal, a gp130 757FF egér egybeesik csökkentett JAK2 és STAT3 aktiváció összehasonlítva a vivőanyaggal kezelt, alomból ellenőrzéseket. Gyomor tumorok WP1066- kezelt egerek csökkentett polimorfonukleáris gyulladás, egybeesik gátlása számos proinflammatorikus citokinek, többek között az IL-11, IL-6 és IL-1β, valamint a növekedési faktorok REG1 és amfiregulin. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a WP1066 képes blokkolni proliferáció, csökkenti a gyulladást és apoptózist indukál gyomor tumorsejtek gátlása révén STAT3 foszforiláció, és hogy sok citokinek és növekedési faktorok, amelyek elősegítik a gyomor tumor növekedését szabályozza STAT3-függő mechanizmusok. WP1066 alapját képezhetik a jövőbeli terápiás ellen gyomorrákban. Katalógusa}

Citation: Judd LM, Menheniott TR, Ling H Jackson CB, Howlett M, Kalantzis A, et al. (2014) gátlása JAK2 /STAT3 útvonal Csökkenti gyomorkarcinóma Növekedési In Vitro katalógusa és In Vivo katalógusa. PLoS ONE 9 (5): e95993. doi: 10,1371 /journal.pone.0095993 katalógusa

Szerkesztő: Rupesh Chaturvedi, Vanderbilt University School of Medicine, Amerikai Egyesült Államok katalógusa

Beérkezett: január 21, 2014; Elfogadva: április 1, 2014; Megjelent: május 7, 2014 katalógusa

Copyright: © 2014 Judd et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: Ez a projekt támogatott forrásokat; NHMRC Ausztrália (www.nhmrc.gov.au) projekttámogatásǽ165 NIH /NCI USA (nih.gov; www.cancer.gov) melanoma SPORE P50 CA093459-06, NIH /NCI USA (nih.gov; www.cancer. gov) agy SPORE 2 P50 CA127001-06. A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: Waldemar Priebe rendelkeznek a szabadalmakkal és a pénzügyi érdeke a fejlesztés vegyület WP1066 alábbiak; W.Priebe, N.Donato, M.Talpaz, S, Szymanski, I. Fokt, A. Levitzki vegyületek kezelésére sejt proliferatív betegségek. Egyesült Államokban szabadalmi WO /2005/058829 2004/12/01. Megjegyezzük, hogy a szerzők által megadott módosított nyilatkozatot versengő érdekek tekintetében szabadalom WP1066 birtokában W. Priebe. A szerzők azt is kijelentik, hogy "ez nem változtat a ragaszkodás PLoS One politikák adatok megosztása és anyagok". Katalógusa

Bevezető katalógusa

A hét jelátvivő és transzkripciós aktivátor (STAT) családtagok , STAT3 már a legtöbb következetesen játszik egy sor közös rák az emberben, beleértve; tüdő-, emlő-, petefészekrák, prosztatarák, és a vastagbél [1], [2], [3], [4]. Ez szintén igaz a humán gyomorrák [5], [6], [7], amelyben STAT3 aktiváció által krónikus foszforiláció tirozin (Y) tartózkodnak 705 összefüggésbe hozták a fokozott növekedés, angiogenezis, invázió és metasztázis a primer rák [ ,,,0],6], [7], [8]. Így gátlása STAT3 transzkripciós aktivitást humán gyomorrák nyújthat egy lehetséges csökkentő eszközt magas morbiditással és az élet meghosszabbítása között gyomorrákos betegek világszerte.

hiányában a funkcionális mutációi a STAT3 gén, aberráns STAT3 aktivitás által kiváltott tartós aktivitás upstream tirozin-kinázok és /vagy a unscheduled- vagy túlzott expressziója stimuláló ligandumok [9], [10], [11]. Ezt világosan példázza a gp130 ^{757F /F egér modell gyomorrák fejlődés, amelyben egy Phe Tyr szubsztitúció a 757 helyzetben a intracelluláris kar az IL-6 család jelző receptor gp130 egyidejűleg megakadályozza SHP2 és SOCS3 kötő , ami gátolja a Ras /MAP kináz jelátvitel, és hiperaktivációja STAT3 által konstitutív foszforiláció [23], [24], [26]. Nemrégiben mi és mások kimutatták, hogy a gyomor tumorok, jelentős növekedése a transzkripció egybeesnek megnövekedett expressziója a gp130 ligandum az IL-11 a humán gyomorrák és egér modelleket ezen betegség [5], [12], [13]. Az utóbbi az IL-6 nélkülözhető, de az IL-11 feltétlenül szükség van tumorgenesisben [12], [13]. Továbbá, az IL-11 /STAT3 kimutatták, hogy fontos vezető atrófiás gyomorhurut, az első rákmegelőző elváltozás a gyomor következő krónikus fertőzés baktérium által Helicobacter pylori katalógusa [14].}

a mai napig számos kinázok leírták, hogy indukálja a STAT3 aktivitás következő ligandum /receptor kötő, azonban csak JAK1 és JAK2 venni STAT3 foszforiláció upon dokkoló IL-11 /gp130 receptor komplex [15], és ezek közül az IL-11 /gp130 előnyösen kötődik JAK2 [16]. Ezek a megfigyelések azt sugallják, hogy a JAK2 és a STAT3 jelen ígéretes célpontjai tervezése terápiás antagonisták, hogy elnyomja az IL-11 /STAT3 jelátviteli humán gyomorrák.

A közelmúltban a kávésav származék WP1066, amely szerkezetileg a kis hatásossága tirozin-kináz-inhibitor AG490 , kimutatták, hogy egy igen hatásos inhibitora a JAK2 /STAT3 útvonal transzformált agy glioma [17] és a vese-karcinóma [18] sejtvonalak, ami a növekedés gátlás és indukció a klasszikus pro-apoptotikus utak. Emellett WP1066 hatásos in vivo katalógusa ellen igen rosszindulatú melanoma és a leukémiák, hogy pozitívak a JAK2 V617F + mutáció, amely elősegíti a konstitutív JAK2 kináz aktiválása [19], [20], [21], [22 ]. Nem publikált vizsgálatok arra utalnak, hogy a WP1066 nem ATP-kompetitív inhibitora, és blokkolja expresszióját foszforilezett JAK2 és a STAT3; Ezen túlmenően, a p-STAT3-Y705 gátolható függetlenül a JAK2 állapotát. Így WP1066, amely egyedülálló lehetőséget, hogy egyaránt gátolja a p-JAK és p-STAT3, és ezt követően hatékonyan blokkolja JAK2 /STAT3 jelátviteli útvonal és STAT3 transzkripciós aktivitását. Katalógusa

A teszt az ötlet a kettős blokádja JAK2 és STAT3 aktiváció a gyomorban és a későbbi gyomorrák fejlesztés, már használják mind in vitro katalógusa és in vivo katalógusa megközelítések értékelni, hogy WP1066 lelassíthatja, vagy blokkolja a gyomor tumor növekedésének gátlása útján JAK2 /STAT3 aktivitás, és más szorosan kapcsolódó onkogén jelátviteli utak. Itt megmutatjuk, hogy WP1066 hatásosan gátolja STAT3 foszforilációt, és apoptózist indukál egy gyomorrák sejt vonal, és hogy képes gátolni a gyomorsav a tumor növekedését in vivo
blokkolásával indukciója kulcsfontosságú STAT3-szabályozott géneket.

anyagok és módszerek katalógusa

elkészítése és tárolása a kináz inhibitorok

inhibitor WP1066 fejlesztette ki és szintetizálják Waldemar Priebe és munkatársai a University of Texas MD Anderson Cancer Center, és a jelenlegi állomány szállított jóvoltából Houston Pharmaceuticals Inc, Houston, Texas, USA. Készletek reszuszpendáltuk Hybri-Max DMSO és -20 ° C-on. Állomány esetében csak egyszeri használatra, és nem újra fagyasztani a felengedés után. Katalógusa

In vitro kultúra katalógusa

AGS sejteket (ATCC, Manassas VA, USA) a sejteket az egész média RPMI + Glutamax ( Gibco Life Sciences, Invitrogen OR, USA) kiegészített tápközeg 10% magzati borjú szérumot, 50 NE penicillint, 37 ° C-on, 5% CO _{2-95% levegő.}

Western-blot

protein extraktumokat készítettünk akár TRIzol reagenssel (Life Technologies, Vic, Ausztrália), a gyártó utasításai és a fehérje-üledéket újraszuszpendáljuk 1% nátrium-dodecil-szulfát, amely 2 mmol /l Na _{3VO 4 vagy RIPA pufferben. Alikvotjait (30 ug) vetettük alá nátrium-dodecil-szulfát /poliakrilamid gél elektroforézis. A membránokat blokkoltuk, és inkubáltuk 4 ° C hőmérsékleten egy éjszakán át lefölözött tej a következő antitestek; STAT3, Py (705) a STAT3, ERK1 /2, Pt (202), Y (204) ERK1 /2, Akt, pS (473) Akt, JAK2, Py (1007), Y (1008) JAK2 (Cell signaling,Α2,Α4S,Α1,Ύ2Ƶ7,Ο2,ƕ8,ŷ2,ŷ1,ł9,Ź1), GAPDH (ABCAMδ5). A membránokat inkubáltuk peroxid-konjugált másodlagos antitesttel (Dako, poliklonális sertés anti-nyúl HRP konjugált, # P0399), és láthatóvá erősített kemilumineszcenciás (Amersham, Buckinghamshire, Egyesült Királyság). Az elemzéshez csíkok mennyiségi a mennyiség egy szoftver rendszert (Bio-rad) és foszforilált fehérjék arányában kifejezett GAPDH egy példányban membrán. Legalább n = 8 mintákat értékelte bármelyik kezelés.}

sejtszámlálás által Haemocytometry

A sejteket beoltottuk 5 × 10 ^{4 sejt /ml 24-lyukú formátumban teljes táptalajban és azokat háborítatlanul szaporodni hagytuk 24 órán át. A sejteket a megfelelő koncentrációban WP1066 vagy DMSO kontrollként 0-360 min. A kezelés után a sejteket elmozdulhatnak kezeléssel tripszin-EDTA 0,25% (Sigma), megfestettük tripán-kék 0,4% (Sigma) egy 1:01 hígítás 5 percen át 4 ° C-on, és megszámoltuk a hemocitométerrel.}

karboxilfluoreszcein diacetát-szukcinimidil-észter (CFSE) festés

címke AGS sejtek CFSE sejteket kimozdult kezeléssel tripszin-EDTA 0,25% (Sigma), és újraszuszpendáltuk előmelegített PBS /0,1% BSA-t sűrűségben 1 × 10 ^{6 sejt /ml volt. 10 mM CFSE festék (Invitrogen) állítunk elő, mint egy gyártó protokollja, majd 5 ul /ml adunk hozzá és alaposan összekeverjük inverzió, hogy biztosítsa a homogén címkézésére sejteket. A mintákat 37 ° C-on 10 percig, hozzáadásával elbontottuk, 5 térfogatnyi jéghideg média és 5 percig inkubáltuk jégen. A mintákat ezután 5-ször mossuk, a média és szélesztettük 2 × 10 5 sejt /lyuk (6-lyukú lemez). A mintát a sejtek vették szélesztés után és címkézni 100 ug /ml propidium-jodid (PI), és áramlási citometriával elemezzük egységességének és intenzitása címkézés. A sejteket ezután növesztjük komplett média 48 órán át, ami után kezeltek vagy anélkül megfelelő WP1066 (5 | iM), 37 ° C-on, 5% CO _{2 95% levegő 18 órán át. A sejteket ezután tripszinnel kezeltük, mint fent, és újra felszuszpendáltuk komplett média, jelzett 100 ng /ml PI, és áramlási citometriával elemezzük, 488 ηM. Az adatok segítségével rögzítették a BD FACS díva (BD Biosiences) szoftvercsomag és elemezzük Modfit LT szoftvercsomag (VSH). Katalógusa}}

annexin V festés katalógusa

AGS sejteket komplett média 2 × 10 ^{5 sejt /lyuk mennyiségben egy 6-lyukú lemezeken DMSO (hordozó kontroll), vagy WP1066 (5 jiM) vagy etopozid (200 uM; pozitív kontroll) 37 ° C-on, 5% CO _{2 95% levegő háborítatlanul 24 órán át. A sejteket ezután a következőképpen kezeljük; mostuk jéghideg PBS-ben, tripszinnel kezeltük, mint fent, és a sejtsűrűség által meghatározott haemocytometry reszuszpendálás előtt a Annexin kötőpufferrel 1 × 10 6 sejt /ml volt. 100 ul ezt a készítményt vették, és inkubáljuk 5 mikroliter komponenshez (Annexin Fluor 488 annexin V komponens, 25 mM HEPES, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH = 7,4, 0,1% szarvasmarha szérum albumin), és 1 ng /ml a PI-15 percig, szobahőmérsékleten, sötétben. A mintákat ezt követően 400 ul Annexin kötőpufferben és áramlási citometriával elemezzük. Megfelelő ellenőrzés +/- reakció komponensek készek voltak, hogy beállítsa elfogultság kapuzás. Az adatok segítségével rögzítették a BD FACS díva (BD Biosiences) szoftvercsomag. Katalógusa}}

Etikai Nyilatkozat katalógusa

A kísérleteket végeztünk szerint az ausztrál kódex az ellátás és használata állatok tudományos célokra (7 ^{th kiadás), és a jóváhagyás után a Murdoch Childrens Research Institute Állat Etikai Bizottsága (alkalmazás # A583). Minden erőfeszítést tettek arra, hogy a kényelmetlenségek minimalizálása ezekben minimálisan invazív eljárások. Katalógusa}

Az in vivo kísérletek katalógusa

gp130 ^{757F /F egereken korábban már leírták [23]. Röviden, diszkrét antrális tumorok fejlődnek 4 hetes korig és gyorsan növekedni, amíg körülbelül 12 hét. Ezek összefoglalja a fejlődési jellemzőit bél típusú gyomor adenokarcinóma, ideértve a nyálkahártya alatti invázió, de nem átterjedni [24]. Állatokat a SPF létesítmény a Murdoch Gyermek Kutató Intézet, és megerősítette, hogy mentes a Helicobacter pylori katalógusa. Három egércsoportot értékelték a tumor fejlődését: 1) 8 hetes gp130 757F /F egerek, amelyek nem kaptak kezelést (n = 10); 2) gp130 757F /F kapott egerek WP1066 8-10 hetes korban (n = 10); és 3) a gp130 757F /F kapott egerek DMSO vivőanyagot 8-10 hetes korban (n = 8). A kísérlet előtt minden állat értékelték a jólét, lemérjük és a kezelés kötetek kiszámítani. A kontroll állatoknak azonos mennyiségű DMSO jármű WP1066-kezelt állatokban. Az egerek 2 kezdeti intraperitoneális injekcióval WP1066 10 mg /kg minden 48 óra és akklimatizálódni őket a kezelés hatásának, majd kapott 5 injekciót WP1066 at 20 mg /kg minden 48 óra, hogy befejezze a 2 hetes rend. Intraperitoneális injekció beadási helyén váltakoztak a négy negyedre a has az egerek. A következtetés a kísérlet, egereket leöltük, és gyomor kimetszett fényképezés és a szövetek gyűjtése. Katalógusa}

makroszkopikus és szövettani értékelés katalógusa

gyomrukat gyorsan mentén felvágjuk a kisebb görbület tűzött ki, fényképezett és fix 4% -os pufferolt paraformaldehiddel feldolgozás előtt. Paraffin szakaszok (4 um) festettünk hematoxilinnel és eozinnal (H &E). Morfometriai analízist nyílt forráskódú ImageJ szoftver (http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html). Területalapú mérések képek a gyomornyálkahártya kézzel felvázolt a szoftver rajzeszköz és a mennyiségi programot előállításánál használt méréseket. Katalógusa

In vivo katalógusa immunhisztokémiai & Számszerűsítése

immunhisztokémiai elemzést végeztünk antitestekkel Ki-67 (PharmingenȦ609) és aktivált kaszpáz-3 (Cell Signalling TechnologyϤ1). Antigén-visszanyerés végeztük forralással szakaszok 30 percig 10 mM citromsav (pH = 6,0). Festési fejeződött megfelelő fajspecifikus biotinilált másodlagos antitestekkel (DAKO, Dánia), avidin és biotinilezett torma peroxidáz makromolekuláris komplex (Vector Laboratories, Burlingame, CA), 3,3'-diaminobenzidin (Sigma, St. Louis, MI) és ellenfestjük hematoxilin. Ki-67 számszerűsítése, a vak megfigyelő számítani száma megfestett sejtek számát mirigy több szakaszban állatonként segítségével ImageJ, mint korábban. Az adatokat számával fejeztük ki a Ki-67 pozitív sejt per mirigy. Az aktivált kaszpáz 3 számszerűsítése, a vak megfigyelő megszámoltuk a megfestett sejtek számát terület nyálkahártya 4 random területein jól orientált antrumból állatonként segítségével ImageJ, mint korábban. Az adatokat számával fejeztük ki aktivált kaszpáz-3 pozitív sejt per területe nyálkahártyáját.

Félig kvantitatív morfometriai elemzése Inflammation

gyulladás alkalmazásával értékeltük mikroszkópia vak elrendezésben a H &E-festett szakaszok. Antrális tumor szöveteket vizsgáltak meg, és legalább 3 csíkok állatonként (n = 7) kaptak egy félkvantitatív pontszám mértéke szerint a gyulladásos sejtek minimum = 0 és a maximális = 3. lymphoplasmocytás és polimorfonukleáris infiltrátum értékelték függetlenül. Az átlagértékeket ezután összehasonlítjuk a statisztikai elemzéshez.

Valós idejű (Q) -PCR Elemzés

RNS-t extraháljuk TRIzol reagenssel (Life Technologies, Vic, Ausztrália) szerint a gyártó utasításai szerint. A teljes RNS (3 ug) reverz transzkripcióval cDNS-sé Moloney rágcsáló leukémia-vírus reverz transzkriptáz (Promega, Madison, WI) primerrel 0,3 ug oligo (dT). Q-PCR-primereket terveztünk alkalmazásával Primer Express (Applied Biosystems) (1. táblázat). SYBR zöld kémia (Applied Biosystems) alkalmaztunk L32 a normalizáló. A PCR körülményei a következők voltak: 95 ° C-on 10 percig, majd 40 ciklus 95 ° C-on 15 másodpercig és 60 ° C-on 15 mp; a reakciót futtatunk egy Applied Biosystems AB7500 RT-PCR gép. Eredmények analizáltuk szekvencia detektor szoftver, és a relatív szeres különbséget határoztuk meg ΔΔCt leírt eljárás a gyártó által.

Statisztikai elemzés

Az adatokat átlag ± standard hiba az átlag . Nyert értékek mennyiségi elemzése gén expresszióját vagy több festődött sejtek összehasonlítottuk a minták közötti ANOVA, valamint adott statisztikailag szignifikáns különbséget találtunk az egyes csoportok tovább elemeztük a megfelelő parametrikus vagy nem parametrikus statisztika alkalmazásával SigmaStat statisztikai csomagot. A statisztikai szignifikancia meghatározása p≤0.05. Katalógusa

Eredmények katalógusa

WP1066 gyorsan Megszünteti foszforilált Y (705) STAT3 és indukálja foszforilációja ERK1 /2 AGS Cells katalógusa

A JAK- STAT útvonal és az ERK1 /2 útvonal a két fő jelátviteli utak folyásirányban gp130. Ez a két útvonal van kölcsönös és inverz szabályozó egymásra gyakorolt ​​hatásait, a legjobb bizonyítja az a negatív szabályozásában pSTAT3 után ERK1 /2 aktiválása [47].

WP1066 dózis-válasz kísérletet végeztünk kezelve AGS sejteket 0 , 1, 2 vagy 5 jiM WP1066 60 percig, és a mérő foszforilációját JAK2, STAT3, ERK1 /2 és SHP-2. Ahogy az várható volt, pJAK2 erősen gátolta WP1066 valamennyi koncentrációnál teszteltük és > 80% 5 jim. 5 uM WP1066 is adott maximális gátlását pSTAT3 és kölcsönös aktiválását pERK1 /2 (1A.), A csökkentés összesen STAT3 5 uM, vagy ennél magasabb koncentrációban (az adatokat nem mutatjuk be). Egybeesik a növekedése pERK, pSHP2 aktivációt dózisfüggően fokozott után WP1066 Administration (1A.).

az idő-Természetesen tanulmányok, AGS sejteket kezeltünk 0-360 percig, 5 uM WP1066 és foszforiláció JAK2, STAT3, ERK1 /2 és SHP-2 analizáltuk Western blottal (ábra. 1B). WP1066 kezelés eredményezte gyors gátlását pJAK2, egy 75% -os csökkenés 30 perc és legfeljebb 90% -os csökkenés 60 min. Ezután a kinyert sejtek, és visszatért a bazális JAK2 foszforilációs 360 min. A minta a csökkent STAT3 aktiváció tükrözte JAK2 foszforilációs. Ezzel ellentétben, az ERK1 /2 foszforiláció jelentősen emelkedett válaszul WP1066 kezelésre, egy 250% -os növekedés 15 perc, és egy maximális 460% -os növekedés 60 perc, mielőtt visszatért a bazális szintre 360 ​​min. SHP2 aktiválás szorosan követte változásokat ERK kifejezést a maximális indukció 60 min. Katalógusa

WP1066 Gátolja AGS Növekedés elnyomása proliferációs és apoptózis katalógusa

Az aktivált STAT3 Megállapított vezető humán gyomorrák sejt növekedését és osztódását [5], és az elhúzódó aktiválását az ERK1 /2 apoptózist indukál a gyomorsav hámsejtek [25]. Miután kimutattuk, hogy WP1066 szabályozza STAT3 és ERK1 /2 jelátviteli kölcsönös divat azt teszteltük, hogy ez is megzavarjuk a sejtnövekedést és apoptózist indukál a AGS sejteket. Katalógusa

kezelése AGS sejtek 5 nM WP1066 (2A. ) eredményezett jelentős csökkenéséhez sejtszám viszonyítva DMSO kontrollokban (DMSO, 100% ± 3,14 vs. WP1066; 36.02% ± 3,18, p < 0,05). Annak meghatározására, hogy ez a csökkenés a sejtszám volt köszönhető, hogy megváltozott a sejtproliferációt vagy apoptózis, vagy a kettő kombinációja, CFSE és az Annexin V festést végeztünk a kezelt sejtekben. AGS kezelt sejtek WP1066 arra intenzívebben jelölt CFSE mint a DMSO-val kezelt, egyértelműen csökkent a száma sejtosztódás és ezért proliferáció (ábra. 2B). Továbbá, nagyobb arányban a AGS kezelt sejtek WP1066 jelöltünk Annexin V (2C ábra), mint a sejtek DMSO-val kezelt, kimutatva, hogy a WP1066 is indukált apoptózist AGS sejtekben (WP1066; 1,3-szeres növekedést; p = 0,049).

WP1066 Blocks gyomor tumor növekedés a gp130 ^{757FF egerek által visszaszorításáról tumor sejt proliferáció és fokozása apoptózis katalógusa}

gp130 ^{757FF egerek fejleszteni gyomor distalis tumorok jellemzi emelkedett gyomor IL-11 hajtott STAT3 aktiváció [12], [13]. Mivel pJAK2 és p-STAT3 blokkolja a WP1066 in vitro katalógusa azt teszteltük, hogy WP1066 is blokkolja gyomor tumor kialakulásának in vivo katalógusa. Kezelése gp130 757FF egerek hetente 3-szor, 2 hétig 10-20 mg /kg WP1066 jelentősen csökkent gyomor tumor növekedését 47% -tól 42,11 ± 3,21 mm 2-22,36 ± 3,64 mm 2 ( p < 0,05) (ábra. A 3A-D). DMSO kezelt tumorok nem különbözik a megfigyelt tumorok 8 hetes egereknek, az életkor, amikor WP1066 kezelés megkezdődött, amely megerősíti, hogy a gyomor tumor növekedését viszonylag stabil 8-10 hétig [27], és hogy a WP1066 kezelés valóban okoz tumor regresszió helyett stasis (ábra. a 3A-D). katalógusa}

Annak megállapításához, hogy elterjedése megváltozott a gyomor tumorok, Ki-67 pozitív sejt /mirigy mennyiségileg a kezelt csoportban. WP1066 kezelés szignifikánsan csökkentette a gyomorsav hámsejtek proliferációját (DMSO 62 ± 7,7 vs WP1066 41,6 ± 6,5 Ki-67 festett sejt /mirigy, p < 0,05; ábra. 3E-G) igazolja, hogy WP1066 képes gátolni a tumornövekedést gátlása sejtproliferációt. Hatásának értékelésére a WP1066 tumorsejt apoptózis szakaszok a WP1066 vagy DMSO-val kezelt kohorsz festettünk elleni antitest hasított kaszpáz 3, a marker apoptotikus sejthalál (ábra. 3H, I). Szignifikánsan több apoptotikus profilok WP1066 kezelt tumorok, mint a kontrollok, bizonyítva egyértelműen pro-apoptotikus hatását WP1066 (WP1066 25,25 ± 5,32 vs. DMSO 2,65 ± 0,76 festett sejt /mm ^{2 nyálkahártya, p < 0,05; Fig. 3J ).}

WP1066 kifejezetten a JAK2 és STAT3 foszforilációja elnyomni Gyomor tumorgenesisben a gp130 ^{757FF egerek katalógusa}

Mivel gp130 ^{757FF egerekben tumorokat válaszul konstitutív gp130 aktiválás [20] , megvizsgáltuk, hogy WP1066 elfojtott downstream jelátviteli utak in vivo.
WP1066 kezelés 2 hétig eredményezte 25% -os csökkenést a relatív mennyisége a teljes STAT3 az antrális nyálkahártya képest DMSO kezelt csoportokban (4A.) . Az összeg a teljes JAK2, AKT és ERK1 /2-t nem változott WP1066 kezelést. Ez arra utal, hogy a krónikus kezelés gp130 757FF egerek WP1066 elnyomja expresszióját STAT3.}

immunoblot elemzését jelátviteli aktiválás bizonyította jelentős csökkenését pJAK2 (80,12% ± 5,70 DMSO kontroll), pY705 STAT3 (26.84 % ± 7,2 DMSO kontroll mutatja be. 4B) és pERK1 /2 (72,66% ± 5.23.of DMSO kontroll mutatja be. 4B). AKT foszforiláció nem módosította WP1066 kezelést. Csökkentett aktiválása JAK2 és STAT3 összhangban van a in vitro katalógusa adatokat és az ismert akciók WP1066. Katalógusa

WP1066 elnyomta a gyulladásos válasz az antrális nyálkahártya gp130 ^{757FF Egerek katalógusa}

Mivel a krónikus gyulladásos választ a gyomor kulcsfontosságú tumor fejlődését [27], azt vizsgáltuk, hogy része a hatásmechanizmusának WP1066, hogy elnyomják a STAT3-mediált gyulladásos választ, amely általában hozzájárul a daganat progresszióját. Szövettani analízis kimutatta, hogy polimorfonukleáris beszivárgása az antrum a WP1066 kezelt egerek szignifikánsan kevesebb, mint a kontroll egerekben (ábra. 5A; DMSO 2,45 ± 0,24 vs WP1066 1,46 ± 0,22, p < 0,05), míg a lymphoplasmocytás infiltrátum között nem volt különbség a két csoportok (ábra. 5B; DMSO 1,73 ± 0,16 vs WP1066 1,32 ± 0,20, p 0,05).

Mivel gyomor gyulladás tipikusan által közvetített egy kisszámú kulcsfontosságú proinflammatorikus citokineket és enzimeket, mértük az expressziós egy kiválasztott csoportja ezeknek a Q-PCR DMSO és WP1066-kezelt gyomor. Expression of összes pro-gyulladásos mediátorok, kivéve a IFNg, TNFa és az iNOS szignifikánsan gátolta WP1066 kezelés a következők; IL-6 (ábra. 5C; 6,0 ± 2,6-szeres), IL-11 (ábra. 5D; 8,7 ± 3,4-szeres), IL-1α (ábra. 5E; 10,9 ± 4,3) szeres), IL-1β (ábra. 5F; 3 ± 0,9-szeres) és COX2 (ábra. 5G; 2,94 ± 1,05). Ezért WP1066 gátlása STAT3 aktivitás és a tumor progresszióját volt részben a csökkentett polymophonuclear beszivárgás és csökkentett STAT3-függő transzkripciós pro-gyulladásos IL-6, IL-11, az IL-1α, IL-1β és COX2 géneket.

WP1066 gátolta a kifejezése amfiregulin az antrális nyálkahártya gp130 ^{757FF Egerek}

a hatás a WP1066 kezelés a kifejezés a növekedési faktor ligandumok ismert, hogy szerepet játszanak a növekedési és differenciálódási a gyomor és a fejlesztés gp130 ^{757FF daganatok is értékelték. WP1066 gátolta a kifejezés a amfiregulin (1,85 ± 0,60-szeres, p < 0,05), de nem a HB-EGF (ábra. 6) az antrum nyálkahártyájában kezelt egerekben. Ezen túlmenően, a gyomor proliferatív ligandum és a STAT3-szabályozott gén REG1 mutatott erős gátló tendenciát után WP1066 kezelés összehasonlítva a DMSO-kontroll antrum (ábra. 6; p = 0,069).}

Discussion

Ebben a tanulmányban azt mutatják, hogy a WP1066 dózisfüggő gátolja a JAK2 /STAT3 jelátviteli humán gyomorrák (AGS) sejtek, és ennek következtében 60% -kal csökkent a sejtburjánzást, és kisebb mértékű apoptózist. Ennek mechanizmusa valószínűleg köszönhető, hogy a kettős gátlás foszforilált formáinak JAK2 és STAT3 ezáltal csökkentve a STAT3 transzkripciós aktivitás, kimutatták számos rákos sejtvonalak, beleértve a glióma [17], [28], [29], myeloid leukémia [ ,,,0],30], és a melanoma [20]. Másrészt, WP1066 alkalmazás eredményezte kölcsönös növekedését az ERK1 /2 aktiváció egybeesik fokozott pSHP2, a foszfatáz aktiválásáért felelős a Ras /MAP-kináz jelátviteli. Egy hasonló megfigyelés tekintetében ERK aktiváció történt más rákos sejtvonalakban származó vese-karcinóma [18], és glióma [28]. Ezért a határokon-szabályozás a STAT3 és ERK jelátviteli downstream az IL-6 családhoz tartozó citokin tűnik gyakran fordulnak elő olyan tartományok szövetek és sejtvonalak [31].

WP1066 is hatásos volt, amikor adott in vivo
, ahol blokkolt STAT3-aktiválást (75%) a gp130 ^{757FF egér antrális tumorok, és szintén csökkentette a teljes STAT3 fehérje, ami arra utal, hogy ez csökkentheti kifejezése a Stat3
gén gyomor kezelt egerekben. Ezt támasztja alá a létezését konszenzus helyek aktivált STAT3 kötelező a Stat3 katalógusa promoter, aktiválásával a Stat3 katalógusa gén mutáns igazolni Stat3 katalógusa promoter-riporter konstrukciók és EMSA [48] vagy a chip-SEQ [49], és azt sugallja, hogy WP1066 gátolhatja autokrin aktiválását STAT3 után gátlása JAK2 /STAT3 foszforiláció.}

Ahogy az várható, pJAK2 szintet is csökkentette a jelenlétében WP1066 a gyomorban. Ezzel szemben a hatása WP1066 in vitro,
ERK1 /2 aktiváció gyomor WP1066 kezelt egerek enyhén csökkent. Ennek oka az egyenlőtlenség lehet két szeres; Először is, a in vivo katalógusa expozíció WP1066 volt krónikus képest akut expozíció esetén in vitro katalógusa; másrészt expozíció esetén in vivo katalógusa bonyolultabb, több potenciális jelátviteli utak felhasználásával közös jelátviteli molekulák. Ennek ellenére a csökkent aktiválása JAK2 és STAT3 összhangban van a megállapított szerepét ezen citokin /növekedési faktor jelátviteli komponensek gyomorrákban progresszió [5], [27] és azt bizonyítja, hogy a in vivo katalógusa és amikor izolált hatásait H.pylori
fertőzés, akkor túlnyomórészt megváltozott aktiválása STAT3, és nem ERK1 /2, hogy alapvető fontosságú a daganat fejlődését.

egybeesőén gátlása STAT3 aktivitás alkalmazása WP1066 csak 2 hétig in vivo
eredményezte 50% -os csökkenést tumor terület kíséri hasonló csökkenése proliferációs mérve a Ki-67 festődés, és egy ezzel együtt járó növekedése tumorsejt apoptózis által mért aktivált kaszpáz-3 immunfestést. Ez a gátlás a tumor növekedés párhuzamosan a > 40% -os csökkenése a polimorfonukleáris sejtek számának, és a fel-regulációja társult proinflammatorikus citokinek, beleértve az IL-1α, IL-1p, valamint COX2, amelyek mind elősegítik a gyomor tumorgenesisben. Másrészt WP1066 nem volt hatása az IFNy, TNF, és az iNOS expresszió arányos a hiánya csökkenése limfociták és makrofágok (lymphoplasmocytás infiltráció) felett a kezelési idő-természetesen. A gátlás az IL-1β után pSTAT3 gátlása WP1066 különösen jelentős, mert az IL-1β egy fontos szabályozója a gyomorsav-szekréciót, egy potens promotere tumornövekedést egy transzgén egér modelljében a gyomorrák [33], és szerves részét a NLRP3 inflammasome [32]. Az IL-11 ismert, hogy egy endogén stimulátora antrális IL-1β expresszióját keresztül STAT3 [13], és kimutattuk, hogy itt az IL-11 gátolja az WP1066. Mivel az IL-11 úgy tűnik, hogy upstream IL-1β a gyomorban, akkor ez egy plauzibilis útvonal biztosít ez utóbbi gátlása után blokád STAT3 aktivációt.

A gátló hatásait WP1066 a gp130 ^{757FF egérmodelljében gyomorrák, összegezni és kiterjeszti az eredményeket a STAT3 haploinszufficiencia generált genetikailag ugyanabban egér modell [26], valamint a használatát szisztémás elleni antiszensz oligonukleotidok, STAT3, [12] és ezzel kiemelte annak fontosságát, hogy aktivált STAT3 jelátvitel megkönnyítése gyomor tumorgenesisben. Tekintettel az IL-11 előmozdításában tumor kialakulása és fejlődése [12], [13], és az IL-6 elősegítésében helyi polimorf beszivárgás [34] A gp130 757FF egér, fontos megjegyezni, hogy WP1066 hatékonyan csökkentette a expressziós szintje egyaránt citokinek egybeeső megfordulását a tumor növekedését. Ez alátámasztja azt a nézetet, hogy STAT3 transzkripcióját szabályozó mind az IL-11 és IL-6, lehetőleg hajtja autokrin visszacsatolási hurkok, mivel mind a citokinek preferenciálisan hasznosítani STAT3 transzkripciós a gyomorban [23].}

REG1 egy széles körben elosztott tagja a Reg gén család és egy ismert gyomor növekedési faktor, ami kiemelkedő szerepet játszik, mint egy proliferatív és anti-apoptotikus szabályozó a gyomorban mindkét egerekben [26], [35] és emberekben [36]. Korábban már kimutatták, hogy a REG1 erősen indukálódik antrális tumorok gp130 ^{757FF egerek egybeessen az IL-6 és IL-11-expresszió, és hogy haploinszufficiencia a STAT3 eredményez csökkentett expresszióját REG1, ami arra utal, hogy ez egy a STAT3-szabályozott gén [26]. Ezt megerősítették a gyomor sejtvonalak, ahol az IL-11 [37] és az IL-6 [36] stimulált STAT3 foszforiláció, ami viszont aktivált REG1 transzkripciót.}

• PLoS One: CD147 expressziója humán gyomorrák összefügg a tumor kiújulása és a Prognózis
• PLoS One: A MAP3k1 SNP jósol Survival gyomorrák egy kínai népesség