PLoS ONE: N-terminalas polipeptidas aneksino A2 Sumažina Infekcija Mycoplasma hyorhinis skrandžio vėžio Cells

Anotacija

Mycoplasma infekcijos žmogaus ir jo tarša ląstelių kultūrų yra pasaulio problemų. Šiuo metu turimi prevencijai arba gydymui Mycoplasma infekcijos narkotikai kenčia nuo žemo jautrumo, stiprus atsparumas ir didelio toksiškumo. Mūsų Darbo parodė, kad , Mycoplasma hyorhinis
( M
. hyorhinis
) infekcija buvo tarpininkaujant tarp 37 psl yra m
sąveika. hyorhinis parsisiųsti ir aneksino A2 (ANXA2) nuo šeimininko ląsteles, tačiau Pritaikymo vertė šio mechanizmo buvo nežinoma. Čia mes susintetinti N-terminalą ANXA2 polipeptido (A2PP) ir nustatė, kad A2PP gali sumažinti m
infekcija. hyorhinis
skrandžio vėžio ląsteles ir blokuoti M pervežimas. hyorhinis
infekcija sukelta ląstelių migracija. Be to, mes nustatėme, kad A2PP gali sumažinti , m
. hyorhinis
tarša plaukimo ląsteles. Be to, palyginti su komerciniais antibiotikų dažniausiai naudojamų ląstelių kultūroje, kad būtų išvengta , m
. hyorhinis
infekcija, A2PP parodė daugiau efektyvumą, bet mažą toksiškumą ląstelių augimą. Taigi, mūsų tyrimas pirmą kartą atskleidė A2PP potencialo gydymui ir profilaktikai m
. hyorhinis
infekcija

nurodomoji dalis:. Juanis S Qu L, Šou, C (2016) N-terminalas polipeptidas aneksino A2 Sumažina infekcija, Mycoplasma hyorhinis
skrandžio vėžio ląsteles , PLoS ONE 11 (1): e0147776. Doi: 10,1371 /journal.pone.0147776

redaktorius: Gernot Zissel, Universitätsklinikum Freiburgas, Vokietija

Įstojo: Spalio 16, 2015; Priėmė: Sausis 7, 2016 m Paskelbta: Sausis 26, 2016

Visos teisės saugomos: © 2016 juanių et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Duomenų prieinamumas:. Visa reikalinga duomenys yra per popieriaus. Mikrogardeliq duomenys buvo pervestas į NCBI genų ekspresijos Omnibus (GEO) (stojimo no.GSE73777)

Finansavimas:. Finansuojamas Nacionalinis gamtos mokslo fondo Kinijos (81.572.532). http://www.nsfc.gov.cn/publish/portal1/. SLS gavo finansavimą. Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

patogeniniai mikoplazmos, įskaitant Mycoplasma pneumoniae ( M
. , pneumoniae,
), mikoplazmos hyorhinis (, m
. hyorhinis
), burnos Mycoplasma (, m
. Orale
) ir Mycoplasma genitalium (, m
. genitalium
), priklauso klasės mollicutes, kuris yra mažiausias mikroorganizmai gyvenamasis pobūdžio ir negali dubliuoti nepriklausomai [1-2]. Daugelis tyrimų parodė, kad infekcija šių mikoplazmų buvo susijęs su naviko vystymosi [3-8]. M
. Orale
sukelia chromosomų mutacija žmogaus diploidinių ląsteles ir skatina ląstelių transformaciją [6]. Infekcija m
. hyorhinis
arba M
. genitalium
gali padidinti migracijos ir invaziškumo prostatos epitelinių ląstelių [3]. M
. hyorhinis
infekcija buvo susijęs su artritu, serositis, nevaisingumas ir vėžys žmogaus [9-12].

Be to, mikoplazmos tarša ląstelių kultūroje yra rimta problema ir plaukimo ląstelių lygis užsikrėtę mikoplazmas yra didelis. Ląstelių kultūros yra plačiai naudojamas gamtos mokslų, pavyzdžiui, pagrindinio tyrimų, klinikinių tyrimų tyrimų, plėtros ir gamybos biologinių produktų, taip pat kaip ir biofarmacijos ir vakcinų gamybos srityje. ląsteles apsaugantis nuo užteršimo mikrobais yra labai svarbus siekiant užtikrinti, kad mokslinių tyrimų kokybę. Mycoplasma užteršimas yra labiausiai paplitusi problema ląstelių kultūroje su 30% -60% [1] dažnis. Buvo parodyta, kad keturi rūšių mikoplazmų sudaro daugiau kaip 95% infekcijos ląstelių kultūroje, įskaitant M
. Orale
, argininas Mycoplasma (, m
. arginini
) M
. hyorhinis
ir Levinas jokių acholeplasma (
. laidlawii
) [13,14,15,16]. Dėl mažo dydžio, mikoplazmos vargu ar galima rasti pagal šviesos mikroskopu, ir yra lengvai ignoruojami mokslininkų. Pastaraisiais metais daug antibiotikų, naudojamų Mycoplasma gydymo pakartotinai lėmė pasipriešinimo Mycoplasma atsiradimą. Dėl šių priežasčių būtina vystyti naujas agentai užkirsti kelią arba sumažinti Mycoplasma infekcijos.

Mūsų Darbo parodė, kad m
. hyorhinis
infekcija priklauso nuo 37 psl sąveikos (pagrindinis membranos baltymu, M
. hyorhinis
) ir priimančiosios ANXA2 per savo n-terminalas srityse. Mes taip pat nustatė, polikloninį antikūną 37 psl galėtų blokuoti m
infekcija. hyorhinis parsisiųsti ir sumažėjimas M
. hyorhinis
-promoted migracija skrandžio vėžio ląstelių [17]. Remiantis šių atradimų, mes iškėlė hipotezę, kad peptidas, sintetinami aminorūgščių sekos ANXA2 N-galo srities (nuo 1 ^{st 30 -oji aa, čia mes pavadintas šį peptidą kaip A2PP), gali blokuoti , m
. hyorhinis
infekcija per savo konkurencijos su ANXA2 ir galbūt būti naudojamas kaip vaistas prevencijos m
. hyorhinis
infekcija ląstelių kultūroje. Šiame tyrime mes patikrinome šią hipotezę, taip pat palygino A2PP poveikio kitų narkotikų prevencijos m
. hyorhinis
infekcija.}

Medžiagos ir metodai

ląstelių kultūros

AGS skrandžio vėžio ląstelių linija buvo iš Amerikos tipas kultūros kolekcija (ATCC). BGC823 skrandžio vėžio ląstelių linija buvo įkurta Pekino universiteto Liaudies ligoninėje ir buvo įsigytas iš ląstelių kultūros centras Kinijos medicinos mokslų akademijos (Pekinas, Kinija). MAA ir BGC823 ląstelės buvo auginamos RPMI-1640 vidutinio papildytas 10% serumas iš veršiuko embriono, gautų iš Invitrogen (Carlssbab, CA, JAV). Mikoplazmos tyrimas buvo įgyvendintas prieš kiekvieną naują eksperimentą PGR amplifikacija m
. hyorhinis 37 psl
.

Mycoplasma Paplitimas ir bendradarbiavimo kultūros

Mycoplasma dauginimas ir bendro kultūra buvo atliktas kaip buvo pranešta anksčiau [17,18,19].

antikūnai ir reagentai

Anti-37 psl monokloninis antikūnas PD4 buvo sukurtas ir pasižymi anksčiau [5,20,21]. Polikloninis prieš 37 psl antikūnų buvo gauta iš imunitetui triušį su PVM-37 psl susiliejimo baltymo po įprastiniame protokole. Anti-EGFR ir anti-PHOSPHO-EGFR buvo įsigytas iš mobiliųjų Signalizacijos technologijos (CST, JAV). Anti-ANXA2 buvo iš Novus biotechnologijos (Novus Biotechnologijos, JAV). Anti-PHOSPHO-ANXA2 buvo iš Santa Cruz (Santa Cruz, CA, JAV). A2PP (1 ^{St 30 -asis aa) ir įvairių elektroniniai A2PP peptidai, įskaitant A2PP-Nd4 (5 -osios iki 30 -asis AA), A2PP-Nd8 (9 -osios iki 30 -asis aa), A2PP-Nd12 (13 RD 30 -asis aa), A2PP-Nd16 (17 -osios iki 30 -asis aa), A2PP-CD4 (1 St 26 -asis aA), A2PP-CD8 (1 St 22 -asis aa), A2PP-Cd12 (1 St 18 -asis aA), A2PP- CD16 (1 St 14 -asis aa), kartu su atsitiktinių kontrolės peptidų (ConP) buvo susintetintas Sbsbio (Pekinas, Kinija). Antimikrobinės medžiagos Mycoplasma aš (MYCO aš) ir Mycoplasma II (MYCO ii) buvo nupirkta iš M & C genų technologijos (Pekinas, Kinija). Ciprofloksacinas (KIP) buvo iš Double-Crane Pharm (Pekinas, Kinija).}

aptikimas m
. hyorhinis
pagal kiekybine PGR (qPCR)

DNR buvo išskirta iš AGS arba BGC823 ląstelių po M
. hyorhinis
infekcija DNR lizės buferiniame tirpale (50 mM Tris pH 8,5, 1 mM EDTA, 0,5% Tween-20, ir 200 mg /l proteinazės K) pagal standartinį protokolą. qPCR buvo atliktas su 30 ng DNR ir SYBR Žalioji Realaus laiko PGR 2 × premikso komplektas (Takara, Otsu, Japonija), naudojant One Step sistemą nuo ABI (Foster City, CA, JAV). Reakcijos programas ir , 37 psl
specifinę gruntai (pirmyn: 5'-TATCTCATTGACCTTGACTAAC-3 'Reversas: 5'-ATTTTCGCCAATAGCATTTG-3 ") anksčiau [22] pranešė. Norėdami palyginti, m
. hyorhinis
DNR koncentracija ląstelių GAPDH
(pirmyn: 5'-TGAAGGTCGGAGTCAACGG-3 ", Reversas: 5'-CCTGGAAGATGGTGATGGG-3) buvo papildyta kaip kontrolės ir duomenys buvo analizuojami naudojant 2 ^{-ΔΔCt metodas. Gruntai buvo sintetinamas Sangon (Šanchajus, Kinija).}

Imunoblotingo

Ląstelės buvo nuimta nuo kultūros patiekalas su 2 × SDS pakrovimo buferio. Poliakrilamido gelyje elektroforezės (SDS-PAGE) ir imunoblotingu buvo atliekamas kaip aprašyta anksčiau [23].

Mobilusis IFA

96-gerai buvo pasėjamos su ląstelėmis (1 × 10 ^{4 /gerai), po gydymo nurodytų peptidų ir infekcijos m
. hyorhinis
už 24 val. Ląstelės buvo imobilizuota su 0,05% gliutaraldehidu 10 min, tada CELL IFA buvo atliktas taip, kaip aprašyta anksčiau [24].}

kietosios fazės Prisirišimo tyrimo ir išskleidžiamajame Analizės

Rekombinantinis PVM-37 psl ir GST baltymai buvo sukurtas ir išgrynintas, kaip aprašyta anksčiau [17]. GST-37 psl ir GST buvo praskiestas buferiniame tirpale (0,1 M Na _{2CO 3, 0,1 M NaHCO 3, pH 9,6) ir padengtas 96-šulinėlių plokštelėse, esant 4 ° C temperatūroje per naktį. Plokštelės buvo plaunamas PBS tris kartus ir užblokuotas 5% nugriebto pieno /PBS esant kambario temperatūroje (RT) 2 val. Po plovimo su PBS, nurodyta koncentracija biotino-konjuguoto A2PP (sintetina Sbsbio) buvo pridėta ir inkubuojami kambario temperatūroje 2 val. Po plovimo su PBST 3 kartus, streptavidino-konjuguoto HRP (Baltimore Pike, Vakarų Grove, Pensilvanija, JAV) buvo pridėta ir inkubuojami kambario temperatūroje 30 min. Po nuspalvinimo su Ortho-fenilendiaminų (sigma), optinis tankis, esant 490 nm (OD490) buvo užfiksuota su microplate skaitytuvas (Bio-Rad 550). Dėl išskleidžiamajame tyrime, 100 ng PVM-37 psl arba PVM baltymas buvo bendrai inkubuojami 20 mkm biotino-A2PP ir avidino karoliukai (GE Healthcare ", Pittsburgh, PA, JAV) privalomas buferį (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5% NP-40, 0,5 mM DTT, 1 mM PMSF ir 1 × pilnas proteazės inhibitorių), esant 4 ° C temperatūroje per naktį. Nuosėdos plaunamos privalomu buferio keturis kartus ir analizuojami imunoblotingo.}

Bendras Imunoprecipitacijos

, m
. hyorhinis
užkrėstose ląstelėse (BGC823 arba AGS) buvo homogenizuoti lizuojančiame buferyje (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 1 mM PMSF ir 1 × pilnas proteazės inhibitorių), esant 4 ° C temperatūroje 10 min. Po to, kai 12, 000 g centrifuguojama, esant 4 ° C 10 min, supernatantų, buvo išskirti. Baltymų fragmentai (500 mikrogramų) inkubuojami 20 mikromolių A2PP ar ConP 1 mikrogramų prieš ANXA2 plius baltymai g Sefarozę karoliukai (GE Healthcare) esant 4 ° C temperatūroje per naktį. Iš anksto-imuninė IgG (1 mikrogramų) buvo naudojamas kaip kontrolės. Nusodintas karoliukai buvo plaunami lizės buferio keturis kartus, išplaunami 2 × pakrovimo buferis, kaitinti, ir analizuojami imunoblotingo.

Imunofluorescentinis Analizės

Ląstelės buvo pasėjamos į coverslips ir kultūringas naktį. Kitą dieną, ląstelės buvo gydomi nurodytų peptidų ir užsikrėtę M
. hyorhinis
už 24 val. Tada ląstelės buvo išplauti su lediniu PBS tris kartus, nustatyta iš 4% paraformaldehido 15 min kambario temperatūroje. Po blokavimo 1 val 5% BSA /PBS, ląstelės buvo inkubuojamos su nurodytų antikūnų kambario temperatūroje 1 val. Be to, ląstelės buvo plaunamas 3 kartus vėl su PBST ir inkubuojami su FITC arba TRITC-pažymėtas antrinis antikūnų 30 min kambario temperatūroje. Taip plovimo su PBS ir counterstaining su DAPI, ląstelės buvo montuojamas ant 50% glicerolio /PBS. Zeiss LSM780 mikroskopas (ZEISS Microsystems "," Oberkochen, Vokietija) buvo naudojamas stebėti nurodytų baltymų lokalizacija.

Mobilusis Migracijos Analizės

Transwell kamera su 8,0 mkm porų membranomis (Corning, NY, JAV) buvo naudojamas ląstelių migracijos tyrimu. Apatinė kamera prisipildė 800 pL terpė su 10% FBS kaip chemoattractant. Ląstelės buvo sumaišymo vidutinio serumo be kurių sudėtyje yra m
. hyorhinis
plius A2PP arba ConP, tada buvo kruopščiai perkeliamas ant viršutinio kameroje kiekvieno Transwell aparatų tankio 2 × 10 ^{5 ląstelių /ml (120 pL /kamera). Ląstelės buvo leidžiama migruoti už 24 val 37 ° C temperatūroje. Viršutinio paviršiaus kiekvieną membrana buvo pašalinta ląstelių su medvilniniu tamponu. Ląstelės prasiskverbė į apatinės pusės membranos buvo nustatyti šaltame metanolio, nudažomi su 0,1% violetinei ir skaičiuojami devynių atsitiktinai pasirinktų mikroskopinių laukais viename šulinėlį. Kiekvienas mėginys buvo paruoštas arba trijų dalių kamerų ir kiekvienas eksperimentas buvo kartojamas bent 3 kartus.}

Mobilaus ryšio proliferacijos tyrimu

Skrandžio vėžio ląstelės buvo pasėjamos 96-šulinėlių auginimo plokštėmis tankio 5 × 10 ^{3/100 mikrol /gerai trimis egzemplioriais ir buvo gydomi nurodytuose reagentų. Ląstelių proliferacija buvo kiekybiškai ląstelių susiliejimo su CloneSelect Imager (molekulinė prietaisai, Sunnyvale, CA, JAV).}

mikrogardeliq analizė ir Real-Time AT-PGR

AGS ir BGC823 ląstelių ( 1 × 10 ^{6 per 10 cm, 2 plokštelės) buvo gydomi A2PP, KIP, MYCO I ir MYCO II 24 hr, išplauti PBS ir nuimamas Trizol reagento. RNR mėginiai buvo tiriami OE biotechnologijos (Šanchajus, Kinija) naudojant Affymetrix GeneChip ® PrimeView ™ žmogaus genų ekspresijos masyvo. Mikrogardeliq duomenys buvo pervestas į NCBI genų ekspresijos Omnibus (GEO) (stojimo no.GSE73777). Pirminiai duomenys buvo įrašyti naudojant Affymetrix GeneChip komandos vykdymą konsolės (versija 4.0, Affymetrix). Be to, Genespring programinė įranga (versija 12.5, Agilent Technologies) dirbo baigti pagrindinę analizę su neapdorotų duomenų. Norėdami pradėti su, žalias duomenys normalizavosi su RMA algoritmas. tada skirtingai išreikšti genai buvo nustatyti per kartų kaitą. Nustatyto tiekėjų ir žemyn reguliuojamų genų riba buvo kartų kaita ≥ 2,0. Vėliau, eiti ir KEGG analizė buvo taikoma pasirinkti iš genų, kurie susiję su ląstelės ciklo ir ląstelių apoptozę. Realaus laiko PGR buvo naudojamas patvirtinti apie microarray rezultatus ir atliekamas pagal gamintojų nurodymą (SYBR, TOYOBO). Ekspresijos lygis susijusių genų normalizavosi per GAPDH
ir 2 -ΔΔCT buvo naudojamas apskaičiuoti santykinę genų ekspresiją. Numatoma realiojo laiko RT-PCR pradmenys ( ATF
, pirmyn, 5'-GAGTGGCGACAGGATAGAGC-3 ", atvirkštinės, 5'-TTTAGCCTCCCTCCCTTAGC-3" DDIT3
, į priekį, 5 ' -GCGCATGAAGGAGAAAGAAC-3 ", atvirkštinio, 5'-ACCATTCGGTCAATCAGAGC-3" CEBPB
, pirmyn, 5'-AGCGACGAGTACAAGATCCG-3 ", atvirkštinės, 5'-AGCTGCTCCACCTTCTTCTG-3") buvo susintetintas Sangon <. Br>}

Statistinė analizė

duomenys buvo pateikti kaip vidurkis ± SD. Skirtumai buvo analizuojami ANOVA naudojant SPSS 11.0 programinę įrangą ir P < 0,05 buvo laikomas statistiškai reikšmingas.

mikrogardeliq inventorinį numerį

mikrogardeliq duomenys buvo pervestas į NCBI genų ekspresijos Omnibus (GEO) (prisijungimas Nr. GSE73777).

Rezultatai

A2PP neturi įtakos tai, gyvybingumu arba migracijos skrandžio vėžio ląstelių

siekiant įvertinti ANXA2 anketa N-galinio domeno vaidmenį M
. hyorhinis
infekcija, mes pirmiausia susintetinti A2PP peptidas atitinkantis N-terminalo ANXA2 (pav 1A). Biotinas paženklinti A2PP buvo įrodyta, kad būtent bendrauti su GST-37 psl kieto fazės privalomas tyrime (pav 1B) ir patraukite žemyn tyrimas (pav 1C). Pastebėjome, kad A2PP nebuvo paveikti AGS ir BGC823 ląstelių (pav 1d) morfologiją. Be to, jei koncentracija sudaro mažiau kaip 20 mikromolių, A2PP neslopina ląstelių proliferaciją (pav 1e), o tai rodo, kad A2PP turi minimalų toksiškumą ląstelių. EGFR buvo susijęs reguliuojant ANXA2 fosforilinimo [17,25,26], o A2PP neturėjo dėl phosphorylations arba baltymų lygius EGFR ir ANXA2 [pav 2A] poveikį. Be to, A2PP neturėjo d ÷ l AGS ir BGC823 ląstelių (pav 2b ir 2c) migracijos poveikį. Mobilieji lokalizacija ANXA2 reglamentuoja jo fosforilinimas, kuri yra svarbi jo funkcija [17,27,28]. Mes nustatėme, A2PP nepakeitė pavienių ląstelių tyri- mas lokalizacijos endogeninio ANXA2 (pav 2D). Šie rezultatai rodo, kad vien A2PP neturi įtakos piktybinių fenotipų ar EGFR ANXA2 signalizacijos skrandžio vėžio ląstelių poveikį.

A2PP sumažėjimai M
. hyorhinis
Infekcija

Mūsų Ankstesnis darbas parodė, kad N-terminalas ANXA2 tarpininkauja m
. hyorhinis
infekcija [17]. Kaip rodo ląstelių ELISA tyrimo rezultatas, mes nustatėme, kad m
. hyorhinis
infekcija buvo užblokuotas A2PP dozės priklausomu būdu į BGC823 ir AGS ląsteles, bet ConP gydytiems ląstelės buvo dar labai užsikrėtę M
. hyorhinis
(pav 3A). Šie rezultatai buvo remiamas qPCR tyrimai (pav 3b). Nuosekliai, A2PP taip pat sumažėjo baltymų lygius 37 psl baltymų Vakarų blotingo analizė (pav 3c ir 3d). Tuo tarpu lygiai phophos-AXNA2 ir phophos-EGFR užkrėstų ląstelių buvo žemyn reglamentuoja gydymo A2PP (pav 3c ir 3e), o iš viso lygiai AXNA2 ir EGFR buvo santykinai stabilios (pav 3C). Į imunofluorescenciniam analizės, A2PP buvo nustatyta, kad slopina , m
. hyorhinis
infekcija sukelta 37 psl kaupimas ir bendrai lokalizacija tarp 37 psl ir ANXA2 (pav 4a). Be bendro imunoprecipitaciją tyrimą su baltymų lizatuose iš m
. hyorhinis
infekuotų ląstelių, A2PP sumažėjo tarp 37 psl ir ANXA2 (pav 4b) sąveiką. Kartu šie įrodymai palaiko idėją, kad A2PP galėtų sumažinti , m
. hyorhinis
infekcija ir patvirtino mūsų ankstesnę atradimą, kad N-terminalas ANXA2 yra reikalinga tarpininkauti M
. hyorhinis
infekcija [17].

A2PP slopina M
. hyorhinis
indukuotų Migracijos

Mūsų ankstesni tyrimai parodė, kad m
. hyorhinis
infekcija gali skatinti migraciją skrandžio vėžio ląstelių [17, 23]. Šiame tyrime, pastebėjome, kad m
. hyorhinis
-promoted migracija skrandžio vėžio ląstelių nepaveikė ConP, bet buvo priklausomai nuo dozės slopina A2PP (pav 5A ir 5B). Šie rezultatai rodo, kad A2PP slopinamas m
. hyorhinis
indukuotų migracija, kuri buvo susijusi su jos gebėjimu sumažinti infekcijos skatinamas phosphorylations EGFR ir ANXA2 (pav 3c ir 3e).

A2PP turi Essential motyvas Sumažinti M
. hyorhinis
Infekcija

Jei apibūdinti kritinės motyvą A2PP, siekėme nustatyti, ar įvairių skintų peptidais A2PP (pav 6A) galėtų sumažina m
. hyorhinis
infekcija. Į qPCR analizės, A2PP ir elektroniniai peptidai A2PP-Nd4, Nd8, Nd12, CD4, CD8, ir Cd12 sumažintas m
. hyorhinis
infekcija skrandžio vėžio ląsteles, bet A2PP-Nd16 ir A2PP-CD16 nepavyko sumažinti , m
. hyorhinis
infekcija (pav 6B). Panašus modelis slopinimo buvo gauta iš Western blotingo metodu (pav 6C). Šie rezultatai rodo, kad konkrečiu motyvu A2PP egzistavimas yra labai svarbus dėl savo gebėjimo sumažinti m
. hyorhinis
infekcija. Toliau map pagrindinius sekas šio galimo motyvo, mes susintetinti du peptidai atitinkančius 11 ^{-osios -20 -asis AA (vadinti A2PP-10aa) ir 13 -osios -18 -asis aa (vadinami kaip A2PP-6AA) (pav 7A). Be qPCR tyrimą, abu peptidai gali sumažėti, m
. hyorhinis
infekcija (pav 7B), kuri parėmė Vakarų blotingo tyrime (pav 7c). Pažymėtina, kad slopinantis poveikis A2PP-10aa buvo geresni nei A2PP-6AA, bet abiejų peptidų poveikis buvo mažiau tvirtas kaip ir A2PP (pav 7B ir 7C). Thesefore, centriniai sekas (11 -osios -20 TH) ir A2PP gali būti esminis motyvas slopinti M
. hyorhinis
infekcija.}

palyginimas A2PP su kitais vaistais, užkertant kelią m
. hyorhinis
Infekcija

, m
. hyorhinis
buvo vienas iš pagrindinių taršos šaltinių ląstelių kultūros [13,14,15]. Geriausias būdas pašalinti , m
. hyorhinis
infekcija išmesti ląsteles ir greitai sterilizuoti visas kontaktuojančių laivus, tačiau kai infekuotų ląstelių negalėjo būti pakeistas keliais atvejais. Todėl būtina naudoti specialius antimikrobinių požiūrius užkirsti kelią arba panaikinti , m
. hyorhinis
infekcija. Būta įvairių antimikrobinių medžiagų prevencijos m
. hyorhinis
užkrėsti. Pavyzdžiui, ciprofloksacino (KIP) galėtų išnaikinti , m
. hyorhinis
tinkamoje koncentracijos [29]. Du antimikrobinių komponentai pavadintas kaip mikoplazmas aš (MYCO aš) ir Mycoplasma II (MYCO II) gali sumažinti M
. hyorhinis
infekcija blokuoja jo baltymų ir nukleino rūgščių sintezę. Tačiau kai rūpesčiai, tokie kaip mažo jautrumo, stiprus atsparumas ir didelio toksiškumo gali apriboti savo paraiškas ląstelių kultūroje. Remdamasi šiais argumentais, mes manome, kad yra būtina palyginti A2PP, KIP, MYCO I ir MYCO II efektyvumą užkertant kelią m
. hyorhinis
infekcija. Imunoblotingo metodu ir qPCR tyrimų, mes nustatėme, kad A2PP anketa slopinamasis poveikis m
. hyorhinis
infekcija buvo panašus į MYCO I, bet buvo geriau nei KIP ir MYCO II (pav 8A ir 8B). Įdomu tai, mes nustatėme, kad A2PP taip pat galėtų efektyviai pašalinti m
. hyorhinis
infekcija labai infekuotų ląstelių ištraukas procesą nuo P _{1 P 3 (pav 8C ir 8d). Be to, palyginti su MYCO I ir MYCO II, A2PP turėjo mažiau slopinantį poveikį ląstelių proliferaciją (pav 9A). Ištirti A2PP, KIP, MYCO I ir MYCO II anketa poveikį ląstelių proliferaciją mechanizmus, mes atliekame mikrogardeliq analizę ir patikrino keletą skirtingai išreikštas genų A2PP, KIP poaibį, MYCO I ir MYCO II elgiamasi ląsteles. Kiekybinė PGR analizė parodė padidėjusią raišką apoptozės susijusių genų ( ATF5
DDIT3
CEBPB
) iki MYCO I ir gydymo MYCO II, bet mažai pokyčių buvo pastebėta A2PP ir CIP grupes (pav 9b). Šie rezultatai rodo, kad A2PP turi mažiau toksiškumą ir geriau prevencinių potencialą blokavimo M
. hyorhinis
infekcija išaugintų ląstelių.}

Diskusijos

Mycoplasma infekcijos ir užterštumas vis dar paplitusi šiandien ir atnešti didelę riziką pacientams ir mokslinių tyrimų kokybę. Pastaraisiais metais, keletas tyrimai parodė, kad Mycoplasma infekcija taip pat buvo susijęs su tumorigenezei [3-8]. Mycoplasma infekcijos gali sukelti DNR pažeidimus, įtakos genų ekspresiją ir sutrikdyti ląstelės ciklo kontrolės punkto ir Apoptozė atsakymą [30]. M
. hyorhinis
buvo rasta 56% skrandžio vėžio, 55,1% iš storosios žarnos vėžio ir 39,7% krūties vėžio audiniuose [20]. Be to, serologinis tyrimas parodė, kad 36% gerybinė prostatos hiperplazija (GPH), o 52% prostatos vėžio audiniuose buvo M
. hyorhinis
teigiamas [4]. Šie tyrimai rodo galimą ryšį tarp m
. hyorhinis
infekcija ir navikų [4,20] įvykis. Kas daugiau, atsižvelgiant į ląstelių kultūros proceso, dažniausios taršos šaltiniai yra mikoplazmos, bakterijos ir pelėsiai, tačiau užterštumas norma mikoplazmas yra gana didesnis [13]. Rezultatai nuo įvairių grupių parodė, kad Mycoplasma užteršimo svyravo nuo 15 iki 80% norma, kai kurie net pasiekė 100% [15,31]. DNR sekų analizė nuo 1000 genomų projektas reiškė, kad 7% mėginių buvo užteršti mikoplazmas [32]. Tačiau užkirsti kelią Mycoplasma infekcijos ir užteršimo yra sunku. Pirma, dėl pleomorfinės, plastiškumas, filtravimo ir lengvai tirpsta, mikoplazmos gali praeiti pro mikrofiltracijos membrana lengvai, teikiant jiems egzistuoti priimančiosios ląstelės paviršiaus arba būti patenka endocitozės būdu ląstelių [1,13,33]. Antra, mikoplazmos trūksta ląstelių sieneles, padaryti jas nejautrus antibiotikų, kurie slopina ląstelės sienelės sintezę, pavyzdžiui, penicilinui. Efektyvūs antimikrobinės medžiagos padaryti egzistuoja, tačiau jų nuolatiniai prašymai ląstelių kultūroje nerekomenduojama, nes toksiškumą ląstelių. Galiausiai, mikoplazmos yra netipiniai bakterijos, todėl difficulities į teisingą diagnozę [34].

Daugelis prieš Mycoplasma narkotikai buvo sukurta, pavyzdžiui, eritromiciną, Leucomycin, Roxithromycin, ofloksacino, ciprofloksacinu. Tačiau neigiamas poveikis, toksiškumas ir atsparumas vis dar atnešti problemų dėl taršos mažinimo [10,11,35-38]. Be to, nuolat vartojant šių antibiotikų gali ne visiškai pašalinti Mycoplasma daugiau vienos ar net savaičių [39,40]. Todėl labai svarbu rasti naujų būdų, kad galėtų veiksmingai ir laiku išnaikinti Mycoplasma infekcijos ar užkrėtimo. Sprendimas šio tikslo tikriausiai galima rasti per molekulinius mechanizmus pagrindinių Mycoplasma infekcijos apibūdinimą.

Mūsų Ankstesnis tyrimas nustatė, kad 37 psl baltymo AXNA2 tarpininkaujant sąveika, M
. hyorhinis
infekcija [17]. Šiame tyrime mes pirmiausia susintetinti N-terminalo polipeptido iš ANXA2 (A2PP) ir patvirtinti savo specifinę sąveiką su PVM-37 psl baltymų kietosios fazės privalomas ir avidino iškleidžiamuoju tyrimai. Įkvėptas tokios sąveikos, mes stebėjomės, ar A2PP gali slopinti infekcijos m
. hyorhinis
. Mes nustatėme, kad A2PP tinkamu koncentracijos (20 mkm), sumažėjęs , m
. hyorhinis
infekcija, slopino infekcija skatinamas migracija, ir sumažinta infekcijos išprovokavo EGFR ir ANXA2 phosphorylations skrandžio vėžio ląsteles. Šie poveikiai buvo susiję su sumažėjusiu sąveikos 37 psl ir ANXA2. Reikia pažymėti, kad vien A2PP eksponuojami minimalius poveikį ląstelių proliferacija ir phosphorylations EGFR ir ANXA2, tai rodo, kad A2PP gali būti naudinga reagentas sumažinti m
. hyorhinis
infekcija. Ši sąvoka parėmė palyginimų A2PP s ir komercin ÷ antibiotikų "poveikį ląstelių proliferaciją ir m
. hyorhinis
infekcija, kuri parodė, kad A2PP tiesų turėjo mažiau toksiškas ląstelėms, bet stiprus gebėjimas neutralizuoti infekcija.

Nepaisant to, kad A2PP, 30 aa polipeptidas, gali sumažėti M
, hyorhinis
infekcija efektyviai, mes vis dar turime suprasti, ar atskirtin formos A2PP gali pasiekti panašų kovos m
. hyorhinis
gebėjimas. Naudojant keletą nupjautuosius peptidų A2PP, mes nustatėme, kad centriniai sekas (11 ^{-osios -20 TH) iš A2PP gali būti esminis motyvas slopinti M
. hyorhinis
infekcija. Tačiau slopinantis poveikis pertrūkiais peptidų dar buvo ne toks stiprus, kaip ir visu ilgiu A2PP, tai rodo, kad supančių sekas, yra svarbu išlaikyti tinkamą struktūrą būtų galima užtikrinti veiksmingą kirptas 37 psl. Tolesni tyrimai privalo rasti modifikacijos ir /ar mutacija šio motyvo poveikį slopina m
. hyorhinis
infekcija}

Padėka

Ačiū ir su dėkingumu pripažįstame Lin Meng, Dr. Zhihua Tian (visi iš Pekino universiteto onkologijos ligoninės & institutas). Teikti kritines reagentus arba techninė pagalba.

• PLoS ONE: Nikotinas slopina cisplatinos sukeltos apoptozės per reguliavimas α5-nAChR /AKT signalizacijos Žmogaus Skrandžio vėžio ląsteles
• PLoS ONE: Žemas dažnis sinchroninės ar Metachronous navikai po endoskopinės gleivine skrodimą ankstyvojo Skrandžio vėžio neišrūšiuotos histologijos