PLoS ONE: N-terminaalista polypeptidiä anneksiini A2 Vähentää Infektio Mycoplasma hyorhinis syöpään Cells

tiivistelmä

mykoplasmainfektio ihmisen ja sen saastumisen soluviljelmissä ovat maailmanlaajuisesti ongelmia. Lääkkeitä tällä hetkellä saatavilla ehkäisyyn tai hoitoon mykoplasmatulehduksen kärsivät alhainen herkkyys, voimakasta vastustusta ja korkea myrkyllisyys. Meidän edellinen työ osoitti, että Mycoplasma hyorhinis
( M
. hyorhinis
) infektion välittämä vuorovaikutus p37 on M
. hyorhinis
ja anneksiini A2 (ANXA2) isäntäsolujen kuitenkin translationaalinen arvo tämän mekanismin oli tuntematon. Tässä me syntetisoitiin N-terminaalin ANXA2 polypeptidin (A2PP), ja havaitsivat, että A2PP voisi alentaa infektion M
. hyorhinis
mahalaukun syöpäsoluja ja lohko M
. hyorhinis
infektio aiheuttama solumigraation. Lisäksi olemme havainneet, että A2PP voisivat vähentää M
. hyorhinis
saastumisen passage soluja. Lisäksi verrattiin kaupalliseen antibiootteja käytetään yleisesti soluviljelmissä estää M
. hyorhinis
infektio, A2PP osoitti enemmän tehoa, mutta alhainen myrkyllisyys solun kasvuun. Näin ollen meidän tutkimus ensimmäistä kertaa paljasti A2PP mahdollisuudet hoitoon ja ehkäisyyn M
. hyorhinis
infektio.

Citation: Yuan S, Qu L, Shou C (2016) N-terminaalista polypeptidiä anneksiini A2 Vähentää Infektio Mycoplasma hyorhinis
syöpään Cells . PLoS ONE 11 (1): e0147776. doi: 10,1371 /journal.pone.0147776

Editor: Gernot Zissel, Universitätsklinikum Freiburg, SAKSA

vastaanotettu 16. lokakuuta 2015 Hyväksytty: 07 tammikuu 2016; Julkaistu 26. tammikuuta 2016

Copyright: © 2016 Yuan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin. Microarray data on talletettu NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) (liittymistä no.GSE73777).

Rahoittajat: Rahoittajat National Natural Science Foundation of China (81572532). http://www.nsfc.gov.cn/publish/portal1/. SCC sai rahoitusta. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Patogeenisia mykoplasmoja, kuten Mycoplasma pneumoniae ( M
. pneumoniae
), mycoplasma hyorhinis ( M
. hyorhinis
), suun mycoplasma ( M
. orale
) ja Mycoplasma genitalium ( M
. genitalium
), kuuluvat luokkaan mollicutes, mikä on pienin mikro-organismi elävä luonnossa ja voi kopioida itsenäisesti [1-2]. Useat tutkimukset osoittivat, että infektio nämä mykoplasmoihin liittyi kasvainten kehittymiseen [3-8]. M
. orale
aiheuttaa kromosomi poikkeavuus ihmisen diploidisoluissa ja indusoi solutransformaatiota [6]. Infektio M
. hyorhinis
tai M
. genitalium
voisi lisätä maahanmuuttoa ja invasiivisuus eturauhasen epiteelisolujen [3]. M
. hyorhinis
infektio on yhdistetty niveltulehdukseen, serosiitti, hedelmättömyys ja syövän ihmisen [9-12].

Lisäksi mykoplasmakontaminaation soluviljelmässä on vakava ongelma ja nopeus kulkua solujen tartunnan mycoplasma on korkea. Soluviljely käytetään laajalti biotieteiden, kuten perustutkimuksen, kliinisen tutkimuksen tutkimus, kehityksen ja tuotannon biologisten tuotteiden sekä alan biofarmaseuttisen ja rokotteen tuotannossa. Estäminen solujen mikrobikontaminaation on olennaista varmistaa tutkimuksen laatua. Mycoplasma saastuminen on yleisin ongelma soluviljelmässä esiintyvyys 30% -60% [1]. Kävi ilmi, että neljä lajia mykoplasmoihin osuus on yli 95% infektion soluviljelmässä, mukaan lukien M
. orale
, arginiini mycoplasma ( M
. arginini
), M
. hyorhinis
ja Levinin ei Acholeplasma (
. laidlawii
) [13,14,15,16]. Koska pieni koko, mycoplasma tuskin löytyy valomikroskoopilla ja helposti huomiotta tutkijat. Viime vuosina lukuisia antibiootteja käytetään mycoplasma hoitoon toistuvasti johti syntymistä mykoplasma vastarintaa. Näistä syistä on välttämätöntä kehittää uusia aineita estäminen tai vähentäminen mykoplasmatulehduksen.

edellinen työ osoitti, että M
. hyorhinis
infektio riippuu vuorovaikutuksesta P37 (suurten kalvo proteiini M
. hyorhinis
) ja isäntä ANXA2 kautta N-pääaluetta. Olemme myös löytäneet polyklonaalinen vasta-aine p37 voisi estää tartunnan M
. hyorhinis
ja lasku M
. hyorhinis
-promoted migraatio mahasyövän solujen [17]. Näiden pohjalta löytöjä, nostimme hypoteesi, että peptidi, syntetisoitiin aminohapposekvenssin ANXA2 N-pään alueen (1 ^{st 30 th aa, tässä nimesimme tämän peptidiä A2PP), voisi estää M
. hyorhinis
infektio kautta kilpailussaan ANXA2 ja mahdollisesti käyttää lääkkeenä estää M
. hyorhinis
infektio soluviljelmässä. Tässä tutkimuksessa testasimme tämä hypoteesi sekä verrattiin A2PP muiden lääkkeiden kanssa estämään M
. hyorhinis
infektio.}

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

AGS mahasyövän solulinja oli American Type Culture Collection (ATCC). BGC823 mahasyövän solulinja perustettiin Pekingin yliopiston Kansan sairaalassa ja ostettiin Cell Culture Center of Chinese Academy of Medical Sciences (Peking, Kiina). AGS ja BGC823 soluja viljeltiin RPMI-1640-väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia, saatu Invitrogen (Carlssbab, CA, USA). Mycoplasma koe toteutettiin ennen jokaista uutta koetta PCR-monistamalla M
. hyorhinis p37
.

Mycoplasma Leviäminen ja yhteistyö kulttuurin

Mycoplasma leviämistä ja yhdessä viljelemisen toteutettiin aiemmin raportoitu [17,18,19].

Vasta-aineet ja reagenssit

Anti-p37 monoklonaalinen vasta-aine PD4 syntyi ja tunnettu aikaisemmin [5,20,21]. Polyklonaalisia anti-p37-vasta-ainetta saatiin immunisoimalla kani GST-p37-fuusioproteiini seuraavan standardin protokollaa. Anti-EGFR ja anti-fosfo-EGFR ostettiin Cell Signaling Technology (CST, USA). Anti-ANXA2 oli peräisin Novus Biotechnology (Novus Biotechnology, USA). Anti-fosfo-ANXA2 oli Santa Cruz (Santa Cruz, CA, USA). A2PP (1 ^{st 30 th aa) ja eri katkaistu A2PP peptidejä, mukaan lukien A2PP-ND4 (5 th 30 th aa), A2PP-ND8 (9 nnestä 30 th aa), A2PP-Nd12 (13 rd 30 th aa), A2PP-Nd16 (17 th 30 th aa), A2PP-CD4 (1 st 26 th aa), A2PP-CD8 (1 st 22 nd aa), A2PP-Cd12 (1 st 18 th aa), A2PP- CD16 (1 st 14 th aa) sekä satunnainen kontrollipeptidejä (ConP) syntetisoitiin Sbsbio (Peking, Kiina). Mikrobilääkkeet mycoplasma I (Myco I) ja mykoplasman II (Myco II) hankittiin M &C GENE TECHNOLOGY (Peking, Kiina). Siprofloksasiini (CIP) oli Double-Crane Pharm (Peking, Kiina).}

havaitseminen M
. hyorhinis
kvantitatiivisen PCR (qPCR) B

DNA uutettiin AGS tai BGC823 solujen jälkeen M
. hyorhinis
infektion DNA lyysipuskuria (50 mM Tris, pH 8,5, 1 mM EDTA, 0,5% Tween-20, ja 200 mg /l proteinaasi K) mukaisesti protokollaa. qPCR suoritettiin 30 ng DNA: ta ja SYBR Green Reaaliaikainen PCR 2 × esiseos (Takara, Otsu, Japani) käyttämällä Vaihe yksi järjestelmän ABI (Foster City, CA, USA). Reaktio ohjelmat ja p37
erityisiä alukkeita (eteenpäin: 5'-TATCTCATTGACCTTGACTAAC-3 'reverse: 5'-ATTTTCGCCAATAGCATTTG-3') on raportoitu aiemmin [22]. Vertailla M
. hyorhinis
DNA tasoja soluissa, GAPDH
(eteenpäin: 5'-TGAAGGTCGGAGTCAACGG-3 ', käänteinen: 5'-CCTGGAAGATGGTGATGGG-3') monistettiin verrokkina ja tiedot analysoitiin käyttäen 2 ^{-ΔΔCt menetelmällä. Alukkeet syntetisoitiin Sangon (Shanghai, Kiina).}

Western-blottaus

Solut kerättiin viljelymaljasta 2 x SDS-latauspuskuria. Polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) ja Western-blottaus suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [23].

Cell ELISA

96-ympättiin soluja (1 x 10 ^{4 /hyvin), ja sen jälkeen käsittelemällä osoitettujen peptidien ja infektio M
. hyorhinis
24 tunnin ajan. Solut immobilisoitiin 0,05% glutaraldehydillä 10 minuutin ajan, sitten ELISAssa suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [24].}

Solid-Phase sitoutumismääritys ja Pull-down-määritys

Rekombinantti GST-p37 ja GST-proteiineja tuotettiin ja puhdistettiin kuten aikaisemmin on kuvattu [17]. GST-P37 ja GST laimennettiin puskuriin (0,1 M Na _{2CO 3, 0,1 M NaHCO 3, pH 9,6) ja päällystetään 96-kuoppaisille levyille 4 ° C: ssa yön yli. Levyt pestiin PBS: lla kolme kertaa, ja estetty 5% rasvatonta maitoa /PBS-liuoksessa huoneenlämpötilassa (RT) 2 tunnin ajan. PBS-pesun jälkeen, osoitti pitoisuudet biotiinikonjugoitu A2PP (syntetisoitu Sbsbio) lisättiin ja inkuboitiin RT: ssa 2 h. PBST: llä ja 3 kertaa, streptavidiini-konjugoitua HRP (Baltimore Pike, West Grove, PA, USA) ja inkuboitiin RT: ssä 30 min. Sen jälkeen kun väri kehitystä ortofenyleenidiamiini- (Sigma), optinen tiheys 490 nm: ssä (OD490) tallennettiin mikrolevylukijalla (Bio-rad 550). Sillä avattavasta määrityksessä, 100 ng GST-p37 tai GST proteiini oli co-inkuboitiin 20 uM biotiini-A2PP ja streptavidiinihelmillä (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, USA) sitomispuskuriin (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5% NP-40, 0,5 mM DTT: tä, 1 mM PMSF: ää, ja 1 x täydellisen proteaasi-inhibiittorit) 4 ° C: ssa yön yli. Sakat pestiin sitomispuskurissa neljä kertaa ja analysoitiin Western-blottauksella.}

Co-immunosaostus

M
. hyorhinis
infektoituneiden solujen (BGC823 tai AGS) homogenisoitiin lyysipuskurissa (50 mM Tris-HCI, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT: tä, 1 mM PMSF: ää, ja 1 x täydellinen proteaasi-inhibiittorit) 4 ° C: ssa 10 min. Jälkeen 12 000 g sentrifugoimalla 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa, supernatantit otettiin talteen. Proteiini lysaatit (500 ug) inkuboitiin 20 pM A2PP tai ConP, 1 ug anti-ANXA2 plus proteiini G Sepharose-helmiä (GE Healthcare) 4 ° C: ssa yön yli. Preimmuuni-lgG: tä (1 ug) käytettiin kontrollina. Saostuneet helmet pestiin lyysipuskurilla neljä kertaa, eluoitiin 2 x latauspuskuria, keitettiin ja analysoitiin Western-blottauksella.

immunofluoresenssimääritystä

Solut ympättiin peitinlaseilla ja viljeltiin yön yli. Seuraavana päivänä soluja käsiteltiin osoitettujen peptidien ja infektoitiin M
. hyorhinis
24 tunnin ajan. Sitten solut pestiin jääkylmällä PBS: llä kolme kertaa, kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 15 minuutin ajan RT: ssä. Sen jälkeen, kun esto 1 h 5% BSA /PBS: llä, soluja inkuboitiin vasta-aineiden kanssa huoneenlämpötilassa 1 tunnin ajan. Seuraavaksi solut pestiin 3 kertaa jälleen PBST: llä ja inkuboitiin FITC tai TRITC-leimatun sekundaarisen vasta-aineita 30 minuutin ajan RT: ssä. Sen jälkeen pesun PBS: llä ja counterstaining DAPI solut asennettu 50% glyserolia /PBS. Zeiss LSM780 -konfokaalimikroskoopilla (ZEISS Microsystems, Oberkochen, Saksa) käytettiin tarkkailla lokalisointia ilmoitettu proteiineja.

Cell migraatiokokeessa

TranswellTM kammio 8,0 um huokoskoko kalvoja (Corning, NY, USA) käytettiin solujen vaeltamiseen määrityksessä. Alaosaan täytettiin 800 ui, joka sisälsi 10% FBS: ää, kuten kemoattraktantti. Solut suspendoitiin uudelleen seerumia, joka sisälsi M
. hyorhinis
plus A2PP tai ConP, sitten siirrettiin varovasti kiinni ylä- kammion jokaisen Transwell laitteen tiheydellä 2 x 10 ^{5 solua /ml (120 ui /kammio). Solujen annettiin kulkeutua 24 h 37 ° C: ssa. Yläpinta kunkin kalvon raivattiin solujen pumpulipuikolla. Solut tunkeutui alapuolen kalvon kiinnitettiin kylmällä metanolilla, värjättiin 0,1% kristallivioletilla ja laskettiin yhdeksällä satunnaisesti valitusta mikroskooppikentästä per kuoppa. Kukin näyte valmistettiin kolmena kappaleena kammioihin ja jokainen koe toistettiin ainakin 3 kertaa.}

proliferaatiomääritystä

Mahasyöpää solut ympättiin 96-kuoppaisille viljelylevyille tiheydellä 5 x 10 ^{3/100 ul /kuoppa kolmena rinnakkaisena, ja käsiteltiin osoitetulla reagenssien. Solujen lisääntymisen kvantitoitiin solun yhtymäkohta kanssa CloneSelect Imager (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).}

Microarray Analysis ja Real-Time RT-PCR

AGS ja BGC823 soluja ( 1 x 10 ^{6 10 cm 2 levyä) käsiteltiin A2PP, CIP, Myco I ja Myco II 24 tunnin, pestiin PBS: llä, ja kerätyistä Trizol reagenssiin. RNA-näytteet tutkittiin OE Biotechnology (Shanghai, Kiina) käyttämällä Affymetrix GeneChip- ® PrimeView ™ Human Gene Expression Array. Microarray data on talletettu NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) (liittymistä no.GSE73777). Raaka rekisteröitiin käyttämällä Affymetrix GeneChip- komentokonsoli (versio 4.0, Affymetrix). Seuraavaksi GeneSpring (versio 12.5, Agilent Technologies) käytettiin loppuun perus analyysi raakadatan. Ensinnäkin, raakadatan normalisoitiin kanssa RMA-algoritmia. Ilmentyvät eri geenejä tunnistetaan sitten kertaluokkamuutos. Asetetun kynnysarvon ylä- ja alas geenien oli kertainen muutos ≥ 2,0. Jälkeenpäin GO ja Kegg analyysia sovellettiin valita pois geenejä, jotka liittyvät solusyklin ja solu- apoptoosin. Reaaliaikainen RT-PCR: ää käytettiin tulosten validointiin microarray ja suoritettiin valmistajien ohje (SYBR, TOYOBO). Ekspressiotasot liittyvien geenien normalisoitiin kautta GAPDH
ja 2 -ΔΔCT avulla laskettiin suhteellisen geeniekspression. Alukkeet reaaliaikaisen RT-PCR ( ATF
, eteenpäin, 5'-GAGTGGCGACAGGATAGAGC-3 ', kääntää, 5'-TTTAGCCTCCCTCCCTTAGC-3'; DDIT3
, eteenpäin, 5 ' -GCGCATGAAGGAGAAAGAAC-3 ', kääntää, 5'-ACCATTCGGTCAATCAGAGC-3'; CEBPB: lle
, eteenpäin, 5'-AGCGACGAGTACAAGATCCG-3 ', kääntää, 5'-AGCTGCTCCACCTTCTTCTG-3') syntetisoitiin Sangon.}

tilastollinen analyysi

Tulokset esitettiin keskiarvona ± SD. Erot analysoitiin ANOVA SPSS 11.0 ohjelmisto ja P < 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Microarray hakunumerolla

Microarray data on talletettu NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) (tulonumero. GSE73777).

Tulokset

A2PP ei vaikuta elinkelpoisuutta ja Migration mahalaukun Syöpäsolut

jotta voitaisiin arvioida roolia ANXA2 n n-pään domeenin M
. hyorhinis
infektio, me ensin syntetisoitiin A2PP vastaava peptidi N-pään ANXA2 (kuvio 1A). Biotiinileimattua A2PP osoitettiin spesifisesti vuorovaikutuksessa GST-p37 kiinteän faasin sitoutumismääritystä (kuvio 1 B) ja avattavan määrityksessä (kuvio 1C). Olemme huomanneet, että A2PP ei vaikuttanut morfologian AGS ja BGC823-soluissa (kuvio 1 D). Lisäksi, jos pitoisuus on alle 20 uM, A2PP ei estänyt soluproliferaatiota (kuvio 1 E), viittaa siihen, että A2PP on minimaalinen myrkyllisyys soluja. EGFR on liitetty säätelyssä ANXA2 fosforylaatioon [17,25,26], kun taas A2PP ollut vaikutuksia fosforylaatiot tai proteiinin tasot EGFR ja ANXA2 [Kuva 2A]. Lisäksi A2PP ei vaikuttanut migraatio AGS ja BGC823 soluja (kuvio 2B ja 2C). Cellular lokalisointi ANXA2 säätelee sen fosforylaatio, joka on kriittinen sen toiminta [17,27,28]. Olemme löytäneet A2PP ei muuttanut solunosasijaintia endogeenisen ANXA2 (kuvio 2D). Nämä tulokset osoittavat, että A2PP yksinään ei ole vaikutusta pahanlaatuisten fenotyyppejä tai EGFR-ANXA2 signalointi mahalaukun syöpäsoluja.

A2PP Vähennykset M
. hyorhinis
Infektio

edellinen työ on osoittanut, että N-terminaali ANXA2 sovittelee M
. hyorhinis
infektio [17]. Kuten on esitetty tulos solun ELISA-määrityksessä havaittiin, että M
. hyorhinis
infektio estettiin A2PP annoksesta riippuvaisella tavalla in BGC823 ja AGS soluja, mutta ConP saaneilla solut edelleen erittäin tartunnan M
. hyorhinis
(kuvio 3A). Nämä tulokset tukivat qPCR määritykset (kuvio 3B). Johdonmukaisesti, A2PP vähensi myös proteiinin tasoja p37-proteiinin Western blotting -analyysi (kuvio 3C ja 3D). Samaan aikaan tasot phophos-AXNA2 ja phophos-EGFR tartunnan saaneiden solut alassäädetty käsittelemällä A2PP (kuvio 3C ja 3E), kun koko tasoa AXNA2 ja EGFR olivat suhteellisen vakaana (kuvio 3C). Vuonna immunofluoresenssianalyysillä, A2PP havaittiin estävän M
. hyorhinis
infektio aiheuttama p37 keskittymisen ja kolokalisaation välillä p37 ja ANXA2 (kuvio 4A). Vuonna yhteistyössä immuunisaostustesti proteiini teissa M
. hyorhinis
infektoituja soluja, A2PP vähentynyt vuorovaikutus p37 ja ANXA2 (kuvio 4B). Yhdessä nämä todisteet tukevat ajatusta, että A2PP voisi pienentää M
. hyorhinis
infektio ja vahvisti aikaisemmat havaintoon, että N-terminaalin ANXA2 tarvitaan välittämiseen M
. hyorhinis
infektio [17].

A2PP vaimentaa M
. hyorhinis
aiheuttama Migration

Aiemmat tutkimukset ehdotti, että M
. hyorhinis
infektio voisi edistää migraatio mahasyövän solujen [17, 23]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että M
. hyorhinis
-promoted migraation mahalaukun syövän solujen ei vaikuttanut ConP, mutta oli annosriippuvaisesti inhiboi A2PP (kuvio 5A ja 5B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että A2PP esti M
. hyorhinis
indusoimaan muuttoliikettä, joka liittyi sen kyky vähentää infektio-edistänyt fosforylaatiot EGFR ja ANXA2 (kuvio 3C ja 3E).

A2PP Has Essential motiivi laskevan M
. hyorhinis
Infektio

luonnehtivat kriittinen motiivi A2PP, etsimme onko monipuolinen katkaistun peptidejä A2PP (kuvio 6A) voisi vähentää M
. hyorhinis
infektio. Vuonna qPCR analyysi, A2PP ja katkaistun peptidit A2PP-ND4, ND8, Nd12,: CD4, CD8 ja Cd12 vähentää M
. hyorhinis
infektion mahalaukun syöpäsoluja, mutta A2PP-Nd16 ja A2PP-CD16 jättänyt pienentää M
. hyorhinis
infektion (kuvio 6B). Samanlaisen esto saatiin Western blotting-määritys (kuvio 6C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että on olemassa erityinen motiivi A2PP on olennainen sen kykyyn vähentää M
. hyorhinis
infektio. Edelleen kartoittamiseksi ydinjaksoja tämän potentiaalin motiivin, syntetisoimme kaksi peptidejä, jotka vastaavat 11 ^{th -20 th aa (kutsutaan kuten A2PP-10aa) ja 13 th -18 th aa (kutsutaan kuten A2PP-6AA) (kuvio 7A). Vuonna qPCR määrityksessä, molemmat peptidit voivat pienentää M
. hyorhinis
infektion (kuvio 7B), jota tukee Western blotting-määritys (kuvio 7C). Huomattavaa on, että inhiboivia vaikutuksia A2PP-10aa olivat parempia kuin A2PP-6AA, mutta vaikutukset sekä peptidien olivat vähemmän kestävä kuin A2PP (kuvio 7B ja 7C). Thesefore, Keski-sekvenssit (11 th -20 th) on A2PP voisi olla keskeinen motiivi estää M
. hyorhinis
infektio.}

vertailu A2PP muiden lääkkeiden kanssa ehkäisemisessä M
. hyorhinis
Infektio

M
. hyorhinis
oli yksi tärkeimmistä pilaantumisen lähteitä soluviljelmässä [13,14,15]. Paras tapa poistaa M
. hyorhinis
infektio on hävittää soluihin ja nopeasti steriloida kaikki yhteyttä aluksiin, mutta jotkut tartunnan soluja ei voitu korvata useissa tapauksissa. Näin ollen on välttämätöntä käyttää erityisiä mikrobilääkkeiden lähestymistapoja ehkäisemiseksi ja poistamiseksi M
. hyorhinis
infektio. On ollut erilaisia ​​mikrobilääkkeiden estää M
. hyorhinis
saastuttamasta. Esimerkiksi Siprofloksasiini (CIP) voisi hävittää M
. hyorhinis
sopivassa pitoisuus [29]. Kaksi antimikrobinen komponentit nimettiin mykoplasmaa I (Myco I) ja mykoplasman II (Myco II) voisi vähentää M
. hyorhinis
infektiota estämällä sen proteiinin ja nukleiinihapon synteesiä. Jotkin huolenaiheita kuten alhainen herkkyys, voimakasta vastustusta ja korkea myrkyllisyys voi rajoittaa niiden sovelluksia soluviljelmässä. Näiden ajatusten pohjalta, uskomme, että on välttämätöntä verrata tehokkuus A2PP, CIP, Myco I ja Myco II estämisessä M
. hyorhinis
infektio. Western blottauksella ja qPCR määritykset, huomasimme, että A2PP estävä vaikutus M
. hyorhinis
infektio oli samanlainen kuin Myco minä, mutta oli parempi kuin CIP ja Myco II (kuvio 8A ja 8B). Kiinnostavaa kyllä, huomasimme, että A2PP voisi myös tehokkaasti poistaa M
. hyorhinis
infektion sairastunut soluissa prosessissa kohtien P _{1 P 3 (kuvio 8C ja 8D). Lisäksi, verrattuna Myco I ja Myco II, A2PP oli vähemmän inhiboiva vaikutus solujen proliferaatioon (kuvio 9A). Tutkia mekanismeja A2PP, CIP, Myco I ja Myco II: n vaikutuksia soluihin leviämisen, suoritimme mikrosiruanalyysi ja seulotaan osajoukon ilmentyvät eri geenien A2PP, CIP, Myco I ja Myco II käsiteltyjä soluja. Kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi osoitti lisääntynyt ilmentyminen apoptoosin liittyvien geenien ( ATF5
, DDIT3
, CEBPB: lle
) mukaan Myco I ja Myco II hoitoa, mutta hieman muutokset olivat havaittu A2PP ja CIP ryhmiä (kuvio 9B). Nämä tulokset osoittavat, että A2PP on vähemmän myrkyllisyys ja parempi ennaltaehkäiseviä potentiaalia estää M
. hyorhinis
infektion viljellyissä soluissa.}

Keskustelu

mykoplasmainfektio ja saastuminen ovat edelleen yleisiä tänään ja tuoda huomattavia riskejä potilaille ja tutkimuksen laatua. Viime vuosina useat tutkimukset ehdotti, että mykoplasmatulehduksen liittyi myös kasvaimien syntyyn [3-8]. Mycoplasma infektio voi aiheuttaa DNA-vaurioita, vaikuttaa geenien ilmentyminen, ja häiritä solusyklin Checkpoint ja apoptoottista vastetta [30]. M
. hyorhinis
todettiin 56% mahasyövistä, 55,1% paksusuolen syövistä ja 39,7% rintasyövistä kudoksissa [20]. Lisäksi serologinen testaus osoitti, että 36% eturauhasen hyvänlaatuisen liikakasvun (BPH) ja 52% eturauhasen syöpä kudoksiin oli M
. hyorhinis
positiivinen [4]. Nämä tutkimukset viittaavat siihen, että yhdistyksen välillä M
. hyorhinis
infektio ja kasvaimia esiintyi [4,20]. Mitä enemmän, prosessissa soluviljelmässä, yleisimmät saastuminen lähteet ovat mykoplasman, bakteereita ja hometta, mutta saastuminen nopeus Mycoplasma on suhteellisesti suurempi [13]. Tulokset Eri ryhmät ovat osoittaneet, että korko mykoplasmakontaminaation vaihteli 15-80%, jotkut jopa saavuttanut 100% [15,31]. Analyysi DNA-sekvenssejä 1000 genomeista -hanketta ymmärtää, että 7%: n näytteet saastuneet mykoplasman [32]. Kuitenkin estää mykoplasmatulehduksen ja saastuminen on vaikeaa. Ensinnäkin, koska pleomorphic, plastisuus, suodatettavuus ja helppo liukoisuutta, mykoplasmoja voisi kulkea mikrosuodatuskalvo helposti, tekevät niistä olemassa isäntäsolun pintaa tai voidaan endosytoidut soluilla [1,13,33]. Toiseksi mycoplasma puuttuu soluseinä, mikä tekee ne herkkä antibiooteille jotka estävät soluseinän synteesiä, kuten penisilliini. Tehokkaiden mikrobilääkkeiden olemassa, mutta niiden jatkuva sovellukset soluviljelmässä ei suositella, koska myrkyllisyyden soluihin. Lopuksi mycoplasma on epätyypillinen bakteeri, joka aiheuttaa difficulities oikeaan diagnoosiin [34].

Lukuisat anti-mycoplasma lääkkeitä on kehitetty, kuten erytromysiini, leukomysiini, Roxithromycin, Ofloxacin, ja Ciprofloxacin. Kuitenkin haittavaikutuksia, myrkyllisyys, ja vastus silti tuoda ongelmia Saasteiden [10,11,35-38]. Lisäksi jatkuva antaminen antibioottien voinut täysin poistaa mycoplasma yhden tai jopa useamman viikon [39,40]. Siksi on tärkeää löytää uusia tapoja, jotka voivat eliminoida mykoplasmatulehduksen tai saastuminen tehokkaasti ja oikea-aikaisesti. Ratkaisu tähän päämäärään voidaan todennäköisesti löytyy kautta luonnehdinta molekyylitason mekanismeista mykoplasmatulehduksen.

edellinen tutkimus osoitti, että vuorovaikutus P37 proteiinin AXNA2 välittämää M
. hyorhinis
infektio [17]. Tässä tutkimuksessa olemme ensinnäkin syntetisoitiin N-pään polypeptidi ANXA2 (A2PP) ja validoitu sen erityisen vuorovaikutusta GST-p37-proteiinin kiinteän faasin sitova ja streptavidiini avattavan määrityksissä. Innoittamana tällaista vuorovaikutusta, mietimme onko A2PP voisi antagonisoida infektio M
. hyorhinis
. Huomasimme, että A2PP, sopivassa pitoisuus (20 uM), laski M
. hyorhinis
infektio, esti infektio-edistänyt muuttoliikettä, ja vähentää infektio-provosoi fosforylaatiot EGFR ja ANXA2 mahalaukun syöpäsoluja. Nämä vaikutukset liittyivät vähentynyt vuorovaikutus p37 ja ANXA2. On huomattava, että A2PP yksin esillä minimaaliset vaikutukset solujen lisääntymistä ja fosforylaatiot EGFR ja ANXA2, viittaa siihen, että A2PP on todennäköisesti käyttökelpoinen reagenssi vähentämiseksi M
. hyorhinis
infektio. Tätä käsitystä tuki vertailuja A2PP n ja kaupallisten antibiootit "vaikutukset soluproliferaatioon ja M
. hyorhinis
infektio, joka osoitti, että A2PP tosiaan oli vähemmän myrkyllisyyttä soluille mutta vahva kyky torjua infektiota.

Tästä huolimatta A2PP, 30 aa polypeptidi voivat heikentää M
. hyorhinis
infektio tehokkaasti, tarvitsemme vielä ymmärtää, onko katkaistu muodot A2PP voisi saavuttaa samanlainen anti M
. hyorhinis
kyky. Käyttämällä useita katkaistun peptidejä A2PP, huomasimme, että Keski-sekvenssit (11 ^{th -20 th) on A2PP voisi olla keskeinen motiivi estää M
. hyorhinis
infektio. Kuitenkin estäviä vaikutuksia katkaistun peptidien olivat vielä ei ole yhtä vahva kuin täyspitkä A2PP, viittaa siihen, että reunustavat sekvenssit ovat tärkeää säilyttää oikea rakenne saavuttaa tehokas sitova p37. Lisätutkimuksia tarvitaan löytää vaikutusten muuttaminen tai /ja mutaatio tämän motiivin estoon M
. hyorhinis
infektio.}

Kiitokset

Kiitämme ja kiitollisina tunnustaa Lin Meng, tohtori Zhihua Tian (kaikki Pekingin yliopiston Cancer Hospital & Institute) tarjoamiseksi kriittisten reagenssien tai tekninen apu.

• PLoS ONE: Nikotiini Estää Cisplatin indusoiman apoptoosin kautta sääntely α5-nAChR /AKT Signaling in Human mahasyövän Cells
• PLoS ONE: esiintyvyys on alhainen Synchronous tai Metachronous Kasvaimet jälkeen Endoskooppinen limakalvon alle Dissection varhaiselle Mahalaukun syövän kanssa Eriyttämätön Histology