La tossina botulinica in sottomucosa gastrica riduce la produzione stimolata HCl nei ratti

La tossina botulinica in sottomucosa gastrica riduce stimolata la produzione di HCl nei ratti
Abstract
sfondo
blocchi tossina botulinica rilascio di acetilcolina dalle terminazioni nervose e agisce come un lungo periodo, inibitore reversibile della contrazione muscolare, così come di salivari, ghiandole sudoripare , secrezioni surrenali e della prostata. Lo scopo del presente studio è quello di verificare se l'iniezione sottomucosa gastrica di tossina botulinica di tipo A riduce la produzione gastrica stimolata di HCl.
Metodi
Sessantaquattro ratti sono stati randomizzati in due gruppi e laparotomized. Un gruppo è stato trattato con la tossina botulinica-A 10 U da iniezioni multiple gastrici sottomucosi, mentre il secondo gruppo è stato iniettato con soluzione fisiologica. Due settimane più tardi, la secrezione acida è stata stimolata dalla legatura del piloro e secrezione acida è stata misurata. Il peso corporeo, il cibo e l'assunzione di acqua sono stati registrati anche tutti i giorni
. Risultati
produzione di HCl dopo è stato trovato legatura del piloro essere significativamente più bassi nei ratti tossina botulinica trattati (657 ± 90.25 micromol HCl vs 1247 ± 152. P = 0,0017). Botulinica ratti trattati con tossina anche mostrato significativamente più bassa assunzione di cibo e aumento di peso.
Conclusioni
tossina botulinica di tipo A riduce stimolati acidità gastrica. Ciò è probabilmente dovuto sia per l'inibizione della stimolazione colinergica delle cellule parietali gastriche, o ad un'azione sui plessi nervosi mienterici. Riduzione della crescita e l'assunzione di cibo può riflettere sia cattiva digestione e una diminuzione della motilità gastrica.
Sfondo
tossina botulinica è prodotta dal batterio Clostridium botulinum in sette sierotipi (da A a G). È il più potente inibitore noto di contrazione muscolare e agisce interferendo con rilascio di acetilcolina nella placca neuromuscolare [1]. Una volta ingerito, tossina botulinica può portare alla forma di intossicazione alimentare conosciuta come il botulismo; tuttavia, è anche un farmaco altamente efficace in pazienti con disturbi neurali e muscolari. Quando la tossina viene iniettata direttamente nel muscolo, l'inibizione risultante di contrazione muscolare è selettiva, prolungata e reversibile. L'effetto inizia 2-5 giorni dopo l'iniezione, raggiunge il suo massimo in 7-10 giorni e dura 1-2 mesi a seconda della dose. BTX-A si lega ad un recettore di membrana nella colinergica nerve-fine e entra nella fibra, dove la parte attiva della tossina idrolizza SNAP-25. Questa proteina è una proteina idrofila 206-aminoacido che partecipano al laccio "macchina fusion", che lega e unisce membrane vescicolari e plasma, eventualmente rilasciando neuromediatori nella fessura sinaptica. Con la rimozione di un residuo aminoacidico 9 da SNAP-25, BTX-A determina neuromuscolare paralisi. Dal 1973, tossina botulinica di tipo A (BTX-A) è stato utilizzato con successo nel trattamento di disturbi contrazione muscolare volontaria, come strabismo, distonia, tremori. In particolare, negli ultimi dieci anni, gli studi clinici hanno descritto l'uso terapeutico di BTX-A in alcune malattie ipercinetici del tratto gastrointestinale (GIT) [2-4]. Dal 1992, la tossina è stata utilizzata con successo in pazienti acalasia, particolarmente poveri soggetti a rischio chirurgico. Nel 1994 il nostro gruppo ha descritto l'effetto di BTX-A in pazienti con fessura-in-ano, una malattia correlata al ipertono dello sfintere interno (liscia) anale [5, 6].
L'azione di BTX-A è non limitato alla giunzione neuromuscolare, come riportato in altri studi in cui è stato trovato ad essere colpiti trasmissione neuroglandular autonomo. Parotide, sottomandibolare, nasali e sudoripare hanno mostrato di ridurre costantemente la loro secrezione dopo iniezione locale di tossina, e la molecola è stata recentemente proposta come opzione terapeutica in scialorrea, nella sindrome di Frey e nel dell'iperidrosi dell'ascella e della mano palme [ ,,,0],7-12]. BTX-A è stato segnalato anche per ridurre la secrezione zimogeno dal pancreas [13, 14].
Il motilità e l'attività secretoria del sistema gastroenterico dipendono molte neuromediatori e modulatori. secrezione acida è regolata da un neurone colinergico che provoca stimolazione diretta della cellula parietale [15]. legatura pilorica stimola potentemente la secrezione gastrica acida nei ratti, come dimostrato in esperimenti ben noti [16].
tossina botulinica Come selettivamente inibisce la trasmissione neuronale colinergica, abbiamo testato l'ipotesi che il precedente trattamento con tossina botulinica ridurrebbe la capacità di stomaco di ratto a secernere l'acido dopo la stimolazione.
Metodi
procedura chirurgica
L'esperimento è stato approvato dal Comitato Etico locale. Sessantaquattro adulti ratti maschi Wistar (peso 240-470 g) sono stati randomizzati in un gruppo BTX (32 ratti) e un gruppo SALINE (32 ratti). Al tempo 0, l'anestesia è stata eseguita con iniezioni intraperitoneali di diazepam (2 mg Kg -1) e ketamina (2 mg Kg -1). Attraverso una incisione addominale mediana lo stomaco è stato esposto ed è entrato lungo la grande curva. Nel gruppo BTX, la sottomucosa del fondo gastrico e corpus (non il rumine) è stato iniettato con BTX-A (Botox, Allergan, Inc., Irvine, CA, USA) 10 U in 1 ml di soluzione salina, con quattro piccole iniezioni che utilizzano un ago 30G. Il gruppo SALINE è stato trattato con soluzione salina allo stesso modo. Per prevenire la disidratazione postoperatoria, gli animali sono stati iniettati con 5 cc per via sottocutanea salina sulla schiena. Dal primo giorno post-operatorio (giorno 1) ratti sono stati alloggiati singolarmente in gabbie e ha permesso di alimentare ad libitum (standard dieta pellet secco). Il peso corporeo, il peso del cibo e millilitri di assunzione di acqua ingerita sono state misurate e registrate ogni giorno; il giorno 13, tutti i ratti sono stati fame. Il giorno 14, i ratti sono stati anestetizzati, e il piloro stato esposto e legatura attraverso una piccola laparotomia. La parete addominale è stata chiusa e 5 cc di soluzione salina è stato iniettato per via sottocutanea. L'accesso all'acqua e al cibo è stato negato. Quattro ore dopo una dose letale di anestetico è stato dato intraperitoneale. Dell'esofago e del duodeno sono stati tagliati, lo stomaco è stato rimosso e succo gastrico raccolti. 10 ratti (7 BTX e 3 fisiologica) sono morti nel corso delle due settimane
. Procedimento chimico
succo gastrico raccolti è stato centrifugato (15 minuti a 4000 giri al minuto). Il surnatante è stato misurato e titolato con NaOH per ottenere la portata totale di acido come ueq in 4 ore.
Statistiche e Modeling
Per valutare la significatività della differenza complessiva tra le medie dei due gruppi (BTX vs. SALINE), l'analisi della varianza è stata condotta sulla produzione HCl di ogni ratto
il decorso temporale di peso corporeo per ciascun ratto è stato montato da un modello di regressione lineare a tratti:. il modello assume un andamento lineare di peso corporeo decrescente da giorno 0 fino al punto più basso e l'aumento da allora in poi, cioè w
(t
) = w
0 + k
d
t
, 0 = t
= t
n
; e w
(t
) = w
n + k

g
(t
- t
n
), t Hotel > t
n
; dove w
[g
] è il peso del ratto in funzione del tempo, w
0 [g
] è il peso iniziale del ratto, w
n
[g
] è il peso del ratto al nadir (basso peso previsto dopo l'intervento chirurgico), k
d
[g giorno
- 1] è il tasso di perdita di peso nella prima fase, t
[giorno
] è il tempo, t
n
[giorno
] è il tempo necessario per raggiungere il peso Nadir, k
g
[g giorno
-1] è il tasso di aumento di peso nella seconda fase. Dal momento che
W n
= w
0 + k
d
t
n
, il modello ha tre liberi parametri: k
d
, k
g
e t
n
analisi di regressione lineare nel corso del tempo è stata anche eseguita. osservazioni di tempo e di cibo e acqua assunzione su ogni ratto, per dar luogo a valori stimati del parametro del modello k
cibo
e k
acqua
(tasso di assunzione di cibo e acqua .) rispettivamente
risultati
le medie di esempio, deviazioni standard e la significatività della differenza di produzione di HCl tra i gruppi sono riportati nella Tabella 1. Una differenza significativa (P < 0,002) risultati tra i due gruppi, totale HCl produzione essendo significativamente più bassa nel BTX rats.Table 1 BTXvs. produzione, parametri di tempo portate di peso corporeo, assunzione di cibo e acqua tassi SALINE HCl.

gruppo BTX
gruppo SALINE

P
HCl produzione [ueq /4 ore]
657,031 ± 848,735
(n = 24 *)
1.246,645 ± 442,128
(n = 29)
< 0,002
basale corpo-peso [g]
343 ± 51,65
(n = 26)
350 ± 48.95
(n = 29)
NS
kd : tasso di perdita di peso dopo il trattamento [g giorno-1]
-2,326 ± 1.607
(n = 26)
-0,3739 ± 0,8827
(n = 29) Hotel < 0,0001
kg: tasso di aumento di peso dopo nadir [g giorno-1]
2.003 ± 1.583
(n = 26)
3.423 ± 1.593
(n = 29) Hotel < 0,0025
tn: giorni da tempo 0 a nadir del peso corporeo [giorno]
2.45 ± 1.13
(n = 26)
1.374 ± 1.382
(n = 29) Hotel < 0.004
k cibo: tasso di assunzione di cibo dopo il trattamento [g giorno-1]
20,016 ± 4.99
(n = 26)
26,881 ± 2.896
(n = 29)
< 0,0001
k acqua: tasso di assunzione di acqua dopo il trattamento [g giorno-1]
38,619 ± 5,325
(n = 26)
51,868 ± 11,378
(n = 29)
. < 0,05
* Due provette rotto durante la centrifugazione e dati non erano disponibili per la misurazione HCl
tasso di perdita di peso corporeo dopo l'intervento chirurgico è stato più veloce, il tempo nadir era tardi e il tasso di aumento di peso dopo-nadir era lento in BTX trattati rispetto agli animali di controllo (tutte le differenze altamente significativo). Anche se i ratti non erano significativamente diversi per peso corporeo al basale, i tre effetti sopra si traducono in un recupero ponderale dei ratti BTX dopo l'intervento chirurgico. I corsi tempo medio di peso corporeo per entrambi i gruppi sono mostrate nella Figura 1. La differenza nel corso di tempo del peso corporeo è stata parallelamente da una differenza significativa nel cibo e acqua consumi, BTX-A-ratti trattati mangiare e bere meno di controllo ratti. andamento nel tempo della assunzione di cibo e acqua per entrambi i gruppi sono illustrati nelle figure 2 e 3. La figura 1 Naturalmente il tempo di variazione percentuale medio giornaliero di peso corporeo in BTX e gruppi saline. Solo i sopravvissuti al giorno 14 sono stati considerati. 100% significa basale del peso corporeo di ogni ratto.
Figura 2 Tempo corso di assunzione di cibo giornaliera media in BTX e gruppi di Saline. Solo sono stati considerati i sopravvissuti al giorno 14.
Figura 3 portate Tempo di assunzione media giornaliera di acqua in BTX e soluzione salina gruppi. Solo sono stati considerati i sopravvissuti al giorno 14.
Discussione
Nel presente studio, dopo il pre-trattamento degli animali sperimentali con BTX-A, è stata adottata la tecnica della legatura del piloro. In sostanza, il meccanismo comporta riflessi vagali-Vago indotte da barocettori mucose attivati ​​nel antro [17], mentre i mediatori non-colinergici (Histamin e gastrina) sembrano essere meno coinvolti [18].
Recettori muscarinici a membrana sono stati descritti sulla basolaterale della membrana plasmatica delle cellule parietali, confermando l'innervazione colinergica di cellule secretorie HCl [19, 20].
la significativa riduzione della secrezione acida stimolata in BTX-a ratti trattati è coerente con il blocco ipotizzato di trasmissione neuro-ghiandolare nel cellule parietali della mucosa gastrica. Nel 1977 Kondo e Magee osservato che i.v. tossina botulinica potrebbe inibire la pentagastrina indotta e in misura minore istamina indotta secrezione acida gastrica [21]. Essi hanno inoltre rilevato che la risposta alla stimolazione vagale acido è stato, come previsto, ha abolito mentre quello di metacolina è stato inalterate. Queste osservazioni confermano che la tossina botulinica non danneggia le cellule che secernono, ma agisce in modo reversibile inibizione rilascio di acetilcolina. La sua azione è probabilmente così efficace sulla produzione HCl gastrico, perché sopprimere il segnale colinergico maggior parte dei percorsi che condurre alla secrezione acida sono tutti inibito.
Perdita di peso corporeo è stata osservata in entrambi i gruppi di ratti durante i primi giorni dopo l'intervento, come un probabile conseguenza di stress chirurgico. Dopo alcuni giorni, i ratti SALINE-trattati sono stati di nuovo crescendo ad un ritmo normale. Al contrario, ratti BTX-trattati hanno mostrato tassi di crescita persistentemente inferiori, parallelo diminuito apporto calorico.
L'effetto è altamente riproducibile, sia in adulti e (in misura minore) in animali giovani. Infatti in uno studio precedente abbiamo ipotizzato che la peristalsi gastriche sarebbe compromessa e l'assunzione di cibo, di conseguenza diminuito. Alcuni raggi X film di ratti alimentati con contrasto mostrato gastrico prolungata svuotamento volte rispetto ai ratti non trattati [22]. Nel presente studio, la durata del peso corporeo è stato studiato con l'ausilio di un modello matematico adeguato, permette di quantificare una prima fase di perdita di peso (che dura pochi giorni dopo l'iniezione in ratti trattati) ed una seconda fase di aumento di peso. Nella presente serie, ratti BTX-trattati hanno perdita di peso più ripido e prolungato, così come lento successivo utile di peso, rispetto agli animali di controllo. . L'effetto osservato sul peso corporeo potrebbe essere correlato alla capacità digestiva compromessa, mediata dalla inibizione della secrezione acida gastrica ed eventualmente da altri meccanismi
Conclusioni
BTX-A è un potente tossina neuromuscolare: quando iniettato nel muscolo, riduce la forza di contrazione in modo dose-dipendente. L'effetto è di lunga durata (1-3 mesi), reversibile, privo di effetti collaterali importanti.
Il sistema nervoso del tratto gastrointestinale è costituito da una ricca rete neuronale che è organizzata in gangliare e plessi agangliar, come la Meissner e di plessi di Auerbach che controllano la motilità, la secrezione, l'assorbimento e l'attività muscolaris mucose.
Poiché la secrezione gastrica HCl è fortemente dipendente l'attività colinergica di fibre vagali e mienterici che alla fine agiscono dai loro giunzioni neuroglandular, era ragionevole supporre che potrebbe essere inibito dalla locale iniezione di BTX-A [23, 24]. secrezione acida gastrica è stata indotta dalla tecnica legatura pilorica comprovato un forte stimolo della secrezione acida. È interessante notare, questo effetto è diminuito di vagotomia, agenti vagolitici o agenti bloccanti gangliari, cioè da manovre anti-colinergici. L'effetto osservato sulla secrezione acida stimolata dopo l'iniezione sottomucosa di BTX-A è in linea con la riduzione di valore ipotizzato di trasmissione colinergica neuro-ghiandolare. E 'anche possibile che la stimolazione neurale è stata compromessa a livello dei plessi mienterici, dove sinapsi neuro-neuronale sono abbondanti. L'iniezione di tossina era strettamente sottomucosa, ma, dal momento che la molecola ha proprietà diffusive, il coinvolgimento delle fibre dei plessi, non si può escludere, almeno per quanto riguarda il plesso interno.
Sono necessari ulteriori studi per definire il sito d'azione di BTX-a nella rete neurale gastrico e conseguentemente spiegare gli effetti osservati. Tuttavia, il presente lavoro dimostra che, qualunque sia la causa ultima della perdita di peso, della mucosa BTX-A iniezione di influenza in modo significativo il meccanismo di produzione di acido gastrico e determina la perdita di peso prolungata negli animali da esperimento.
D'autore contributi
MR, SR , PLS, ha partecipato alla progettazione e coordinamento dello studio, eseguito la procedura chirurgica e redatto il manoscritto.
SP, eseguita l'analisi statistica.
DG, concepito dello studio e partecipato alla sua progettazione e il coordinamento.
Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale
dichiarazioni
Ringraziamenti.
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una borsa di studio Telethon-Italia. fascicoli presentati originali
d'autore per le immagini
Qui di seguito sono i link ai originali degli autori presentati file per le immagini. 'file originale per la figura 1 12876_2003_63_MOESM2_ESM.pdf Autori 12876_2003_63_MOESM1_ESM.pdf autori file originale per il file originale figura 2 12876_2003_63_MOESM3_ESM.pdf degli autori per la figura 3 Competere interessi
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