è richiesta la segnalazione del recettore della leptina per alto contenuto di grassi indotta dalla dieta gastrite atrofica in mice

leptina segnalazione dei recettori è necessario per alto contenuto di grassi indotta dalla dieta gastrite atrofica nei topi
Abstract
sfondo
L'obesità aumenta il rischio di tumori maligni in vari tessuti tra cui lo stomaco. gastrite atrofica con lesioni precancerose è una malattia obesità associata; Tuttavia, i meccanismi che sottendono lo sviluppo dell'obesità associata gastrite atrofica sono sconosciute. La leptina è un ormone derivato dallo stomaco così come il tessuto adiposo e leptina gastrico è coinvolto nello sviluppo del cancro gastrico. Lo scopo di questo studio è quello di indagare il coinvolgimento del segnale del recettore della leptina nello sviluppo della gastrite atrofica durante obesità indotta dalla dieta
. Metodi
Maschio C57BL /6, ob /ob
e db /db
topi sono stati alimentati con una dieta ricca di grassi (HFD) o una dieta di controllo (CD) da 1 settimana a 5 mesi. Le alterazioni patologiche della mucosa gastrica e l'espressione di molecole associate alla gastrite atrofica sono stati valutati in questi topi.
Risultati
alimentazione HFD indotti gastrica iperplasia della mucosa con maggiore espressione di leptina gastrica. Mucosale iperplasia è stato accompagnato da una maggiore frequenza di cellule proliferanti Ki67-positivi e atrofia delle ghiandole gastriche in presenza di infiammazione, che ha aumentato a seguito di alimentazione HFD. L'attivazione di molecole di segnalazione associate OBR quali OBR, STAT3, Akt e ERK è stato rilevato nella mucosa gastrica dei topi alimentato la HFD per 1 settimana. Le alterazioni morfologiche associate a gastrica atrofia della mucosa e l'espressione di MUC2 e Cdx2 simili a quelli associati con metaplasia intestinale umano. A differenza di topi wild-type, la leptina-carente ob /ob
topi e leptina recettore mutato db /db
topi non hanno mostrato un aumento dell'espressione Cdx2 in risposta alla alimentazione HFD.
Conclusione
Insieme , questi risultati suggeriscono che l'attivazione della via di segnalazione della leptina nello stomaco è necessario per sviluppare l'obesità associata gastrite atrofica.
Parole
leptina gastrite atrofica dieta obesità Sfondo alto contenuto di grassi
carcinoma gastrico (GC) si pone in genere su uno sfondo di gastrite atrofica, metaplasia intestinale e displasia della mucosa gastrica, ed è la seconda causa di decessi correlati al cancro in tutto il mondo [1]. L'obesità aumenta il rischio di una maggiore prevalenza di gastrite [2, 3], gastrite atrofica [4-6], e cardias adenocarcinoma gastrico [7-9]. L'infezione da Helicobacter pylori
, un batterio che infetta l'uomo e colonizza lo stomaco, è la causa predominante delle lesioni precancerose della mucosa dello stomaco [10]. Anche se H. pylori
infezione non si limita ai pazienti con obesità, l'obesità aumenta la prevalenza di gastrite cronica e GC [2]. Inoltre, l'obesità non è solo un fattore di rischio per alcuni tumori, ma è anche associato ad un aumento della mortalità [11]. Così, l'obesità colpisce potenzialmente lo sviluppo della gastrite in tumorigenesi gastrica. Pertanto, è imperativo identificare molecole associate sia con l'obesità e lesioni precancerose per aiutare nella gestione di individui ad alto rischio di segnalazione.
Leptina, un prodotto della obesi (ob
) gene, è prodotto principalmente da adipociti e agisce sul suo recettore (oBR) nell'ipotalamo per sopprimere l'assunzione di cibo e aumentare il dispendio energetico [12]. OBR appartiene alla classe I citochina famiglia di recettori, e la sua struttura è altamente omologa a quella della gp130, il recettore comune segnale di trasduzione per la famiglia interleuchina-6 (IL-6) di citochine [13]. Dei sei varianti di splicing alternativi di OBR, solo la lunga isoforma, ObRb, trasduce un segnale a cascata che attiva chinasi 2 e il segnale del trasduttore a valle Giano e attivatore della trascrizione 3 (JAK2-STAT3), phosphoinositide 3-chinasi (PI3K), ed extracellulare chinasi segnale regolato 1/2 (ERK1 /2) [14]. Oltre al suo ruolo nella omeostasi energetica, la leptina esercita effetti pleiotropici sul angiogenesi, emopoiesi, e l'immunità, nonché [14]. La leptina e OBR sono anche espressi in vari tessuti tra cui il tratto gastrointestinale [15]. Inoltre, lo stomaco può spontaneamente esprimere leptina e OBR, determinando l'aumento della leptina recettore segnalazioni nello stomaco durante lo sviluppo GC [16-18]. Abbiamo precedentemente dimostrato l'importanza della leptina segnalazione nello stomaco e il suo ruolo nello sviluppo di tipo intestinale tumore gastrico utilizzando un modello murino [19]. Disfunzione di regolazione centrale simpatica di leptina segnalazione promuove la resistenza alla leptina. Nonostante gli elevati livelli circolanti di leptina plasmatica, gli individui obesi non rispondono ai suoi effetti di soppressione dell'appetito, indicando la loro resistenza alla leptina [20]. Perché la leptina è cruciale per lo sviluppo di tumori maligni gastrointestinali e fornisce un collegamento tra l'obesità e tumorigenicità [17], una migliore comprensione della disregolazione del gastrica leptina segnalazione e il suo ruolo nella patologia gastrica obesità indotta è necessaria.
Metodi
Animali e diete
Maschio C57BL /6J (wild-type: WT), ob /ob
, e db /db
topi (CLEA Giappone, Tokyo, Giappone) sono stati studiati a 7 settimane di età. Gli animali sono stati alloggiati individualmente in gabbie di plastica a 24 ° C ± 1 ° C con luci a partire da 0600 al 1800 h. I topi sono stati forniti sia con un controllo-dieta (CD, il 10% di calorie da grassi, D12450J) oppure una dieta ad alto contenuto di grassi (HFD, il 60% di calorie da grassi, D12492) (Research diete Inc., New Brunswick, NJ ) e acqua ad libitum
. Il comitato etico per la sperimentazione animale dell'Istituto Nazionale per le Scienze Fisiologiche ha approvato tutti gli esperimenti sugli animali.
Analisi istopatologica della mucosa gastrica
inclusi in paraffina sezioni gastrici del 10% tessuti fissati in formalina sono stati ottenuti dal HFD- e CD topi -fed e sono state colorate con ematossilina e eosina (H & e), e valutati per alterazioni della mucosa gastrica. La valutazione delle alterazioni della mucosa dello stomaco si è basata su una sommatoria dei punteggi per l'iperplasia (0, non sostanziale alterazione; 1, basso, 2, moderata, 3, alta), infiltrazione di cellule (0, non sostanziale alterazione; 1, basso, 2, moderata, 3, alta), la perdita di cellule ghiandolari gastriche (0, non sostanziale alterazione, 4, basso; 5, moderata, 6, alta), Alcian colorazione blu (0, non sostanziale alterazione; 4, focale, 5, diffusa; 6, molto forte diffusa), e la displasia (0, non sostanziale alterazione, 7, basso). Ogni criterio era indipendente cieco segnato da due individui che utilizzano i criteri che sono stati precedentemente definiti [19].
Misurazioni intragastrico pH gastrico
pH è stato misurato in base a un metodo pubblicato [21]. In breve, i topi sono stati sacrificati dopo anestesia per inalazione di anidride carbonica. Dopo la rimozione dello stomaco, il lume gastrico è stato rimosso e lavato con 0,5 ml di soluzione salina (150 mM, pH 7,0), e il pH del fluido gastrico raccolta è stata misurata usando un misuratore di pH (Mettler, Toledo, OH).
Analisi immunoistochimica sezioni
in paraffina di 10% tessuti fissati in formalina sono state colorate o con H & e o con periodico acido Schiff (PAS) e blu Alcian. Per recupero dell'antigene, campioni deparaffinate e reidratati sono stati trattati con perossido di idrogeno al 3% in metanolo per bloccare l'attività perossidasica endogena e poi sono stati riscaldati in un forno a microonde con un Retrievagen Un kit (BD Biosciences, San Jose, CA), seguita da incubazione per una notte con primaria anticorpi (Abs) a 4 ° C, come elencati nel file aggiuntive 1: Tabella S1. Successivamente, le diapositive sono state colorate con un biotinilato IgG anti-coniglio o anti-IgG di capra Ab e perossidasi streptavidina marcato utilizzando un kit Histofine SAB-PO (Nichirei Biosciences Inc., Tokyo, Giappone) e sviluppati utilizzando 3, 3'-diaminobenzidina soluzione (DAB) (ImmPact TM DAB, Vector Laboratories, Burlingame, CA) secondo il protocollo del produttore, seguito da ematossilina di contrasto. Per immunofluorescenza, le diapositive sono state incubate con l'Abs primario (sui file 1: Tabella S1) e poi hanno reagito con Alexa coniglio 488-coniugato o il mouse IgG Ab o Alexa 556-coniugato capra IgG Ab, a seconda dei casi. I vetrini colorati sono stati montati utilizzando ProLong oro Antifade reagente con 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Life Technologies, Carlsbad, CA) per il rilevamento utilizzando un microscopio a fluorescenza (Olympus, Tokyo, Giappone).
Western blot
cellule epiteliali gastriche sono stati isolati e preparato secondo una modificazione di un metodo precedentemente pubblicato [22]. Sezionato piccoli segmenti dello stomaco sono stati agitati a temperatura ambiente per 10 min in soluzione salina bilanciata di Hank un (HBSS) (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA) medium contenente 1 mM DTT. Dopo la rimozione del supernatante, i tessuti sono stati agitati a 37 ° C per 10 min in HBSS contenente 10 mM EDTA. Dopo la rimozione del supernatante, la sospensione tessuto è stato fatto passare attraverso una maglia di nylon per rimuovere i detriti e centrifugata attraverso discontinuo Percoll (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) pendenza 25/40% a 600 × g
a 20 ° C per 20 min. Le cellule raccolte dall'interfaccia 25/40% erano le cellule epiteliali. Lisati sono stati preparati dai tessuti e cellule e analizzate mediante western blotting, secondo un metodo precedentemente pubblicata [23]. L'ABS utilizzati in western blotting sono riassunti nella file aggiuntive 1: Tabella S1
laser-capture microdissezione
I tessuti gastrici sopra descritti inclusi in paraffina sono stati tagliati in sezioni di 6 micron di spessore e montate su vetrini a membrana (. MembraneSlide 1.0 PEN, Carl Zeiss Microscopy, LLC, Thornwood, NY). Paraffina è stata rimossa risciacquando sezioni con xilene, dopo di che le sezioni sono state immerse in una serie di 100% ai bagni di etanolo al 70% e asciugato all'aria. sezioni della mucosa gastrica di epiteli sono stati tagliati e raccolti sul AdhesiveCaps (palma, Microlaser Technologies, Bernried, Germania) mediante una microdissezione laser-capture (LMD) sistema (PALM MB-III, Microlaser Technologies).
Quantitative inversa a catena della polimerasi trascrizione reazione (qRT-PCR)
RNA totale dai campioni LMD e dalla mucosa gastrica murino è stato estratto utilizzando AllPrep FFPE DNA /RNA e RNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA), rispettivamente, secondo i protocolli del produttore. cDNA è stato sintetizzato da circa 100-200 ng RNA dalle sezioni LMD o 1-2 mg di RNA da cellule della mucosa gastrica utilizzando l'ReverTra Ace ® qPCR Kit RT (TOYOBO, Co., Ltd., Osaka, Giappone) secondo protocollo del produttore. qRT-PCR è stata effettuata utilizzando il Potere SYBR Green PCR Master Mix (Life Technologies, Carlsbad, CA) con i set di primer specifici (400 Nm alla concentrazione finale, sui file 2: Tabella S2) secondo il protocollo dei costruttori. variazioni relative nell'espressione genica sono stati calcolati secondo il metodo ΔΔCt, e il gene 18S rRNA è stato utilizzato per la normalizzazione.
Analisi quantitativa di colorazione immunoistochimica
Per misure microscopiche, campioni di mucosa gastrica leptina macchiati sono stati fotografati con un microscopio (Olympus ), e l'analisi quantitativa è stata effettuata utilizzando il software ImageJ (http:... //RSB informazioni NIH gov /IJ /index html).. altezza della mucosa è stata misurata tra la base delle ghiandole gastriche e la zona del collo.
test Plasma
siero è stato raccolto da sangue ottenuto da cardiocentesis sotto anestesia e conservati a -80 ° C. Insulina (Insulina mouse kit ELISA, Shibayagi, Gunma, Giappone), la leptina (leptina ELISA, Millipore, St. Charles, MO), glucosio (glucosio CII-test, Wako, Osaka, Giappone), e acidi grassi non esterificati (NEFA ) (NEFA C-test, Wako) i livelli nel siero sono stati misurati secondo i protocolli dei produttori. analisi statistica
il Mann-Whitney U
test e il test di Kruskal-Wallis sono stati utilizzati per determinare significativi differenze. A p
-value inferiore a 0,05 è stato considerato significativo. Le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando il software Prism versione 6 (GraphPad, San Diego, CA, USA).
Risultati
topi HFD-alimentati sviluppano gastrite atrofica
Per determinare come obesità indotta dalla dieta influisce sulla patogenesi della mucosa gastrica , C57BL /6 topi sono stati alimentati sia HFD (60% di calorie da grassi) o CD (10% di calorie da grasso) e le alterazioni istologiche della mucosa gastrica sono stati esaminati in un modo dipendente dal tempo. Rispetto ai topi CD-alimentato, i topi nutriti HFD-esposto rapido aumento di peso a un tasso del > 2 g per settimana durante le prime 12 settimane. Successivamente, un moderato aumento di 1 g per settimana è stata osservata da 12 a 20 settimane (Fig. 1a). La mucosa cardiale mostrato iperplasia a 1 settimana, prima di qualsiasi differenza significativa nel peso corporeo tra il CD e gruppi HFD-alimentati (1,5 ± 0,29 nel CD vs
1,8 ± 0,4 nel HFD, p Hotel >.; 0,05) (Fig. 1A e 1B). A 3 settimane, sono stati osservati un numero di cellule parietali ridotta e alterazioni morfologiche del foveola nello stomaco, seguito da metaplasia ghiandolare e una completa perdita di cellule zymogenic e parietali a 12 settimane dopo l'inizio della HFD alimentazione (fig. 1b). Anche se il cambiamento iperplastica dell'epitelio foveolare gastrico è stato visto a 1 settimana in topi HFD-alimentati, pochi CD45 + cellule infiltrate erano presenti in HFD-alimentato topi (fig. 1b e 1d). Tuttavia, dopo 3 settimane di alimentazione, una notevole quantità di cellule infiltrate stati visti aver invaso spazi interglandular e basali in conformità con lo sviluppo di iperplasia (Fig. 1b e 1d). Nel antro, lieve iperplasia della mucosa è stata osservata nei topi HFD-alimentati a 1 settimana dopo l'inizio dieta. Sia il cardias e antro visualizzati sostituzione delle normali cellule ghiandolari quali parietale e cellule G con cellule atipiche e irregolari dopo 3 settimane di HFD alimentazione (Fig. 1b). Inoltre, epiteli leggermente displastica, con le cellule che mostra nuclei allargati, pseudostratification nucleare e nucleoli distinti, divenne evidente nelle lesioni iperplastiche di topi HFD nutriti a 12 settimane dopo l'alimentazione (Fig. 1c). Una elevata frequenza di cellule proliferanti Ki67-positivi è stata osservata nel iperplastiche e le lesioni gastriche displastiche dei topi HFD-alimentati, che queste cellule presentano una zona proliferante definita in topi CD-fed (Fig. 1e). Queste alterazioni rapidamente progredito da 8 settimane di alimentazione (Fig. 2c). A 20 settimane di alimentazione, le pieghe della mucosa gastrica lucido erano piani con un aspetto pallido, e le lesioni polipo simili sono stati osservati nel cardias e regioni fundica di topi nutriti HFD-(frecce in Fig. 2a). A questo punto, l'infiltrazione di cellule era completa, e le normali ghiandole gastriche sono stati sostituiti da strutture cripta simile intestinali alla mucosa basale cardiale di topi HFD-alimentati (Fig. 2b). Questi risultati indicano che HFD seno altera l'integrità dell'epitelio gastrico, anche nella fase precoce di alimentazione e suggeriscono che la presenza di iperplasia della mucosa dello stomaco è stata iniziata da eventi infiammazione-indipendente. Figura. 1 Le alterazioni patologiche della mucosa gastrica a causa di HFD seno. Una modifica dei guadagni in peso corporeo di topi C57BL /6 J CD alimentati (n
= 10) o HFD (n
= 10) durante le 20 settimane. b Rappresentante H & E-sezioni del cardias e antro da topi nutriti CD o HFD per 1, 3, e 12 settimane. c ingrandita immagine della gastrico in topi alimentati con CD e HFD in Fig. 1b a 12 settimane dopo l'alimentazione (ingrandimento, × 400). sono stati osservati il ​​nucleolo cellulare, l'ipertrofia nucleare, dyspolarity, e pseudostratification. d CD45 colorazione della mucosa gastrica di 1 e 3 settimane topi HFD-alimentati. e Ki67-colorazione nella mucosa gastrica dei topi alimentati CD o HFD per 3 settimane. 5-10 topi sono stati usati in ogni analisi e dati rappresentativi sono mostrati
Fig. 2 Lo sviluppo di atrofia della mucosa gastrica in topi obesi dieta-indotta. a Il lume gastrico è stato aperto lungo la curvatura esterna di topi CD o HFD alimentati per 20 settimane. Le frecce indicano le lesioni polipo simile nello stomaco di topi HFD-alimentati. b Rappresentante H & E-sezioni del cardias e antro da topi CD o HFD alimentati per 20 settimane. c I punteggi istologici dallo stomaco dei topi CD o HFD alimentati (< 3 settimane, 4-8 settimane, 8-20 settimane di alimentazione; 10 topi per gruppo) sono stati classificati in base ai criteri diagnostici descritti nei metodi. I risultati sono stati analizzati con il test di Kruskal-Wallis, seguita da test di confronto multiplo di un Dunn. * P
< 0.05, ** p
< 0,01, NS; non significativo
upregulation di marker intestinale nella mucosa gastrica
Abbiamo inoltre esaminato se la mucosa gastrica nei topi HFD-fed esposto caratteristiche di mucosa intestinale. Abbiamo osservato che la frequenza delle cellule caliciformi blu-tinto Alcian, che sono cellule mucose intestinali, aumentato come si diffondono attraverso la mucosa gastrica in topi HFD-fed (Fig. 3a). MUC2, un tipo intestinale di mucina, fu ectopicamente espressa nella mucosa gastrica solo di topi HFD-alimentati (Fig. 3a), indicando che mucina gastrica è stata convertita nel tipo intestinale come è stato osservato nella maggior parte dei carcinomi gastrici umani [24]. I risultati delle analisi di espressione genica sono stati coerenti con i risultati immunoistologici. L'espressione di mRNA di MUC2
e Tff3
(co-espressi peptide con MUC2) è aumentata, mentre quella delle mucine gastrica tipo, MUC1
, MUC5AC
, e Muc6
, è rimasto inalterate o diminuita nello stomaco di topi HFD-alimentati (Fig. 3b). Il cardias di topi HFD-alimentati anche mostrato l'espressione ectopica di fosfolipasi A2 (PLA2), un marker delle cellule intestinali Paneth (Fig. 3a). In contrasto, l'espressione di H + K + - ATPasi, un marker di cellule parietali che secernono acido gastrico, diminuita con una elevazione concomitante di pH gastrico in topi HFD-fed (Fig. 3a e 3c) . Inoltre, la deregolamentazione di espressione del fattore di trascrizione traspone in un fenotipo metaplastica. Di conseguenza, l'espressione di mRNA di Cdx2
, un maestro fattore di trascrizione intestinale che è un marker di metaplasia intestinale, è stata maggiore nei topi HFD nutriti a 1 settimana (Fig. 3e). Inoltre, Cdx2
espressione dell'mRNA è stata aumentata nella mucosa gastrica dei topi HFD nutriti a 12 settimane a differenza di quella osservata nei topi CD-alimentati, in cui era costante (Fig. 3d e 3e). Coerentemente con la ectopica Cdx2
espressione dell'mRNA, l'mRNA di Sox2
, un fattore di trascrizione per l'organogenesi stomaco [25], tendeva ad essere inibiti e indicando lo sviluppo di metaplasia intestinale nella mucosa gastrica nei topi HFD-fed ( Fig. 3e). Presi insieme, questi risultati implicano che HFD-alimentazione accelera metaplasia intestinale. Figura. 3 Alterazione delle caratteristiche intestinale nella mucosa gastrica dei topi HFD-alimentati. sezioni gastrici colorate per blu PAS-Alcian, MUC2, PLA2, e H + K + ATPasi (a), e Cdx2 (d) nei topi CD o HFD alimentati per 20 settimane. L'espressione genica di mucine (b), e Cdx2
e Sox2
(e) nella mucosa gastrica dei topi alimentati CD o HFD a 1 a 12 settimane dopo l'allattamento. Abbiamo utilizzato 5-10 topi in ogni analisi, e dati rappresentativi vengono mostrate. c Il pH gastrico nel lume gastrico è stata misurata secondo la descrizione fornita nei Metodi. I valori rappresentano la media ± SD di 5 topi. I risultati sono stati analizzati con il test di Kruskal-Wallis. * P
< 0.05
alimentazione HFD attiva di segnalazione recettore della leptina presto durante gastrico intestinale metaplasia
A causa dei primi alterazioni morfologiche osservate nella mucosa gastrica, abbiamo esaminato l'espressione genica di specifici ormoni dello stomaco, peptidi e gli enzimi 1 settimana dopo l'alimentazione HFD . espressione di leptina mRNA in particolare, era significativamente più alta nello stomaco di topi HFD-nutriti; Al contrario, l'espressione grelina è stata inferiore nei topi nutriti HFD-(Fig. 4a). L'espressione di altri geni, come Atp4a
, Atp4b
, Pga
, e
PGC, che codificano per H + K + - ATPasi, pepsinogeno A e C pepsinogeno rispettivamente, non ha mostrato differenze significative tra CD e topi HFD-alimentati, anche se l'espressione di Atp4a
e Atp4b
tendeva a diminuire (Fig. 4a). Normalmente, la leptina è espressa nelle cellule principali e parietali [26, 27]; tuttavia, i topi nutriti HFD-esposto forte espressione di leptina nel epiteli gastrica iperplastica (Fig. 4b e 4c). Anche se la concentrazione sierica di leptina è risultata simile tra CD e topi HFD-alimentato ad 1 settimana dopo l'alimentazione (Fig 4d.), L'espressione di leptina nella regione iperplastico dello stomaco era coerente con i cambiamenti strutturali osservati su H & sezioni E colorate a 1 settimana (Fig. 1b). L'espressione di leptina ha continuato ad aumentare a 12 settimane di alimentazione posta HFD, dopo di che l'espressione di circa recuperato al livello osservato nei topi CD-fed a 20 settimane (Fig. 4b e 4c). In concomitanza con l'alta espressione di leptina a 1 settimana, la fosforilazione di ObRb, STAT3, Akt e ERK, che sono molecole associate con segnalazione recettore della leptina, è stato rilevato nella mucosa gastrica dei topi nutriti HFD-WT (Fig. 5a). Queste molecole sono rimasti attivati ​​a 4 settimane dopo il pasto. Al contrario, la leptina-carente ob /ob
e OBR mutato db /db
topi non hanno mostrato ObRb fosforilata, e solo un po 'esibivano attiva STAT3, Akt e ERK. A sostegno della validità di questi risultati, l'isotipo controllo Ab non ha reagito in modo specifico e nessuna espressione di p-ObRb è stato rilevato in db /db
topi (Fig. 5b e 5c). Figura. 4 Valorizzazione delle espressioni leptina gastrica nel primo periodo di allattamento HFD. una espressione genica di specifiche molecole-gastrico a 1 settimana dopo CD e HFD alimentazione. b sezioni gastrici colorate per leptina in topi alimentati CD o HFD per 1, 12 e 20 settimane. c Quantificazione dell'espressione leptina in (b). I dati sono presentati come l'espressione relativa ad ogni time-point per il livello di espressione del antro di topi CD-fed dopo 1 settimana. la concentrazione di leptina sierica d nei topi nutriti CD e HFD per 1 settimana. I valori rappresentano la media ± SD di 5 topi. I risultati sono stati analizzati mediante Mann-Whitney U
test. * P
< 0.05, ** p
< 0,01
Fig. 5 sovraregolazione del recettore della leptina segnalazione nella mucosa gastrica dei topi HFD-fed WT. un western blot della fosforilazione di ObRb, STAT3, Akt e ERK1 /2 nella mucosa gastrica di WT, ob /ob Comprare e db /db
topi alimentati CD e HFD per 1 e 4 settimane. Un totale di 3 topi sono stati utilizzati in ciascun gruppo di dieta per un esperimento. Ogni esperimento è stato ripetuto due volte e dati rappresentativi sono mostrati. b immunoistochimica e (c) Analisi Western Blot di fosforilazione di OBR nella mucosa gastrica di db /db
topi e topi WT CD nutriti o HFD per 3 settimane. Abbiamo utilizzato 3 topi in ogni analisi, e dati rappresentativi vengono mostrate. Le frecce indicano le cellule fosforilati OBR-positivo
L'infiammazione cronica può innescare gastrite atrofica. IL-6 e IL-11, che sono prevalentemente espressi nello stomaco, modulano le risposte infiammatorie durante la progressione neoplastica [28, 29]. In particolare, IL-11 espressione aumenti gastrite atrofica e in metaplasia intestinale della mucosa fundica [30]. Per identificare potenziali iniziatori di metaplasia intestinale, abbiamo esaminato l'espressione di leptina, IL-6 e IL-11 nella mucosa gastrica. Mentre la leptina è espressa a 1 settimana dopo l'alimentazione, IL6
e IL11
livelli di mRNA non aumentare nel cardias di topi nutriti con HFD fino a 3 settimane dopo la dieta iniziazione (Fig. 6a). Dopo 12 settimane, IL-11 espressione accompagnato un aumento del numero di CD45 + cellule infiltrate (Fig. 6a e 6b). Questi risultati suggeriscono che l'espressione di leptina HFD-indotta e l'attivazione a valle precede l'induzione di citochine infiammatorie durante la metaplasia intestinale. Figura. 6 ritardata induzione di citochine proinfiammatorie nella mucosa gastrica dopo HFD al seno. l'espressione genica di leptina, IL6
, e IL11
nella mucosa gastrica di CD e topi HFD nutriti dopo 1, 3, e 12 settimane. I valori rappresentano la media ± SD di 4 topi. I risultati sono stati analizzati con il test di Kruskal-Wallis. * P
< 0.05, p
< 0.01. b colorazione immunoistologiche delle sezioni dello stomaco di topi CD e HFD-fed con Abs contro IL-11 e CD45
mancanza di leptina segnalazione sopprime gastrico metaplasia intestinale
alimentazione HFD attivato leptina segnalazione, portando a metaplasia intestinale nei topi WT . Viceversa, l'assenza di leptina segnalazione dovrebbe pertanto sopprimere HFD indotta patologia gastrica. Per studiare il ruolo della leptina segnalazione nello sviluppo di metaplasia intestinale, abbiamo esaminato i cambiamenti della mucosa gastrica in ob /ob
topi e leptina recettore mutato db /db
topi leptina-carenti. L'ob /ob
e db /db
topi hanno mostrato un peso corporeo superiore a quello fatto topi WT; Tuttavia, è stata osservata alcuna differenza significativa nel peso corporeo tra CD e topi HFD-alimentati a 1 settimana dopo l'alimentazione (sui file 3: Figura S1a). Il /ob
e db /db
topi ob alimentato il CD per 1 settimana esposto iperinsulinemia, mentre solo HFD-alimentato ob /ob
topi hanno mostrato un aumento dei livelli di insulina. HFD-alimentato db /db
topi hanno mostrato livelli di insulina simili a quelli di db CD-fed /db
topi, a causa della loro resistenza all'insulina (sui file 3: Figura S1b). Il /db
topi db anche esposto hyperleptinemia e hypergluconemia. Tuttavia, l'acido non esterificati grassi (NEFA) la concentrazione non variava tra WT, ob /ob
, e db /db
topi nutriti con CD o HFD (sui file 3: Figura S1b). analisi istopatologica ha rivelato che, rispetto ai topi WT, ob /ob
e db /db
topi che erano obesi e insulino-resistenti o leptin- ha mostrato alcuni cambiamenti morfologici come l'iperplasia della mucosa gastrica cardiale a 1 settimana dopo l'inizio della HFD alimentazione (Fig. 7a). Analisi altezza della mucosa è stata coerente con i risultati istologici (Fig. 7c). Inoltre, l'analisi immunoistochimica rivelato un aumento colocalizzazione Cdx2 e leptina nella mucosa gastrica dei topi WT alimentati HFD per 1 settimana (Fig. 8a), che db /db
topi non ha mostrato espressione Cdx2 in cellule leptina-positive. Al contrario, ob /ob
topi hanno mostrato poco Cdx2 e nessuna espressione di leptina. Allo stesso modo, co-localizzazione di fosforilata ObRb e Cdx2 è stato rilevato nei topi nutriti HFD-WT, ma non in HFD-alimentato ob /ob
o db /db
topi, che ha mostrato solo un po 'di fosforilazione di ObRb o Cdx2, rispettivamente. CD-fed ob /ob e db /db topo hanno mostrato un drastico aumento del peso corporeo ma solo lieve iperplasia nella mucosa gastrica rispetto ai topi WT a 3 settimane (Fig. 7b e 7c). Pur avendo pesi corporei superiori, ob /ob
e db /db
topi nutriti il ​​HFD per 3 settimane esposti meno iperplasia di fatto topi WT alimentati con la HFD per 20 settimane. Dopo 20 settimane di alimentazione HFD, i topi WT presentato una struttura irregolare e fuso al cardias (Fig. 7b). alimentazione HFD non ha aumentato l'espressione di Cdx2 e MUC2 nella mucosa gastrica di ob /ob
e db /db
topi (Fig. 8b). Questi risultati suggeriscono che la leptina segnalazione nello stomaco è un fattore importante che porta alla patologia metaplastica nella gastrite legati all'obesità. Figura. 7 alterazione della morfologia Soppresso gastrico in topi HFD-fed privo di leptina segnalazione. Rappresentante H & E-sezioni della mucosa gastrica dalla WT, ob /ob Comprare e db /db mice
CD alimentati o HFD per 1 (a) e 3 settimane (b). Ciascun valore nelle immagini indica il peso corporeo del topo da cui è stata ottenuta e trattata con H &mucosa gastrica; E-macchia. c misurazione dell'altezza della mucosa nel fondo gastrico di WT, ob /ob
e db /db
topi a 1 e 3 settimane e di topi WT a 20 settimane dopo l'allattamento. I valori rappresentano la media ± SD di 4 topi. I risultati sono stati analizzati con il test di Kruskal-Wallis. * P
< 0.05, ** p
< 0,01
Fig. 8 L'abbassamento dei marcatori epiteliali intestinali nei topi privi di leptina segnalazione. una colorazione immunoistologiche delle sezioni dello stomaco di topi CD e HFD-fed con Abs contro leptina, Cdx2, e p-ObRb. b Gene espressione di Cdx2
e MUC2
nella mucosa gastrica dei topi CD o HFD alimentati per 1 settimana. I valori rappresentano la media ± SD di 4 topi. I risultati sono stati analizzati con il test di Kruskal-Wallis. * P
< 0.01
Discussione
Questo studio presenta la prima prova sostenendo la teoria che HFD indotta migliorata segnalazione recettore della leptina nella mucosa gastrica provoca gastrite atrofica in un modello murino. Abbiamo scoperto che l'alimentazione HFD innesca la produzione leptina e l'attivazione di leptina segnalazione-OBR nella mucosa gastrica, promuovendo gastrite atrofica e metaplasia intestinale. Data la maggiore frequenza di gastrite nei pazienti obesi [31, 32], i nostri risultati convalidano il ruolo della leptina recettore segnalazioni di obesità indotta gastrite atrofica. H. pylori
infezione è considerata una delle principali cause di gastrite cronica e GC [33, 34]; Tuttavia, pochissimi H. pylori
pazienti -infected sviluppano CG [35]. Inoltre, la frequenza di gastrite è significativamente più alta nei pazienti obesi, mentre la prevalenza di H. pylori
infezione è simile in individui obesi e non obesi [2]. Così, l'obesità è un fattore importante che rappresentano la prevalenza di gastrite istologica e la trasformazione delle cellule della mucosa gastrica oltre a H. pylori
infezione.
Oltre al tessuto adiposo, la placenta [36] e ghiandole mammarie [ ,,,0],37, 38] anche produrre leptina, che supporta la proliferazione cellulare trofoblasto per regolare la crescita e lo sviluppo fetale [39, 40] e lo sviluppo della ghiandola mammaria, rispettivamente. In quei tessuti, leptina è prodotta in cellule normali e maligne, e la sua sovraespressione è stata dimostrata in cellule neoplastiche [36, 41]. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.

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