PLoS ONE: Livelli diminuiti di attivo SMAD2 correlazione con prognosi infausta a cancro gastrico

Astratto

Sfondo

TGF-β gioca un doppio ruolo nella progressione del cancro umano. Durante le prime fasi della carcinogenesi funzioni, TGF-beta come un soppressore del tumore. Durante le ultime fasi di sviluppo del tumore, tuttavia, TGF-β può promuovere la crescita del tumore e delle metastasi. Un cambiamento di Smad2 /3 fosforilazione dal capolinea carbossi di Linker siti è un evento chiave che determina la funzione biologica di TGF-β nel colon-retto e il carcinoma epatocellulare. In questo studio, abbiamo studiato il ruolo potenziale del differenziale Smad2 /3 fosforilazione adenocarcinoma gastrico.

Metodologia

La colorazione immunoistochimica con l'anti-P-Smad2 /3C e anticorpi /3L P-Smad2 è stata eseguita su 130 campioni di adenocarcinoma gastrico inclusi in paraffina. Il rapporto tra P-Smad2 /3C e P-Smad2 /3L punteggio immunoistochimica e le caratteristiche clinico-patologici dei pazienti è stata analizzata. Real time PCR è stato utilizzato per misurare l'espressione di mRNA di Smad2 e Smad3 nel cancro e il tessuto circostante non tumorale.

Principali risultati

Nessun significativo P-Smad2L e /o P-Smad3L colorazione positiva era rilevata nella maggior parte dei campioni (colorazione positiva in 18/130 campioni). Positivo P-Smad2 /3L colorazione non è stato associato con una diminuzione della carbossiterminale colorazione fosforilazione. La perdita di P-Smad2C notevolmente correlata con la profondità di infiltrazione del tumore e scarsa differenziazione delle cellule tumorali nei pazienti con cancro gastrico. Nessuna correlazione è stato rilevato tra P-Smad3C e le caratteristiche clinico-patologici di adenocarcinoma gastrico. Tuttavia, l'analisi di co-colorazione rivelato che P-Smad3C co-localizzato con α-SMA e collagene I in cellule di cancro gastrico, che indica un potenziale legame tra P-Smad3C e epiteliali-to-mesenchymal transizione del cancro. Real time PCR ha dimostrato una ridotta espressione di mRNA di Smad2 nel carcinoma gastrico se confrontato con il tessuto circostante non tumorale in 15/16 pazienti.

Conclusioni

La perdita di P-Smad2C strettamente correlato con l'invasione del cancro e scarsa differenziazione nel cancro gastrico. Contrariamente a colon-retto e carcinoma epatocellulare, canonico fosforilazione carbossi-terminale, ma non linker fosforilazione, di Smad2 è fondamentale per il cancro gastrico

Visto:. Wu Y, Li Q, Zhou X, Yu J, Mu Y, Munker S, et al. (2012) diminuzione dei livelli di attivo SMAD2 correlazione con prognosi infausta a cancro gastrico. PLoS ONE 7 (4): e35684. doi: 10.1371 /journal.pone.0035684

Editor: Javier S. Castresana, Università di Navarra, Spagna

Ricevuto: 6 ottobre 2011; Accettato: 20 marzo 2012; Pubblicato: 23 apr 2012

Copyright: © 2012 Wu et al. Questo è un articolo ad accesso libero distribuito sotto i termini della Creative Commons Attribution License, che permette l'uso senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, a condizione che l'autore originale e la fonte sono accreditati

Finanziamento:. Lo studio è stato sostenuto dalla Health Bureau della provincia di Zhejiang della Cina, 2009A065 (YJW); Else-Kröner Fresenius (H.L.W., S.D.); BMBF "Hepatosys" 0313082L, "fegato virtuale" e "terapia cellulare" 01GN0987 (S.D.); Deutsche Forschungsgemeinschaft DO373 /6-1, DO 373 /8-1 (S.D.) e LA997 /5-1 (S.D.); e il Dietmar Hopp Stiftung GmbH (S.D.). I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto

Competere interessi:.. Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi in competizione

Introduzione

cancro gastrico è una delle principali cause di morte per cancro nel mondo, al secondo posto nei maschi e nelle femmine la quarta in frequenza [1]. La patogenesi del cancro gastrico è associato a più fattori. Tra questi, la disregolazione di vie di segnalazione relativi a processi di sviluppo, tra cui fattore di crescita trasformante-β (TGF-β), Wnt /β-catenina, il riccio e la segnalazione Notch, svolge un ruolo centrale nello sviluppo e nella progressione di questo tipo di tumore [2].

La famiglia TGF-β di molecole, tra cui isoforme di TGF-beta, activins e proteine ​​morfogenetiche dell'osso (BMP), ha funzioni importanti in diversi processi fisiologici e fisiopatologici, ad esempio, lo sviluppo embrionale, malattie autoimmuni, la fibrosi e cancro [3], [4]. TGF-β transduces i suoi segnali, stimolando la formazione di complessi heteromeric di tipo TGF-β I (TGF-βRI) e tipo II (TGF-βRII) serina /treonina chinasi recettori. Attivato TGF-βRI propaga segnalazione per il reclutamento e la fosforilazione del recettore-regolato SMADs (R-SMADs, tra cui Smad2 e Smad3). La fosforilazione di residui di serina C-terminale in R SMADs è un passo fondamentale per la canonica di segnalazione del TGF-β. I due più residui di serina C-terminale a serina 465/467 in Smad2 e serina 423/425 in Smad3 sono fosforilata, insieme ad un terzo residuo di serina non fosforilata, formano un motivo SSXS evolutivamente conservato in tutte le R-SMADs [5], [6]. Oltre fosforilazione C-terminale della SMAD2 /3 (P-Smad2C e P-Smad3C) di TGF-βRI, altre chinasi, ad esempio chinasi c-Jun N-terminale (JNK) e chinasi di Ras-associati, causa la fosforilazione di R SMADs in siti linker intorno serina 249/254 in Smad2 e serina 208/213 a Smad3 (P-Smad2L e P-Smad3L) [7 ], [8]. Fosforilata R SMADs formare un complesso con comune Smad (Co-Smad; Smad4 nei mammiferi) e navetta per il nucleo per la trascrizione del gene bersaglio [3]. Oltre a R-Smad e co-Smad, il terzo tipo di proteine ​​Smad è inibitore-Smad (I-Smad; Smad6 e Smad7). I-SMADs sono trascrizionalmente indotta da TGF-β, che indica un meccanismo di feedback negativo di questo percorso di segnalazione [4].

TGF-β gioca un doppio ruolo nella progressione del cancro umano [9], [10] . Nelle prime fasi del cancro, atti TGF-beta come soppressore tumorale inibendo la proliferazione cellulare o promuovendo l'apoptosi cellulare. Tuttavia, nelle ultime fasi, TGF-β supporta la progressione del tumore, come l'invasione delle cellule tumorali, la diffusione e l'evasione immune [9]. Inoltre, TGF-β è ben riconosciuta come mediatore di epitelio-to-mesenchimale transizione (EMT) nel cancro [11]. Anche se le perturbazioni di segnalazione del TGF-β /Smad sono al centro di carcinogenesi nella maggior parte degli organi, il suo tumore promuovere risultato è fortemente dipendente dal contesto. Ad esempio, la segnalazione del TGF-β è fondamentale per il mantenimento di staminali carcinoma a cellule auto-rinnovamento e l'attività oncogeno nel glioma e la leucemia, che gli effetti di segnalazione del TGF-β in cellule staminali del cancro al seno sono controverse [12]. Uno studio ha mostrato che il blocco TGF-β tramite un dominanti negativi TGF-βRII aumenta la dimensione del compartimento staminale seno e promuove tumorigenesi, indicando una soppressione della carcinogenesi seno di questa citochina [13]. Al contrario, Mani e colleghi hanno scoperto che TGF-β noi fondamentale per il mantenimento della proprietà simili alle cellule staminali del cancro al seno e l'attività cancerogena tramite indurre EMT [14].

cancro gastrico, polimorfismi a singolo nucleotide ( SNP) di TGF-β sono associate con la suscettibilità alla fase I e fase II del cancro gastrico [15], [16]. I livelli sierici di TGF-β sono stati segnalati per correlare in modo significativo con l'invasione venosa in pazienti con cancro gastrico [17]. Tuttavia, i meccanismi dettagliati di TGF-β segnalazione nella progressione del cancro gastrico sono ancora sconosciute. Inoltre, non è chiaro quando e come TGF-β trasforma da soppressore del tumore in un promotore tumorale durante la carcinogenesi.

Recentemente, un cambiamento nella fosforilazione di Smad2 /3 dal C-terminale di siti linker è stata dimostrata come un evento chiave che determina la funzione biologica di TGF-β nel cancro [18], [19], [20]. Studi precedenti sulla base di 12 anni di follow-up dimostrato che cronica da HBV /pazienti HCV con P-Smad2 /3L a tessuti del fegato hanno un rischio più elevato di avanzare per il carcinoma epatocellulare (HCC) rispetto a quelli con P-Smad2 /3C [8], [ ,,,0],21]. Coerentemente con i risultati di HCC, osservazioni simili sono state fatte nel tumore del colon-retto [7], [22].

Per esaminare il contributo del differenziale fosforilazione Smad verso carcinogenesi nel cancro gastrico, abbiamo studiato P-Smad2 /3C e P-Smad2 /livelli 3L in 130 pazienti con adenocarcinoma gastrico di immunoistochimica (IHC). Abbiamo analizzato i potenziali correlazioni tra i diversi siti di fosforilazione di R SMADs e l'invasione, metastasi linfonodali, differenziazione e stadio del cancro gastrico.

Risultati

Linker fosforilazione di Smad2 /3 non è associato con cancro gastrico

a differenza di precedenti risultati di cancro del colon-retto e HCC [7], [8], [21], [22], non abbiamo rilevato significativi P-Smad2L e /o P-Smad3L positivo la colorazione nei tessuti gastrici da pazienti con cancro gastrico. Solo 18 su 130 pazienti ha mostrato p-Smad3L colorazione positiva principalmente in cellule non tumorali. Questi risultati suggeriscono che la fosforilazione linker nei siti serina di Smad2 /3 non è critica nel carcinoma gastrico.

caratteristiche differenti di livelli nel carcinoma gastrico P-Smad2C e P-Smad3C

118 di 130 tessuti gastrici hanno mostrato P-Smad2C colorazione positiva, e 91 su 130 tessuti gastrici sono stati positivi per P-Smad3C colorazione rispettivamente. Distinct da P-Smad2C colorazione positiva, solo visualizzando nel nucleo delle cellule normali e tumorali (Fig. 1A), P-Smad3C colorazione positiva è stata dimostrata nel nucleo (59/130, Fig. 1B), a livello della membrana e /o nel citoplasma (73/130, Fig. 1C) di cellule di cancro gastrico. Inoltre, P-Smad3C stato visto da colorazione positiva in fibroblasti circostanti cellule tumorali (81/130 e 91/130, Fig. 1D).

ridotta P-Smad2C correla notevolmente con la profondità del tumore (T) e differenziazione di cancro (G) in pazienti con cancro gastrico

Abbiamo misurato P-Smad2C IHC colorazione non solo nel tumore, ma anche nei tessuti circostanti non tumorali da 130 pazienti con cancro gastrico. P-Smad2C colorazione positiva nelle cellule tumorali sia o normali inversamente correlata con la differenziazione del cancro gastrico (sia p
< 0,0001, tabella 1). Inoltre, è diminuito il punteggio P-Smad2C IHC nelle cellule tumorali correlate con la profondità del tumore ( p
< 0,05, tabella 1). i livelli di P-Smad2C in tessuto normale e hanno mostrato una correlazione inversa con l'invasione potenziale cancro in questi pazienti ( p
= 0,07, tabella 1). Il punteggio P-Smad2C IHC era significativamente diminuito nei tessuti tumorali rispetto ai tessuti non tumorali in 77 di 130 pazienti con cancro gastrico. Inoltre, all'interno dei tessuti tumorali, le cellule tumorali con atipie scarsamente hanno mostrato una diminuzione P-Smad2C colorazione, se confrontato con quelli ben differenziati (Fig. 2). Kendall-tau analisi di correlazione ha rivelato una potenziale correlazione tra la riduzione di P-Smad2C colorazione e il passaggio da normale a cellule tumorali nel cancro gastrico ( p
= 0.05, tabella 2), suggerendo che l'attivazione del segnale è un Smad2 soppressore critica della formazione del tumore e la progressione.

P-Smad3C si trova spesso in cancro associato fibroblasti

P-Smad3C punteggio IHC non ha mostrato una correlazione significativa con T /N /G /S di campioni di cancro gastrico (Tabella 1). Tuttavia, P-Smad3C colorazione positiva spesso si è verificato nei fibroblasti che circondano le cellule tumorali nei pazienti con cancro gastrico (Fig. 1).

Le cellule tumorali sono di origine epiteliale e non esprimono i marcatori mesenchimali, ad esempio alfa-SMA e collagene I. Se le cellule tumorali esprimono i marcatori mesenchimali, è suggestivo di epitelio-to-mesenchimale transizione (EMT) [11]. Nel presente studio, abbiamo trovato α-SMA colorazione positiva nelle cellule tumorali nel 54 di 130 pazienti con cancro gastrico (per esempio il paziente-1 in Fig. 3). Per chiarire la potenziale correlazione tra p-Smad3C e EMT, abbiamo studiato la correlazione tra p-Smad3C colorazione (cancro e il tessuto circostante non il cancro) e α-SMA colorazione positiva nelle cellule tumorali. Kendall-tau coefficienti di correlazione tra i punteggi rango p-Smad3C IHC nel cancro /circostanti punteggi di tessuto non-cancro e α-SMA IHC nel cancro sono 0,14 ( p
= 0,08) e -0.09 ( p
= 0.99), rispettivamente (Tabella 3). A conferma di EMT in questi pazienti, abbiamo eseguito co-colorazione per LUMACA, un altro marcatore specifico per EMT, e collagene I /α-SMA nei tessuti gastrici. La microscopia confocale ha rivelato co-localizzazione di lumaca e collagene I (Fig. 4A) /α-SMA (Fig. 4B) in alcune cellule di cancro gastrico. Queste cellule di cancro gastrico positivi α-SMA e visualizzate P-Smad3C colorazione positiva (Fig. 4C). Oltre co-localizzazione con le cellule di cancro gastrico positivi α-SMA, microscopia confocale ha rivelato che il P-Smad3C co-localizzato con collagene I in cellule di cancro gastrico (Fig. 4D). Inoltre, P-Smad3C colorazione positiva co-localizzato con α-SMA e collagene non solo nelle cellule tumorali, ma anche in fibroblasti (Fig. 4C-4D). Questi risultati suggeriscono che la P-Smad3C può contribuire a EMT del cancro gastrico in alcuni pazienti.

Perdita di espressione totale Smad2 e Smad3 in pazienti con cancro gastrico

Oltre a misurare P-Smad2 in cancro gastrico , abbiamo utilizzato real-time PCR per rilevare l'espressione di mRNA di Smad2 e Smad3 nel tumore gastrico e tessuti non tumorali circostanti da 16 pazienti. 15 e 12 pazienti, rispettivamente dimostrato diminuita espressione di mRNA di Smad2 e Smad3 nei tessuti tumorali, rispetto ai tessuti normali circostanti (Fig. 5). Questi risultati indicano che non solo attivato Smad2 ma anche l'espressione di mRNA del totale Smad2 è ridotto durante la carcinogenesi gastrica.

Discussione

In adenocarcinoma del colon-retto e HCC, un cambiamento di fosforilazione da carbossi-terminale per regioni linker è stato suggerito come un evento critico associato con l'interruttore di TGF-β da un soppressore di cancro per un fattore oncogenico [8], [18], [19], [20], [21], [22]. Nel presente studio, abbiamo esaminato questo potenziale associazione nel cancro gastrico. Non abbiamo rilevato significativi livelli di P-Smad2L e P-Smad3L in 130 pazienti con cancro gastrico. 112 su 130 pazienti non mostravano P-Smad2L o P-Smad3L colorazione in cellule di cancro gastrico, suggerendo che lo spostamento proposto fosforilazione di R-Smad non può contribuire al TGF-β cancerogenesi mediata in questo tipo di cancro. In contrasto con P-Smad2 /3L, sia P-Smad2C e P-Smad3C colorazione positiva è stata rilevata nella maggior parte dei pazienti affetti da cancro gastrico. Kendall-tau analisi di correlazione di rango ha rivelato che il punteggio P-Smad2C IHC correlato inversamente con la profondità di tumore (T) e la differenziazione del cancro (G).

Il ruolo del Smad2 durante la formazione e la progressione di diversi tipi di cancro rimane controverso . Coerentemente con il ritrovamento corrente, precedenti studi sul carcinoma esofageo a cellule squamose, cancro al seno e il cancro colorettale hanno dimostrato che la perdita di espressione Smad2 è correlata con lo sviluppo del tumore e la prognosi infausta [23], [24], [25], [26]. Recentemente, Hoot e colleghi hanno scoperto che Smad2, ma non Smad3, è stato spesso perso in 83 pazienti con carcinoma della pelle a cellule squamose. Inoltre, i topi con specifiche cheratinociti Smad2 eliminazione visualizzati formazione accelerata e la progressione maligna dei tumori della pelle di topo indotto chimicamente rispetto ai topi wild-type [27]. Tuttavia, in uno studio condotto su 52 pazienti con glioma, un punteggio positivo P-Smad2 IHC è stato segnalato per correlare con la proliferazione dei gliomi e prognosi infausta [28]. Prima di questo studio, Shinto e colleghi hanno misurato P-Smad2C colorazione in 135 pazienti con cancro gastrico. Essi hanno scoperto che i livelli di P-Smad2C erano più elevati nei tumori scarsamente differenziati rispetto a quelli ben differenziati [29]. Non è ancora chiaro il motivo per cui non ci sono assolutamente i risultati opposti a cancro gastrico.

In canonica TGF-β, attivato TGF-βRI solito induce fosforilazione carbossi-terminale sia Smad2 e Smad3. Attivato Smad2 e Smad3 svolgono ruoli diversi nella crescita cellulare, la differenziazione e di altre funzioni biologiche [30]. Nel fegato, Smad2 è fondamentale nel mediare la crescita degli epatociti e la differenziazione, mentre Smad3 svolge un effetto fondamentale nella maturazione morfologica e funzionale delle cellule stellate epatiche [31], [32]. Nel cancro, è controverso se interruzione del gene Smad3 contribuisce tumorigenesi. Zhu ha riferito che i topi Smad3-deficienti sviluppare carcinoma del colon [33]. Tuttavia, altri studi su topi con deficit Smad3 suggerito che la perdita di Smad3 da sola non è sufficiente per avviare tumorigenesi [34], [35], [36], [37]. Nel cancro gastrico, Han trovato bassi livelli di Smad3 in 3 su 8 pazienti e in nove linee di cellule di cancro gastrico umano [38]. Introduzione di un vettore Smad3 in linee cellulari gastrici restaurato TGF-β reattività. Inoltre, l'iniezione di Smad3 che esprimono cellule gastriche in topi nudi ha mostrato in ritardo tumorigenesi rispetto ai controlli, che indica una correlazione di perdita di Smad3 con cancerogenesi [38]. Nel presente studio, non abbiamo trovato una correlazione significativa tra P-Smad3C colorazione nelle cellule di cancro gastrico e l'invasione del cancro, la differenziazione e lo stadio. Distinct da P-Smad2C, che è espresso solo nei nuclei delle cellule, P-Smad3C colorazione positiva è rilevabile nel nucleo, nella membrana e nel citoplasma di cellule di cancro gastrico. La rilevanza biologica di diversi modelli di P-Smad3C colorazione nelle cellule tumorali è attualmente ancora sconosciuta.

EMT delle cellule tumorali è un prerequisito per la progressione di tumori metastatici avanzate [11]. E 'stato riconosciuto che il TGF-β è un giocatore importante in EMT. Smad3, ma non Smad2, è un mediatore chiave nella TGF-β EMT dipendente [39]. Per esempio, TGF-β non riesce a indurre EMT nelle cellule epiteliali tubulari primarie derivate da reni di topi Smad3-deficienti [40]. L'inibizione della segnalazione del TGF-β da Ki26894, un inibitore TGF-βRI, diminuito invasione e EMT di cancro gastrico scirrhous in vitro
[41]. I nostri risultati mostrano che una parte di cellule di cancro gastrico esprimere marcatori EMT, per esempio Lumaca, collagene I e α-SMA. Co-localizzazione di P-Smad3C con α-SMA /collagene I è situato in un sottogruppo di pazienti sostanziale. Inoltre, α-SMA colorazione positiva nelle cellule tumorali ha un potenziale correlazione con il punteggio P-Smad3C IHC delle cellule tumorali, ma non circostante tessuti non tumorali. Questi risultati indicano che la P-Smad3C potrebbe svolgere un ruolo nel EMT del cancro gastrico.

In sintesi, questo studio suggerisce che Smad2 è un mediatore importante difendere cellule gastriche di progredire verso il cancro scarsamente differenziato. Secondo i nostri risultati, Smad3 non è direttamente collegato con caratteristiche di cancro gastrico, tuttavia, i nostri dati indicano che essa può svolgere un ruolo nel cancro associato fibroblasti e EMT delle cellule di cancro gastrico.

Metodi

I pazienti

campioni chirurgici sono stati esaminati da pazienti con cancro gastrico primario presso il Dipartimento di Chirurgia Generale, il primo ospedale affiliato, Facoltà di medicina, Università di Zhejiang, in Cina dal 2003 al 2009. I campioni di tessuto gastrico sono stati raccolti durante interventi chirurgici sezionati il cancro gastrico. I tessuti prelevati inclusi tumore e aree non tumorali circostanti (tessuti almeno più di 5 cm lontano dal tumore). Una parte dei tessuti sono stati fissati con il 4% in formaldeide e inclusi in paraffina per l'istologia e la misurazione IHC. tessuti freschi sono rimasti sono stati messi in azoto liquido immediatamente per la misurazione mRNA. Un totale di 130 tessuti gastrici accoppiati tra cui il cancro e tessuti non tumorali circostanti sono stati arruolati. diagnosi patologica e le classificazioni sono state stimate secondo la classificazione del tumore-node-metastasi (TNM) sostenuto dall'Unione internazionale contro il cancro (settima edizione) [42]. Caratteristiche di base dei pazienti arruolati sono riportate nella Tabella 4. Il protocollo dello studio adeguato alle linee guida etiche della Dichiarazione di Helsinki (1975). Lo studio è stato approvato dal comitato etico del primo ospedale affiliato, Facoltà di Medicina, Università di Zhejiang. consensi informato scritto sono stati ottenuti da tutti i partecipanti coinvolti nello studio.

Anticorpi

anticorpi policlonale di coniglio contro P-Smad2C (ser 465/467), P-Smad3C (ser 423/425), P-Smad2L (ser 250/255), e P-Smad3L (ser 208/213) sono stati descritti in studi precedenti [43], [44]. Mouse anti-umano α-SMA (m0851), policlonale anti-LUMACA (ab-17732), e monoclonale anti-collagene I (C2456) anticorpi sono stati acquistati da DAKO, Abcam e Sigma, rispettivamente.

immunoistochimica (IHC )

Dopo aver esaminato i H & scivoli e-colorati provenienti da 130 pazienti arruolati con cancro gastrico, blocchi rappresentativi di paraffina per ogni paziente sono stati selezionati per la sezione. I vetrini sono stati deparaffinised in xilene e reidratate in una serie di diluizioni di etanolo graduata di acqua distillata. Antigen recupero è stata eseguita mediante trattamento a microonde in tampone EDTA (1 mMol, pH 8,0). I vetrini sono stati quindi trattati con 3% H _{2O 2 per 30 min a temperatura ambiente. Dopo aver lavato con PBS per tre volte, le diapositive sono state incubate con l'anticorpo policlonale di coniglio contro P-Smad2C (1:100), P-Smad3C (1:100), P-Smad2L (1:50), P-Smad3L (1:50 ) e α-SMA (1:200) rispettivamente a 4 ° C durante la notte. Il giorno dopo, le diapositive sono state lavate con PBS per tre volte. Dopo il lavaggio, sono stati incubati con EnVision perossidasi (Dako) -labeled anti-coniglio o anticorpo anti-topo per 1 ora a temperatura ambiente. perossidasi è stata rilevata con diaminobenzidina (DAB). I vetrini sono stati di contrasto con ematossilina. Immunoreattività è stata visualizzata al microscopio ottico}

Per l'analisi semiquantitativa, le sezioni di tessuto colorate sono stati valutati in una scala di 4 punti come segue: la conta delle cellule positivo, gradi 0-3 (0, nessun cellule positive, 1, <.; 25% di cellule positive, 2, 25% -50% di cellule positive, 3, > 50% cellule positive); intensità della colorazione positiva, gradi 1-3 (1, debole colorazione positiva, di solito di colore giallo, 2, forte colorazione positiva, di solito marrone, 3, molto forte colorazione positiva, di solito marrone scuro al nero). Il punteggio finale colorazione immunitario è stato calcolato come numero × intensità.

Immunofluorescenza

I vetrini sono stati deparaffinised in xilene e reidratate in etanolo graduato fino acqua distillata. Poi recupero dell'antigene è stata eseguita mediante trattamento a microonde in tampone EDTA (1 mMol, pH 8,0). I vetrini sono stati quindi trattati con 3% H _{2O 2 per 30 min a temperatura ambiente. Dopo lavaggio con PBS, sia anticorpi primari, coniglio anti-P-Smad3C /lumaca e topo anti-α-SMA /collagene I, sono state applicate a 4 ° C durante la notte. Poi, anticorpi secondari, Alexa633-coniglio anti-topo immunoglobulina G e Alexa488-asino anti-coniglio immunoglobuline G (Molecular Probes /Invitrogen, Karlsruhe, Germania), sono state applicate per 30 minuti a temperatura ambiente. I campioni sono stati montati utilizzando Dako-Cytomation fluorescente Mezzo di montaggio. I vetrini sono stati ispezionati e foto sono state scattate su un microscopio confocale (Leica, Heidelberg). Sezioni senza anticorpi primari sono stati utilizzati come controlli negativi.}

Real time PCR

L'RNA totale è stato purificato dai tessuti gastrici con l'Alto kit di isolamento dell'RNA Pure (Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germania) secondo al protocollo del produttore, e la concentrazione è stata misurata spettrofotometricamente. cDNA è stato sintetizzato da 1 mg di RNA con il Transcriptor First Strand cDNA kit di sintesi (Roche Diagnostics). Quantitativa real-time PCR è stata eseguita con un sistema di rilevamento di sequenza ABIPrism 7700 (Applied Biosystems) utilizzando un master mix TaqMan Universal PCR No AmpErase UNG (n. 4.324.018). Le seguenti analisi di espressione genica sono stati utilizzati: Smad2 (avanti: CAAACCAGGTCTCTTGATGG; inverso: GAGGCGGAAGTTCTGTTAGG), Smad3 (avanti: GGAGAAATGGTGCGAGAAGG; inverso: GAAGGCGAACTCACACAGC) e peptidylprolyl isomerasi A (gene housekeeping; parte non Mm02342429_g1..). Tutti i reagenti sono stati acquistati dalla Applied Biosystems. I campioni sono stati eseguiti in triplicato, alle seguenti condizioni: denaturazione iniziale per 2 minuti a 50 ° C e per 10 minuti a 95 ° C seguiti da 40 cicli di 15 s a 95 ° C e 1 minuto a 60 ° C. I livelli di espressione genica in ogni campione sono stati determinati con il metodo di soglia ciclo comparativo.

Analisi statistica

Per valutare l'associazione tra i marcatori immunoistologici selezionati ed i parametri di tumore, è stata eseguita Kendall-tau analisi di correlazione rango utilizzando SAS versione 9.2 (Cary, NC, USA). A p
. ≪ 0.05 è stato considerato statisticamente significativo

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