PLoS ONE: smanjena razina Active Smad2 koreliraju s lošom prognozom u rak želuca

Sažetak pregled

Pozadina pregled

TGF-β igra dvostruku ulogu u progresiji tumora kod ljudi. Tijekom ranih faza karcinogeneze, TGF-beta djeluje kao supresor tumora. U kasnim stupnjevima razvoja tumora, međutim, TGF-β može poticati tumorski rast i metastaziranje. Pomak u Smad2 /3 fosforilacije od karboksi kraja za veznih mjesta je ključni događaj određivanje biološku funkciju TGF-P u debelom crijevu i hepatocelularnog karcinoma. U ovom istraživanju, istražili smo potencijalnu ulogu diferencijalne Smad2 /3 fosforilacije u želučanog adenokarcinoma. Pregled

Metodologija pregled

Imunohistokemijsko bojanje s anti-P-Smad2 /3C i P-Smad2 /3L antitijela izvedena je na 130 parafin uklopljenih želuca adenokarcinoma uzorcima. analiziran je odnos između P-Smad2 /3C i P-Smad2 /3L imunohistokemijski rezultat i kliničko karakteristike pacijenata. PCR u realnom vremenu koristi se za mjerenje ekspresije mRNA za Smad2 i Smad3 kod raka i okolnim non-tumorsko tkivo. Pregled

glavnih nalaza

Nema značajne P-Smad2L i /ili P-Smad3L pozitivno se otkrivena u većini uzoraka (pozitivna u bojenje 18/130 uzoraka). Pozitivna P-Smad2 /3L bojenja nije bila povezana sa smanjenjem carboxyterminal fosforilaciju bojenja. Gubitak P-Smad2C značajno korelira s dubinom tumora infiltracije i slabe diferencijaciji tumorskih stanica u pacijenata s karcinomom želuca. Ne korelacija nije bila otkrivena između P-Smad3C i kliničko karakteristikama želučanog adenokarcinoma. Međutim, ko-bojenje analiza je pokazala da P-Smad3C lokalizirani sa a-SMA i kolagena I u stanicama raka želuca, što ukazuje na moguću vezu između P-Smad3C i epitelnih-to-mezenhimalnog tranzicije raka. PCR u realnom vremenu pokazala je smanjena ekspresija mRNA za Smad2 karcinoma želuca u usporedbi s okolnim non-tumorsko tkivo u 15/16 bolesnika. Pregled

Zaključci

Gubitak P-Smad2C čvrsto povezana s invazijom raka i loša diferencijacija kod raka želuca. Suprotno debelom crijevu i hepatocelularnog karcinoma, kanonske karboksi kraj fosforilacije, ali ne i linker fosforilaciju, od Smad2 je kritična za rak želuca pregled

Izvor:. Wu Y, Li Q, Zhou X, Yu J, Mu Y, Munker S, et al. (2012) Smanjen razinom aktivne Smad2 koreliraju s lošom prognozom u rak želuca. PLoS ONE 7 (4): e35684. doi: 10,1371 /journal.pone.0035684 pregled

Urednik: Javier S. Castresana, Sveučilište Navarra, Španjolska pregled

Primljeno: 6. listopada 2011; Prihvaćeno: 20. ožujka 2012. godine; Objavljeno: 23. travanj 2012 pregled

Copyright: © 2012 Wu i sur. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Studija je podržan od strane zdravstvenog zavoda provincije Zhejiang u Kini, 2009A065 (YJW); Drugo-Kroner Fresenius (H.L.W., S. D.); BMBF "Hepatosys" 0313082L, "Virtualni jetre" i "stanična terapija" 01GN0987 (CD); Deutsche Forschungsgemeinschaft DO373 /6-1, DO 373 /8-1 (CD) i LA997 /5-1 (CD); a Dietmar Hopp Stiftung GmbH (CD). U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

rak želuca je vodeći uzrok raka povezanih smrti u svijetu, drugi rang u muškaraca i četvrti u ženki u frekvenciji [1]. Patogeneza karcinoma želuca povezan s više faktora. Među njima, deregulacija signalnih puteva u vezi s razvojnim procesima, uključujući transformirajući čimbenik rasta-beta (TGF-P), Wnt /β-katenina, hedgehog i signaliziranje Notch, igra središnju ulogu u razvoju i napredovanju ovog raka [2]. pregled

TGF-β obitelj molekula, uključujući i TGF-ß izoforme, aktivina i koštanih morfogenetskih proteina (BMP), ima važne funkcije u različitim fiziološkim i patofiziološkim procesima, npr embrionalnom razvoju, autoimune bolesti, fibroze i raka [3], [4]. TGF-β prenosi signale na poticanjem nastajanje heteromernim kompleksima TGF-P tip I (TGF-βRI) i tip II (TGF-βRII) serin /treonin kinaza receptora. Aktiviran TGF-βRI propagira signalizaciju zapošljavanjem i fosforilacije receptora-reguliranim Smad (R Smad, uključujući Smad2 i Smad3). Fosforilacija C-terminalnih serin ostataka u R Smad je ključni korak za kanonske TGF-beta signalizacija. Slijedeća dva su C-terminalni serin ostataka serina 465/467 u Smad2 i serin 423/425 u Smad3 fosforilirana, zajedno s trećim nisu fosforilirani serin ostatak, formiraju evolucijski konzerviranih SSXS motiv u svim R Smad [5] [6]. Osim C-terminalni fosforilaciju Smad2 /3 (P-Smad2C i P-Smad3C) TGF-βRI, druge kinaze, na primjer c-Jun N-terminalne kinaze (JNK) i Ras-povezane kinaze, uzrok fosforilacija R Smad kod veznih mjesta oko serin 249/254 u Smad2 i serin 208/213 u Smad3 (P-Smad2L i P-Smad3L) [7 ], [8]. Fosforiliranog R-Smad tvoriti kompleks sa zajedničkim Smad (Co-Smad, Smad4 u sisavaca) i prijevoz u jezgru za ciljne transkripcije gena [3]. Osim R-Smad i ko-Smad, treća vrsta Smad proteina je inhibitor-Smad (I-Smad; Smad6 i Smad7). I-Smad transkripcijski inducirani TGF-P, što ukazuje na negativni povratni mehanizam za ove signalne staze. [4] pregled

TGF-β ima dvostruku ulogu u napredovanju raka kod ljudi [9], [10] , U ranim stadijima raka, TGF-beta djeluje kao supresor tumora inhibicijom stanične proliferacije ili poticanjem stanične apoptoze. Međutim, u kasnim fazama, TGF-β podržava tumorski rast, kao što su stanica tumora, širenje i imunološki utaje [9]. Osim toga, TGF-β i prepoznat je kao posrednik epitelnih-na-mczcnhimnog tranzicije (EMT) u raka [11]. Iako perturbacije TGF-β /Smad signalizacije centralno mjesto u procesu karcinogeneze u većini organa, njegov tumor promoviranje ishod je vrlo ovisna o kontekstu. Na primjer, TGF-β signaliziranje ključne u održavanju matičnih stanica raka samoobnovu i tumorskih djelovanja u gliom i leukemije, dok su učinci TGF-P signalizacijom kod raka dojke matičnih stanica kontroverzna [12]. Jedna studija je pokazala da blokira TGF-ß put preko dominantnog negativnog TGF-βRII povećava veličinu pretinca dojke matičnih stanica i potiče tumorigenezi, što ukazuje na suzbijanju dojke karcinogeneze ovog citokina [13]. S druge strane, Mani i njezini kolege otkrili da TGF-ß put nas kritična za održavanje rak dojke matičnih stanica, kao što su svojstva i tumorskih aktivnosti putem izazivanja EMT [14].

karcinoma želuca, single-polimorfizama ( SNP) TGF-ß su povezane s osjetljivošću do stadija i i faze II rakom želuca [15], [16]. Razine u serumu TGF-ß su prijavili značajno korelira s venskom invazije u bolesnika s rakom želuca [17]. Međutim, podrobnosti mehanizama TGF-ß signalizacije u želučanom progresiju raka su još uvijek nepoznati. Pored toga, ostaje nejasno kako i kada TGF-β pretvara s tumor-supresor u promotor tumora tijekom karcinogeneze. Pregled

Nedavno promjena u fosforilaciji Smad2 /3 od C-kraja do veznih mjesta pokazana kao ključni događaj utvrđivanje biološke funkcije TGF-ß u raka [18], [19], [20]. Prethodne studije se temelje na 12 godina praćenja pokazali da kronični HBV /HCV bolesnici s P-Smad2 /3L u tkiva jetre imali su veći rizik od napredovanje hepatocelularnog karcinoma (HCC) od onih s P-Smad2 /3C [8], [ ,,,0],21]. U skladu s nalazima u HCC, slična zapažanja su u rak debelog crijeva [7], [22]. Pregled

Kako ispitati doprinos diferencijalne Smad fosforilacije prema karcinogeneze kod raka želuca, istražili smo P-Smad2 /3C i P-Smad2 /3L razina u 130 bolesnika s želučanim adenokarcinoma imunohistokemijski (IHC). Analizirali smo potencijalne korelacije između različitih mjesta fosforilacije R Smad i invazije, limfnih čvorova metastaze, diferencijaciju i stadij raka želuca. pregled

Rezultati

fosforilacija spojnice Smad2 /3 nije povezan s rakom želuca Netlogu

za razliku od prethodnih nalaza iz debelog crijeva i HCC [7], [8], [21], [22], nismo otkriti značajne P-Smad2L i /ili P-Smad3L pozitivno bojenje u želučanim tkivima bolesnika s karcinomom želuca. Samo 18 od ukupno 130 pacijenata pokazalo je p-Smad3L pozitivno bojenje uglavnom u stanicama ne-raka. Ovi rezultati ukazuju na to da je fosforilacija povezivač u serin mjesta Smad2 /3 nije kritična želuca. Pregled

različite značajke P-Smad2C i P-Smad3C razine u karcinomu želuca pregled

118 od 130 želučani tkiva pokazala P-Smad2C pozitivno bojenje, i 91 od ukupno 130 želučani tkiva pozitivna su za P-Smad3C bojenja respektivno. Razlikuje od P-Smad2C pozitivnim bojanjem, koje je samo prikazuje u jezgri normalnih stanica i stanica raka (Sl. 1A), P-Smad3C pozitivno bojanje pokazana je u jezgri (59/130, Sl. 1B), na membrani i /ili u citoplazmi (73/130, sl. 1 C) želučanih stanica raka. Osim toga, P-Smad3C je vidjelo pozitivnim bojanjem u fibroblastima koje okružuje stanice raka (81/130 i 91/130, sl. 1d), pregled

smanjene P-Smad2C značajno korelira s dubinom tumora (T) i diferencijaciju raka (G) u bolesnika s želučanim raka

izmjeren p-Smad2C IHH bojanje, ne samo u tumoru nego u okolini bez tumorskih tkiva od 130 pacijenata s karcinomom želuca. P-Smad2C pozitivno bojanje u bilo raka ili normalnim stanicama obrnutoj su korelaciji s diferencijacijom raka želuca (i p pregled i 0,0001, tablica 1). Osim toga, smanjenje P-Smad2C IHC rezultat u stanicama karcinoma u korelaciji s dubinom tumora ( p pregled i 0.05, Tablica 1). P-Smad2C razina u normalnom tkivu i pokazao potencijal inverzni korelaciju s raka invazije tih pacijenata ( p pregled = 0,07, tablica 1). P-Smad2C IHC rezultat bio je značajno smanjen u tkivu raka u usporedbi s ne-tumorskih tkiva u 77 od ukupno 130 bolesnika s karcinomom želuca. Osim toga, u tumorskim tkivima, stanice raka s slabo atipiji pokazale smanjenu P-Smad2C bojanje, u usporedbi s dobro diferenciranih one (sl. 2). Kendall-tau korelacijska analiza pokazala potencijalnu povezanost redukcijom P-Smad2C bojenja i prijelaz iz normalnog u stanicama karcinoma u raka želuca ( p pregled = 0,05, tablica 2), što ukazuje da aktiviranje Smad2 signalizaciju je kritična supresor formacije i progresije tumora. pregled

p-Smad3C često nalazi iu raka povezan fibroblasta pregled

p-Smad3C IHC rezultat ne pokazuju značajnu korelaciju s T /N /G /s iz uzorci raka želuca (Tablica 1). Međutim, P-Smad3C pozitivno bojanje često se dogodila u fibroblasta koje okružuje stanice raka u bolesnika s karcinomom želuca (Sl. 1). Pregled

Stanice raka su epitelnog porijekla i ne izražavaju mczcnhimnog markere, npr a-SMA i kolagena I. Ako se stanice raka izražavaju mczcnhimnog markere, to je sugestivan epitelnih-na-mczcnhimnog tranzicije (EMT) [11]. U ovom istraživanju, otkrili smo α-SMA pozitivno bojanje u stanicama raka u 54 od 130 bolesnika s karcinomom želuca (npr pacijent-1 na sl. 3). Da pojasnimo potencijalnu vezu između p-Smad3C i EMT, istražili smo povezanost između p-Smad3C bojenja (rak i okolnog ne-raka tkiva) i α-SMA pozitivnim bojanjem u stanicama raka. Kendall-tau koeficijenti rang korelacije između p-Smad3C IHC rezultate u rak /okolna non-raka tkiva i α-SMA IHC rezultate u rak su 0.14 ( p pregled = 0,08) i -0,09 ( p
= 0,99), odnosno (tablica 3). Za potvrdu EMT u tih bolesnika, proveli smo suradnju bojanje puž, drugo specifična oznaka za EMT i kolagena I /α-SMA u želučanim tkiva. Osnove optike mikroskopija pokazala ko-lokalizacija puž i kolagena I (Sl. 4A) /α-SMA (Sl. 4B) u nekim želučanih stanica raka. Ove α-SMA pozitivnih želučane stanice raka, kao i prikazani P-Smad3C pozitivno bojenje (Sl. 4c). Osim ko-lokaliziranje s α-SMA pozitivnih stanica raka želuca, konfokalnom mikroskopijom pokazala da P-Smad3C lokalizirani sa kolagenom I u želučanom stanica raka (Sl. 4D). Nadalje, P-Smad3C pozitivno bojanje lokalizirani sa a-SMA i kolagena I to ne samo u stanicama raka, ali također u fibroblaste (Sl. 4C-4D). Ovi rezultati ukazuju da P-Smad3C mogu doprinijeti EMT raka želuca u nekih bolesnika. Pregled

gubitak ukupne Smad2 i Smad3 ekspresiju u bolesnika s želučanim raka

Pored mjerenja P-Smad2 kod raka želuca koristili smo u realnom vremenu PCR za detekciju ekspresije mRNA za Smad2 i Smad3 kod raka želuca i okolnim ne-tumorskih tkiva od 16 bolesnika. 15 i 12 pacijenata odnosno pokazali smanjenje ekspresije mRNA Smad2 i Smad3 u tkivu raka, u usporedbi s okolnim normalna tkiva (Sl. 5). Ovi rezultati pokazuju da ne samo da aktivirani Smad2 ali i mRNA ukupnog Smad2 smanjuje tijekom želučane karcinogeneze. Pregled

Rasprava pregled

kolorektalni adenokarcinom i HCC, promjena u fosforilaciji s karboksi-kraju spojnim područjima je predložen kao ključni događaj povezan s prekidačem za TGF-P iz supresor tumora na onkogene faktor [8], [18], [19], [20], [21], [22]. U ovom istraživanju ispitali smo taj potencijalni udrugu u raka želuca. Nismo otkrili značajne P-Smad2L i P-Smad3L razine u 130 bolesnika s karcinomom želuca. 112 od 130 pacijenata nije pokazao P-Smad2L ili P-Smad3L bojanje u stanicama raka želuca, što ukazuje da je predloženi pomak u fosforilaciju R-Smad ne može doprinijeti TGF-P posredovanog karcinogeneze u ovoj vrsti raka. Za razliku od P-Smad2 /3L, kako P-Smad2C i P-Smad3C pozitivno bojenje otkrivena je kod većine pacijenata s karcinomom želuca. Kendall-tau rang korelacija analiza pokazala je da je P-Smad2C IHC ocjena obrnuto korelira s dubinom od tumora (T) i diferencijacije karcinoma (G). Pregled

Uloga Smad2 tijekom formiranja i progresiju drugu vrstu raka i dalje je kontroverzna , U skladu s trenutnom nalaza, prethodne studije o jednjaka karcinom pločastih stanica, raka dojke i raka debelog crijeva pokazala je da gubitak Smad2 izražavanja u korelaciji s razvojem tumora i lošom prognozom [23], [24], [25], [26]. Nedavno, Hoot i kolege otkrili su da Smad2, ali ne Smad3, često je izgubljen u 83 bolesnika s karcinomom kože pločastih stanica. Nadalje, miševi s keratinocita specifične Smad2 brisanja prikazuje ubrzano formiranje i malignu progresiju kemijski inducirane mišem tumora kože u usporedbi s miševa divljeg tipa [27]. Međutim, u studiji od 52 pacijenata s glioma, pozitivan P-Smad2 IHC rezultat je prijavljen u korelaciji s proliferacijom glioma i lošom prognozom [28]. Prije ovog istraživanja, shinto i kolege mjeriti P-Smad2C bojenje u 135 bolesnika s karcinomom želuca. Otkrili su da se razina P-Smad2C bila je viša u slabo diferencirani karcinom u usporedbi s dobro diferenciranim one [29]. Nije jasno, ali zašto postoje vrlo oprečna rezultati u raka želuca. Pregled

U kanonskom TGF-ß signalizacije, aktivira TGF-βRI obično izaziva karboksilnu-terminalnu fosforilaciju oba Smad2 i Smad3. Aktivirani Smad2 i Smad3 imaju različite uloge u stanični rast, diferencijaciju i drugih bioloških funkcija [30]. U jetri Smad2 je kritična u posredovanju rasta hepatocita i diferencijacije, dok Smad3 igra ključnu učinak na morfološke i funkcionalne sazrijevanje jetrenih zvjezdastih stanica [31], [32]. Kod raka, to je sporno je li poremećaj gena Smad3 doprinosi nastanku tumora. Zhu je izvijestio da Smad3 miševi s nedostatkom razviti karcinom debelog crijeva [33]. Međutim, druge studije koje koriste Smad3 miševi s nedostatkom sugerirao da je gubitak Smad3 sam nije dovoljan da pokrene tumorigenezi [34], [35], [36], [37]. U karcinomu želuca, Han pronađeno niske razine Smad3 u 3 od 8 pacijenata i u devet staničnih linija raka želuca [38]. Uvođenje Smad3 vektora u stanicama želučane obnovljena TGF-ß brzinu. Nadalje, injekcija Smad3-izražavanje želučanih stanica u golim miševima pokazala su odgođeni tumorigenezi u usporedbi s kontrolnom skupinom, što ukazuje na povezanost gubitka Smad3 s karcinogeneze [38]. U ovom istraživanju, nismo pronašli značajnu povezanost između P-Smad3C bojanja u želučanih stanica raka i invaziju raka, diferencijacije i pozornice. Različit od P-Smad2C, koje se tek izraženog u jezgrama stanica, P-Smad3C pozitivno bojanje može detektirati u jezgri, na membranu i u citoplazmi želuca stanica raka. Biološka važnost različitih uzoraka P-Smad3C bojanja stanica karcinoma je trenutno još uvijek nepoznat. Pregled

EMT stanica raka je preduvjet za napredovanje do naprednih metastatskih tumora [11]. To je prepoznato da je TGF-β je glavni igrač u EMT. Smad3, ali ne Smad2, je ključni posrednik u TGF-ß zavisnom EMT [39]. Na primjer, TGF-β ne inducira EMT u osnovnim cjevaste epitelnih stanica iz bubrega Smad3-deficijentnih miševa [40]. Inhibicija TGF-beta signalizacija po Ki26894, inhibitora TGF-βRI, smanjena invaziju i EMT od scirrhous raka želuca In vitro pregled [41]. Naši rezultati pokazuju da je dio želučane stanice raka izraziti EMT markere, na primjer Puž, kolagen I i α-SMA. Co-lokalizacija P-Smad3C s a-SMA /kolagena I nalazi se u znatnom dijelu pacijenata. Osim toga, α-SMA pozitivno bojanje u stanicama raka ima potencijalnu povezanost s P-Smad3C IHC rezultat tumorskih stanica, ali ne i okolnog tkiva, bez raka. Ovi rezultati pokazuju da je P-Smad3C može igrati ulogu u EMT raka želuca. Pregled

Ukratko, ova studija sugerira da Smad2 je važan medijator za obranu želučanih stanica iz napreduje prema slabo diferenciranog raka. Prema našim rezultatima, Smad3 nije izravno povezan s karakteristikama karcinoma želuca, međutim, naši podaci pokazuju da to može igrati ulogu u raka povezane fibroblasta i EMT želučanih stanica raka. Pregled

Metode pregled

Pacijenti

Operacijski uzorci su pregledane od bolesnika s primarnim karcinomom želuca na Katedri za opću kirurgiju, prvi Povezana bolnica, Medicinski fakultet, Zhejiang University, Kina od 2003. do 2009. godine u želucu uzorak tkiva se prikupljaju prilikom operacije secirao želučanog karcinoma. Prikupljeni tkiva uključen tumor i okolno ne-tumorske područja (tkiva barem više od 5 cm daleko od tumora). Dio tkiva su fiksirane s 4% formaldehidom u i stavljeni u parafin za histologiju i mjerenje IHC. Ostala svježa tkiva su stavili u tekućem dušiku odmah za mjerenje mRNA. Ukupno 130 uparenih želučanog tkiva, uključujući rak i okolnih ne-tumorskih tkiva upisani su. Patološka dijagnoza i klasifikacije su izračunate u skladu s tumorom čvor-metastaza (TNM) klasifikaciji zagovara Međunarodne unije protiv raka (sedmo izdanje) [42]. Osnovne karakteristike upisanih pacijenata prikazani su u tablici 4. Protokol istraživanja suobličeni etičkim smjernicama Deklaracije u Helsinkiju (1975). Istraživanje je odobrilo Etičko povjerenstvo povezanih bolnice prvi, Medicinski fakultet Sveučilišta Zhejiang. Pismeni informirani pristanak dobiveni su od svih sudionika u ispitivanju. Pregled

Antitijela

Zec antitijela za protiv P-Smad2C (ser 465/467), P-Smad3C (ser 423/425), P-Smad2L (ser 250/255) i P-Smad3L (ser 208/213) opisani su u prethodnim studijama [43], [44]. Mišji anti-humani α-SMA (M0851), poliklonalni anti-puž (ab-17.732) i monoklonsko anti-kolagena I (C2456) antitijela su kupljena od DAKO, Abcam i Sigma respektivno.

imunohistokemija (IHC ) pregled

Nakon pregleda H &E-slajdova s ​​130 upisanih pacijenata s rakom želuca, reprezentativni parafinski blokovi za svakog pacijenta su odabrani za sekciji. Stakalca su deparaffinised u ksilenu i rehidriraju u nizu razrjeđenja stupnjevito etanola destilirane vode. Antigen dohvat je provedena djelovanjem mikrovalovima u EDTA puferu (1 mmol, pH 8,0). Stakalca su potom obrađuje s 3% H _{<2O sub> 2 kroz 30 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja s PBS-om tri puta, slajdovi su inkubirani sa zečjim poliklonskim antitijelima P-Smad2C (1:100), P-Smad3C (1:100), P-Smad2L (1:50), P-Smad3L (1:50 ) i α-SMA (1:200) odnosno na 4 ° C preko noći. Sljedećeg dana, slajdovi su isprane s PBS-om tri puta. Nakon ispiranja, da se inkubiraju s peroksidazom EnVision (Dako) -označeni anti-kunić ili anti-miš antitijela tijekom 1 sata na sobnoj temperaturi. Aktivnosti peroksidaze je detektirano diaminobenzidin (DAB). Stakalca su prebrojane s hematoksilinom. Imunoreaktivnost vizualizira se pod svjetlosnim mikroskopom pregled}

Za polukvantitativnim analize, obojeni dijelovi tkiva su procjenjuju se na 4-ljestvici od kako slijedi: pozitivan broj stanica, razredima 0-3 (0, nema pozitivne stanice, 1, <. 25% pozitivne stanice, 2, 25% -50% pozitivne stanice, 3, > 50% pozitivne stanice); intenzitet pozitivnog bojenja razreda 1-3 (1, slabo pozitivno bojenje, obično žute, 2, snažan pozitivan bojanja, obično smeđa, 3, vrlo jak pozitivan bojanja, obično duboko smeđe do crne). Konačni imuni bojenje rezultat je izračunat kao broj × intenziteta. Pregled

Imunofluorescencija bojenje pregled

Snimci su deparaffinised u ksilena i rehidrira u ocjenjuju etanola do destilirane vode. Zatim antigen dohvat je provedena djelovanjem mikrovalovima u EDTA puferu (1 mmol, pH 8,0). Stakalca su potom obrađuje s 3% H _{<2O sub> 2 kroz 30 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja s PBS-om, kako primarnih protutijela, mišjim anti-P-Smad3C /puža i mišjim anti-alfa-SMA /kolagena I, primijenjene su na 4 ° C preko noći. Zatim, sekundarna antitijela, Alexa633-zečjeg protiv mišjeg imunoglobulina G, a Alexa488-magareći anti-zečji imunoglobulin G (Molecular Probes /Invitrogen, Karlsruhe, Germany), primjenjuje se tijekom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Uzorci su montirani pomoću Dako-Cytomation fluorescentna zaštitnim medijem. Rezovi su pregledani i slike su snimljene na konfokalnoj mikroskopom (Leica, Heidelberg). Sekcije bez primarnih antitijela su korišteni kao negativna kontrola. Pregled}

PCR u realnom vremenu pregled

Ukupna RNA je pročišćen iz želučanog tkiva s Visokim Pure izolaciju RNA kit (Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Njemačka) prema protokolu proizvođača, a koncentracija je mjerena spektrofotometrijski. cDNA bila je sintetizirana iz 1 ug RNA s Transcriptor Prvi lanac cDNA Synthesis Kit (Roche Diagnostics). Kvantitativno u realnom vremenu PCR je izvedena pomoću sustava ABIPrism 7700 za detekciju sekvenci (Applied Biosystems) koristeći Taqman univerzalni PCR 'glavne smjese br AmpErase UNG (dio br. 4.324.018). koristi se sljedeći izraz testovi gena su: Smad2 (naprijed: CAAACCAGGTCTCTTGATGG reverzna: GAGGCGGAAGTTCTGTTAGG), Smad3 (naprijed: GGAGAAATGGTGCGAGAAGG reverzna: GAAGGCGAACTCACACAGC) i peptidylprolyl izomeraze A (u ponudi gen, dio br Mm02342429_g1.).. Svi reagensi nabavljeni su od Applied Biosystems. Svi uzorci su analizirani u triplikatu u sljedećim uvjetima: denaturiranje početni 2 minute na 50 ° C i 10 minuta pri 95 ° C, nakon čega slijedi 40 ciklusa po 15 s pri 95 ° C i 1 min pri 60 ° C. Razina ekspresije gena u svakom uzorku određene su s komparativne metode praga ciklusa. Pregled

Statistička analiza pregled

Da bi se procijenila povezanost između odabranih imunohistološkim markere i tumorskih parametara, Kendall-tau rang korelacija Analiza je provedena korištenjem SAS verzija 9.2 (Cary, NC, USA). p pregled. ≪ 0,05 smatrana je statistički značajna pregled

• PLoS ONE: klinički potencijal DNA metilacije u rak želuca: A Meta-Analysis
• PLoS ONE: Prostorni raspored LGR5 + stanica u korelaciji s rakom želuca Progression