Plos ONE: Honokiol povzroča kalpainskega-posredovana glukoza-Predpisane Protein-94 Cepitev in Apoptoza v človeške celice želodca raka in zmanjšuje tumorje Growth

Povzetek

ozadja

Honokiol, majhno molekulsko maso naravno proizvod se je izkazalo, da imajo močne antineoplastične in anti-angiogenskih lastnosti. Njegove molekularne mehanizme in sposobnost raka proti želodčni ostajajo neznani. Dokazano je, da je anti-apoptotični funkcija glukoze regulirano proteinov (GRP), predvideva, da se lahko njihova indukcija v neoplastičnih celicah privede do napredovanja raka in odpornosti na zdravila. Raziskovali smo vplive honokiol o urejanju GRP in apoptoze v človeške želodčne rakavih celic in rast tumorja.

Metodologija in glavnih ugotovitev

Zdravljenje različnih človeških želodčnih rakavih celic z honokiol privedla do indukcija GRP94 cepitvi, vendar ni vplivala GRP78. Utišanje GRP94 jih male interferenčne RNA (siRNA) lahko povzroči celično apoptozo. Zdravljenje celic z honokiol ali kemoterapevtiki sredstvo etopozidom okrepljeno povečanje apoptoze in GRP94 degradacije. Aktivnost kalpainskega in kalpainskega II (m-kalpainskega) protein (vendar ne (μ-kalpainskega) kalpainskega-I) Stopnja se lahko poveča tudi honokiol. -Honokiol povzroča GRP94 down-regulacijo in apoptozo v želodčnih rakave celice se lahko odpravijo s siRNA ciljanje kalpainskega-II in zaviralci kalpainskega. Nadalje, rezultati imunofluorescenco in imuno pokazala specifično interakcijo GRP94 s kalpainskega-II v celicah naslednje honokiol zdravljenja. Naslednjič ugotovila, da tumor GRP94 prekomerno ekspresijo in rasti tumorja pri BALB /c golih miših, ki so bile, cepljenih z človeškega raka želodca celic MKN45 se izrazito zmanjšala za honokiol zdravljenja.

Sklepi in pomen

Ti rezultati so prvi dokaz, da-honokiol povzroča kalpainskega-II-posredovano GRP94 cepitev povzroča človeško želodčni rak apoptozo celic. nadalje Predlagamo, da honokiol lahko mogoče terapevtsko sredstvo za izboljšanje rezultatov kliničnih raziskav raka želodca

Navedba. Sheu ML, Liu SH, Lan KH (2007) Honokiol inducira-kalpainskega posredovana glukoza-Predpisane Protein-94 Cepitev in Apoptoza v Human želodca rakavih celic in zmanjša rast tumorja. PLoS ONE 2 (10): e1096. doi: 10,1371 /journal.pone.0001096

Akademska Urednik: Hany El-Shemy, Cairo University, Egipt

Prejeto: 26. junij 2007; Sprejeto: 10. oktober 2007; Objavljeno: 31. oktober 2007

Copyright: © 2007 Sheu et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. To delo je podprlo raziskovalne štipendije iz National Science sveta Tajvana (NSC95-2320-B040-005). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca je drugi najpogostejši vzrok smrti zaradi raka v svetu [1]. Skoraj se pojavita dve tretjini primerov v državah v razvoju in 42% samo na Kitajskem [1], [2]. Molekulske cilji in mehanizmi, povezane s slabo prognozo niso dobro razumeli. Zdravljenje lokalno napredovalega raka želodca še vedno velik izziv. Kljub nedavni napredek v zdravljenju, klinični izid pri bolnikih z rakom želodca še vedno slaba. Poleg operaciji vlogo adjuvantno terapije ni dokazana [2] [3]. Zato jih je treba identificirati potencialne nove terapevtske in kemopreventivno agentov je očitna.

Honokiol, aktivna sestavina izolirana in očistimo s Magnolia officinalis
, je bilo dokazano, da imajo učinek anti-oksidacijo [4], pred peroksidacijo lipidov [5] in protivnetno in vitro
in in vivo
[6], [7]. Honokiol je bilo tudi dokazano, da je sistemsko voljo in nestrupeno zaviralec angiogenezo [8]. Nedavne študije so poročali, da honokiol inducira kaspazo odvisna od apoptozo v kronično limfocitno levkemijo celic B-celic in premaguje konvencionalno odpornosti na zdravila v humani diseminiranim plazmocitomom induciranje kaspaze-odvisnih -independent apoptoze [9], [10]. Čeprav popolna ocena kliničnega potenciala spojin še ni mogoče, farmakokinetika honokiol je temeljito preiskati, ki razkrivajo, da je honokiol je na voljo na kliničnem zdravljenju raka. Več naravni proizvodi, ki vsebujejo različne terapevtske spojin uporabne pri preprečevanju razvoja malignih bolezni še naprej, da bodo odkrili; Vendar pa je zelo malo znanega o svojih osnovnih mehanizmov delovanja ali njihovo molekularno tarčo.

Glukoza regulirano protein (GRP) 94 je najbolj bogat glikoprotein v endoplazemski retikulum (ER) in lahko prepozna le v vretenčarja. Prekomerno ekspresijo antisense in ribozim pristopov pri sistemih tkiva kulture direktno pokazala, da bi GRP78 in GRP94 ščitijo celice pred smrtjo [11] - [13]. Zaščitna funkcija GRP je bilo opaziti tudi v odporu do sevanja raka materničnega vratu [14]. Anti-apoptotični funkcija GRP tudi predvideva, da se lahko njihova indukcija v neoplastičnih celicah privede do napredovanja raka in odpornosti drog [15] - [18]. Patoloških stanj, kot so rast tumorjev in malignosti so predlagali, da korelira z citoprotektivno beljakovin GRP94 prekomernega izražanja [19]. V metastatskega modelu raka, je pokazala velik učinkovitost genske strategije /imunoterapije, ki temelji na GRP94, ko je bila v kombinaciji z radioterapijo [20]. ER ima neposredno vlogo pri aktiviranju podskupino kaspaze med aktivacijo apoptoze, ki se pojavi v ER stresa [21]. Po drugi strani, calpains so družina Ca ^{2 + -dependent znotrajcelične cisteinskih proteaz. Ubiquitously izraženo kalpainskega-I (μ-kalpainskega) in kalpainskega-II (m-kalpainskega) proteaze so vključene v razvoju apoptoze. Nedavna študija je pokazala, da povsod calpains spodbujanje kaspaze-12 in aktivacijo JNK med ER-stres povzroča apoptozo [22]. Prav tako je bilo navedeno, da je 2 + -binding in antiapoptozne lastnosti je GRP94 s Ca proteolitični cilj kalpaina med-etopozidom inducirane apoptoze [23]. Poleg tega je v številnih eksperimentalnih modelov apoptoze, se je izkazalo, da je amino-terminalu kalpainskega inhibitorna enota calpastatin razcepi kaspaz, kar kaže na cepitev je bistvenega pomena za uravnavanje kalpainskega aktivnosti v celično smrt [24] - [28] . Kaspaza-7, ki je zaposleno na ER v izjemnih celicah, lahko prav odcepi in aktivirati kaspaza-12 [29] - [31]. Učinki honokiol na povezano-GRP signalizacijo in apoptozo še vedno ni znan. V tej študiji smo raziskovali molekularne mehanizme honokiol na človeške želodčne rakave celice apoptoza in rast tumorja in vitro
in in vivo
. Nepričakovano smo ugotovili, da GRP94 opravi posebno proteolitično cepitev s kalpaina med-honokiol inducirane apoptoze. Te ugotovitve lahko da dokaze, da je honokiol možna terapevtsko sredstvo za izboljšanje rezultatov kliničnih raziskav raka želodca.}

Rezultati

Kinetika GRP94 proteolitično cepitev v človeške želodčne linij rakavih celic, zdravljenih z honokiol

smo najprej preučil učinke honokiol o izrazov GRP94 in GRP78 v različnih človeških želodčnega raka celičnih linijah. Honokiol znatno zmanjša raven GRP94 od odmerka in časovno odvisen način, ampak nivoji GRP78 niso prizadete (sl. 1 in 2). Kinetika-honokiol inducirano GRP94 ali cepitev v različnih človeških želodčnih rakavih celic bile prikazane na sl. 2. MKN45 ali SCM-1 celice so bolj odporne na odzive, honokiol povzroča največ AGS ali N87 celic; raven GRP94 so se zmanjšali za približno 50%, za dvakrat toliko časa. Ravni GRP78 proteini ostanejo v vseh štirih želodčnih raka celičnih linij nespremenjena. Poleg tega obstaja malo GRP94 beljakovin izrazi v normalnem miška želodca epitelijskega tkiva in človeške endotelijske celice v primerjavi s želodčnih rakavih celic (sl. 1C).

Honokiol inducira GRP94-cepitve povezana odziv apoptotske

kot je prikazano na sliki. 3, honokiol povečala poli (ADP-riboza) polimerazo (PARP) cepitev in poškodbe DNA inducibilni gen CHOP /GADD153 (beljakovine je bilo ugotovljeno, da posreduje ER-stres povzroča apoptozo) ravni v MKN45 celic v od odmerka in časovno odvisne način. Honokiol 20 in 40 M sproži tudi izraze cepijo kaspaze-12 in kaspaze-7 (P20), ki je bil obseg povečanja sorazmerna s časom (sl. 3B). Poleg tega je razumeti, ali je GRP94 cepitev vpleten v človeške želodčne rakavih celic apoptoze je apoptoza odkrit v GRP94-siRNA-transfektiranih celic. Utišanje GRP94 ga siRNA inducirane celične apoptoze (sl. 4A) in zmanjšalo GRP94 protein izražanje (sl. 4B-a). Primerjali smo tudi učinke honokiol na apoptozo in degradacije GRP94 v človeške želodčne rakavih celic s kemoterapevtiki agenta etopozidom. Rezultati so pokazali, da je obdelava celic s honokiol ali etopozid izboljšano povečanje apoptoze (sl. 4A) in degradacijo GRP94 (sl. 4B-b). Ko so celice sočasno zdravljeni s 40 M etopozid in 20 M honokiol, kot jim ni bil prikazan v večjem povečanju degradacije GRP94 (slika 4B-b.); Ti rezultati kažejo, da lahko združevanje honokiol z drugimi zdravili proti raku drog potencialna terapevtska strategija.

kalpainskega je potrebno za-honokiol posredovano celično apoptozo

Naslednja ugotoviti, ali je dejavnost kalpaina (kalcijev -dependent tiolnih proteaze), ki bi jih povzroča honokiol v štirih želodčnih raka celičnih linij. Kot je prikazano na sliki. 5A, honokiol 20 M povečala kalpainskega aktivnost v odvisnosti od časa način, ki je začel poveča na 15 min, in dosegla 60 minut in nato padel na nižjo raven 4 ure. Celice ostala oprijeto v časovnem poteku, brez izgube preživetja (podatki niso prikazani). Sl. 5B, so rezultati pokazali, da povečanje kalpainskega aktivnosti kot odziv na honokiol (20 in 40 m) za 60 minut v štirih želodčnega raka celičnih linij. Poleg tega kalpainskega inhibitorji, N-acetil-Leu-Leu-norleucinal (ALLN), N-acetil-Leu-Leu-methioninal (ALLM) in Z-Leu-Leu-CHO, učinkovito inhibira povečanje kalpainskega dejavnosti, ki jih honokiol inducirano v N87 in celicah SCM-1 (sl. 5C).

smo dodatno testirali, ali zmanjšal kalpainskega dejavnost lahko ogrozi sposobnost honokiol na indukcijo apoptoze. Kot je prikazano na sliki. 6A, honokiol (40 M) povzroča apoptoza celic v SCM-1 celice, ki se lahko obrne zaviralcev kalpaina (ALLN ali ALLM). Poleg tega honokiol izboljšane kalpainskega-II beljakovin, vendar ne kalpainskega-I beljakovin izrazi v celicah SCM-1 (sl. 7a). Uporaba pristopa siRNA na rasklapanje dejavnost kalpainskega-II povzročila znatno zmanjševanje honokiol (20 M) inducirane apoptoze v človeške želodčne rakavih celic po 4 h zdravljenju (sl. 6B). SiRNA kalpainskega-I ni vplival-honokiol inducirano apoptozo (sl. 6b).

Lokalizacija in interakcija kalpainskega-II in GRP94 po honokiol zdravljenju

Naslednji korak je bil osvetliti vlogo od kalpainskega-II in-honokiol povzroča degradacije GRP94. V lasersko konfokalno mikroskopski študiji so lokalizacija kalpainskega-II proteina določi zeleno fluorescenco, medtem ko je bila lokalizacija GRP94 določi rdeče fluorescence. Kot je prikazano na sliki. 7B, tako kalpainskega-II in GRP94 bili odkriti v citoplazmi z co-lokalizacije človeške želodčne rakavih celic. Fluorescenca kalpainskega-II se je postopoma povečala, vendar fluorescence GRP94 je postopno zmanjšal v človeške želodčne rakavih celic pri zdravljenju honokiol. Da bi še dodatno potrjujejo rezultate imunocitokemijski obarvanje, ki kalpainskega-II komunicira z GRP94, so bili izvedeni preskusi co-imuno in metodo Western blot v želodcu rakavih celic. Kot je prikazano na sliki. 7C, kalpainskega II je posebej povezana z GRP94 v različnih želodčnih rakavih celic v prisotnosti honokiol (20, 40 M), v primerjavi s kontrolo IgG. Poleg tega smo testirali, ali so bile proteolitične aktivnosti kaspaze, proteasom ali katepsinom vključeni v cepljenjem GRP94. Naši rezultati so pokazali, da je zdravljenje celic z zaviralci kaspaznih (Ac-DEVD-CHO, Z-VAD-FMK in Z-DEVD-FMK, 50 M), pri visokih odmerkih delno blokirana cepljenje GRP94 med-honokiol inducirano apoptozo (sl. 8A ) v primerjavi s kalpainskega zaviralcem ALLM 25 M, ki bi lahko popolnoma blokirajo GRP94 dekolte. Predhodna obdelava celic s katepsina inhibitor B CA-074-Me 25 in 50 M in katepsina L inhibitor katepsina L zaviralec II 25 in 50 M in proteasoma zaviralec MG132 0,1-10 M ni mogla blokirati GRP94 dekolte (sl. 8B in 8C) . Poleg tega lahko opazimo posebno cepitev GRP94 s kalpaina uporabo celični lizati, pripravljenih iz človeške želodčne rakavih celic (podatki niso prikazani).

Naslednja raziskano, ali je potrebna aktivacija kalpainskega za-honokiol povzroča celične apoptoze. Sl. 9, se je o zvišanju beljakovin izražanja kalpainskega-II in degradacije GRP94 in kaspaze-7 in kaspaze-12 aktivacijo s honokiol (40 M) inducirane preprečiti s farmakološkimi inhibitorji kalpaina in prehodno transfekciji siRNA-kalpainskega-II v celicah SCM-1.

honokiol zaduši tumor GRP94 prekomerno ekspresijo in rast tumorjev pri golih miškah

golih miših so bile cepljene s 4 x 10 ^{6 nediferencirani adenokarcinomom celic MKN45 in obdelamo s honokiol 0,5 in 1,5 mg /kg ali vozilo, ko tumor postalo jasno. Imunohistološka in Western blot analiza je pokazala, da GRP94 ali prekomerno ekspresijo in nabrali na tumorja območju, ne pa v normalni želodca tkiva (sl. 10A-a in 10A-b). Honokiol opazno zmanjšala kopičenje GRP94 v tumorjih v primerjavi s kontrolno vozilo (sl. 10A-a in 10A-b). Izraz GRP78 ni bila prizadeta (podatki niso prikazani). Da bi ugotovili, ali bi honokiol zavirajo rast tumorjev in vivo
, solidni tumorji so bile določene pri miših in anti-tumor učinek večkrat vbrizga honokiol smo preučevali. Kot je prikazano na sliki. 10B, dajanje honokiol 0,5 in 1,5 mg /kg je pokazala pomembno protitumorsko aktivnost.}

Pogovor

smo poročali tukaj prvič, da kalpainskega A nonlysosomal Ca ^{2 + -aktiviran cistein proteaze, zlasti kalpaina II, igra ključno vlogo pri cepitvijo GRP94, vendar GRP78 ne vpliva, in pri regulaciji apoptoze s honokiol inducira v človeške želodčne rakavih celic. Zlasti smo zagotovili funkcionalne dokazov, da cepitev GRP94 ob honokiol akti zdravljenja kot terapevtsko korist, zaviranju rasti tumorjev pri mišjem modelu karcinoma človeške želodčne. Kolikor nam je znano, je to prvo poročilo kažejo, da honokiol lahko manipulira kalpainskega inducirajo chaperone beljakovin GRP94 degradacije počutje cilj med apoptozo.}

Študije iz različnih laboratorijev opozoril na urgenco kot ciljno predelu, ki ga terapevtskih sredstev vpleten v izvedbi apoptoze. Citosolno Ca ^{2+ je bil vpleten kot drugi glasnik proapoptosis sodeluje tako proženja apoptozo in urejajo kaspazah ali calpains [32] - [34]. Nedavna študija je pokazala, da je kalpainskega pomemben mediator resveratrola (naravni rastlinski polifenolov) inducirano apoptozo pri raku dojke [35]. Ugotovili so, da lahko resveratrol povzroči povečanje znotrajcelične Ca 2+, in aktivira-kalpainskega posredovano apoptozo, ki vodi do degradacije plasma membrane Ca 2 + ATPazni izoencima 1 in fodrin v kaspaze-3 pomanjkljivo MCF- 7 celice. Honokiol so poročali tudi za indukcijo Ca 2+ mobilizacija v podganjih kortikalnih nevronov in človeškega nevroblastoma SH-SY5Y celic, verjetno prek aktivacije fosfolipaze C in OP _{3 receptorji [36]. V tej študiji smo ugotovili, da je honokiol lahko poveča kalpainskega delovanja in izražanja proteinov kalpainskega-II, vendar ne kalpainskega-I v-honokiol inducirane želodčni rak celične apoptoze. Poleg tega so inhibitorji kalpaina in utišanje kalpainskega-II z siRNA bistveno obrnil apoptozo-honokiol povzroča. Te ugotovitve kažejo, da lahko Ca 2 + -triggered aktiviranje kalpainskega-II imajo potencialno vlogo pri-honokiol inducirane apoptoze.}}

GRP94 /gp96 je član prebiva ER družine HSP90. GRP94 igra pomembno vlogo pri ohranjanju celične homeostaze. Ta konvencionalna koncept GRP94 kot protein zložljivo varuha je spremenil odkritij, ki GRP spodbujanje tumorskih, metastaze, odpornosti na zdravila, in imunoterapije, ki imajo pomembne klinične posledice za prognozo in zdravljenje raka [3]. GRP94 je bilo dokazano, da je povezana s tumorjev pri raku celičnih linijah, glodalce tumorskih modelih in človekovih biopsije raka [37] - [39]. To je v skladu z ugotovitvami, da je indukcija GRP povzroči zaščitno funkcijo odgovorov preživetja na stradanje hranil, acidozo in pogojih hipoksije, ki so pogoste v slabo prekrvavljena solidnih tumorjev [11], [40]. Je bilo prav tako pojavil, da je večina GRP v tumorskih celicah ukvarja več Chaperone kompleksov, pri čemer pa ni v normalnih celicah [41]. Cepljenje miši z tumor izvira stresnih proteinov, GRP94 lahko izzove anti-tumorskih imunskih odzivov, pri čemer dobimo izrazito zatiranje rasti tumorja in metastaz. Aktivnost zaviralcev hsp90 je dobro potrjen v predkliničnih modelih raka dojke, tako v študijah enim sredstvom in v kombinaciji s konvencionalno kemoterapijo [41]. Poleg tega je bilo predlagano, da je GRP94 ali fiziološka substrat kalpaina [23]. Kalpainskega je bilo dokazano, da se aktivira na ER membrano, kjer sodeluje s GRP94, zaradi svojega posebnega proteolitično cepitev kot celice podvržene apoptoze s etopozid [23] sprožila. V sedanji raziskavi smo ugotovili, da se-honokiol povzroča GRP94 dekolteja in apoptozo v človeške želodčne rakave celice lahko popolnoma odpravijo s kalpainskega inhibitorje in utišanje kalpainskega-II s siRNA. Zaviralci kaspaze pri visokih odmerkih delno obrnilo-honokiol povzroča GRP94 dekolte. Predhodna obdelava celic s katepsina B in zaviralci L in zaviralec proteasoma mogla blokirati-honokiol povzroča GRP94 dekolte. Prav tako pokazali, da lahko dušenje zvoka iz GRP94 z siRNA inducira želodčni rak celic apoptoze. Poleg tega so rezultati imunocitokemijski barvanjem in imuno pokazala posebno interakcijo GRP94 s kalpainskega-II v želodcu rakavih celicah naslednje honokiol zdravljenja. Specifično cepitev GRP94 z kalpaina je mogoče opaziti tudi z uporabo celičnih lizatov, pripravljenih iz človeške želodčne rakavih celic. Te ugotovitve torej kažejo, da ima kalpainskega II posredovana GRP94 cepitev pomembno vlogo pri-honokiol sprožilo želodčni rak celične apoptoze.

Calpains in kaspaze sta družine cisteinskih proteaz, ki so vpletene v regulacijo patološko celico smrt [22], [31]. Te proteaze deliti več, povezanih s smrtjo substratov vključno kaspaz sami, citoskeletnim beljakovine, Bax in ponudbe [42]. -Kalpainskega posredovana proteolize iztržek v omejenem obsegu, vendar ne zahteva posebnega aminokislinski ostanek takega kaspaz. Čeprav so bili predlagani tudi kalpainskega in kaspaze, da igrajo pomembno vlogo pri urejanju patološko celično smrt, interakcije teh dveh družin proteaz pod patoloških stanj, niso jasne. V tej študiji so rasklapanje in farmakološke zaviralci pristopi bistveno prispevala k naši vednosti kalpainskega biologije, zlasti v zvezi z njeno specifično funkcijo na celično apoptozo, kar je mogoče, da so kaspaze 7 in 12 dolvodno od kalpaina pri posredovanju raka želodca, honokiol povzroča apoptoza celic.

droge Natural izdelkov so predlagali, da igrajo dominantno vlogo v farmacevtske skrbi [43]. Naravni izdelki so eden od pomembnih virov potencialnega kemoterapevtskega raka in kemopreventivno sredstvi [43]. Honokiol je pogosto uporabljena v tradicionalni kitajski in japonski medicini za nekaj tisoč let, v glavnem za zdravljenje anti-trombocitična, antibakterijsko, protivnetno in anksiolitike učinkov. Prejšnja poročila so pokazala, da je honokiol ima tudi močne anti-neoplastične in anti-angiogenskih lastnosti [6], [19] [38]. Vendar pa je natančen molekularni mehanizem razstavljenih aktivnost proti tumorjem s honokiol ni dobro razume. Tako so rezultati te raziskave zagotavljajo dokaze za aktivnosti anti-tumorja honokiol raka želodca, in še pomembneje, molekularne osnove za njegov učinek. Ugotovili smo, da honokiol sproži aktivacijo kalpaina, GRP94 cepitve in apoptoze v humanih želodčnih rakavih celic. Poleg tega je po dajanju honokiol v golih Nici vsajen z MKN45 želodčnih tumorskih celicah pokazali veliko protitumorsko aktivnost. To predkliničnih študija lahko služi kot okvir in predstavlja obetaven nov ciljno usmerjen pristop. Poleg tega se je izkazalo, naravne spojine kombinirati s konvencionalnimi citotoksičnih zdravil lahko klinično koristna z zdravili proti raku. Ta prednost plus čedalje očitneje svojih anti-tumorskih mehanizmov da honokiol stalno klinično uporabo za to, da učinkovito in varno protitumorsko sredstvo.

Materiali in metode

Celice, Kultura Pogoji in reagenti

linije človeških celic, vključno s kavkaških želodčnega raka celičnih linijah (AGS, zmerno, slabo diferenciran celične linije adenokarcinomom, in N87, dobro diferencirane celične linije karcinom) in azijskih želodčnega raka celičnih linijah (MKN45 in SCM-1 je nediferencirani adenokarcinomom celice), so bili pridobljeni iz celične banke v središču rakastih Taipei veteranov splošna bolnišnica (Tajvan). Celice so bile vzdrževane v RPMI 1640 mediju, ki vsebuje 10% toplotno deaktiviranega FCS (Life Technologies) in streptomicin /penicilina (Life Technologies) v navlaženi 5% CO _{2 atmosferi. Honokiol smo dobili od Wako Chemical Company (Japonska), in njena čistost je odločen, da bo najmanj 99% do high-tekočinsko kromatografijo.}

Western Blot analizo in Immunoprecipitations

Cela celični lizati smo pripravili kot smo že prej [44] opisano. Proteine ​​smo ločili s pre-cast 8-20% SDS-poliakrilamidnem gelu, nato pa elektroforetsko prenese iz gela na poliviniliden ditluoridne membrane. Po blokiranje so blots inkubiramo z anti-GRP94, anti-GRP78, anti-kaspazne 12, anti-kaspazne 7, anti-PARP, anti-GADD153 (Santa Cruz Biotechnology), anti-kalpainskega-I (μ-kalpainskega) anti-kalpainskega II (m-kalpainskega) (santa Cruz Biotechnology), in anti-β aktina (Sigma) protitelesa v PBS v 0,1% Tween 20 za 1 uro, čemur sledi tri 10 min izpiranjih v PBS v 0,1% Tween 20. membrane smo nato inkubirali s hrenovo peroksidazo konjugirano sekundarnih protiteles za 60 minut. V imuno so proteini (500 g), inkubiran s specifičnimi protitelesi in imobiliziran na proteinske kroglice A-sefaroza. Kroglice so bile v veliki meri sprali z immunoprecipitative pufrom BACCO je, kuhano in microcentrifuged. Vhod 10% od celičnega lizata za IP in 50 g proteinov smo analizirali z Western blotting-om. Zaznavanje je bila izvedena z Western blot reagenta ECL (Amersham) in kemiluminescenca bila izpostavljena s strani Kodak X-Omat filmov.

kalpainskega dejavnosti Testi

Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC je substrat kalpainske proteaze. Kvantificiranje 7-amino-4-metilkumarin (AMC) fluorescence omogoča spremljanje encimske hidrolize peptid-AMC konjugatu in se lahko uporablja za merjenje encimske aktivnosti. Celice smo pripravili in obdelali v 24-ih ter Corning /Costar plošč. Pred dodatkom inhibitorjev celic smo naložen z 40 M pro-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC (Biomol) in obdelamo z honokiol za navedeno časovnega pri 37 ° C v navlaženi 5% CO _{2 inkubatorja. Proteolize v fluorescentno sondo smo spremljali s pomočjo fluorescenčne bralni sistem ploščo (HTS-7000 Plus Series biološkega Perkin Elmer) z nastavitvami filtrom 360 ± 20 nm za vzbujanje in 460 ± 20 nm za emisije.}

SiRNA in transfekciji Testi

siRNA dupleksov specifična za inhibicijo kalpainskega-I (μ-kalpainskega) in kalpaina-II (m kalpainskega) izrazi v človeških celicah so bili pridobljeni iz Santa Cruz Biotechnology: kalpainskega-I, kataloška št . sc-29885, bazen 3 ciljne specifične 20-25 nt siRNAs; kalpainskega II, kataloška št. sc-41459, cilj specifičnih 20-25 nt siRNA. Je siRNA kontrole (kataloška št. Sc-37.007) je brez ciljanja 20-25 nt siRNA zasnovan kot negativno kontrolo. Poleg tega je siRNA dupleksov specifična za bila inhibicija GRP94 izražanja sintetiziramo komercialno ga MWG Biotech (Nemčija). Občutek (zgoraj) in protismiselno (spodaj) sekvence GRP94 ali siRNA duplex so bili naslednji: 5'-GAAGAAGCAUCUGAUUACCTT-3 '; 3'-TTCUUCUUCGUAGACUAAUGG-5 '. Kot nespecifične nadzora, NC siRNA duplex z naključnimi sekvencami je bil zasnovan kot sledi: 5'-AGUUCAACGAGUAUCAGCATT-3 '; 3'-TTUCAAGUUGCUCAUAGUCGU-5 '. Je siRNAs so bili uporabljeni pri koncentraciji od 100-200 nm za prehodno transfekcije celic z lipofektinskih (Invitrogen) na jamico v 6 vdolbinicami s svežim medijem. Po 24 urah od začetne transfekciji in 24-36 zdravljenje h, so bile celice ali celični lizati zbirajo in analizirajo za apoptozo ali izražanje proteinov oz.

Imunofluorescenčni in laserske konfokalna mikroskopija

Celice smo dvakrat sprali s PBS, določen v 4% paraformaldehida v 30 min in nato blokirali z inkubacijo pri 1% goveji serumski albumin v PBS. Primarna protitelesa, kot je bilo navedeno, ki se uporabljajo za diapozitive pri razredčitvi 1:500 in inkubiranih pri 4 ° C čez noč. Vzorci so bili zdravljeni z FITC-konjugiranih ali TRITC-konjugiranih sekundarnih protiteles (Sigma). Je FITC označeni ali TRITC-označeni Celice smo nato analizirali z fluorescenčno mikroskopijo. Za lasersko skeniranje mikroskopijo, so-imunofluorescenčnega označene celice analizirali z obrnjeno lasersko skeniranje mikroskop (Zeiss LSM 410 invertnega, Nemčija), ki je opremljen tako z argonom ionom (488 nm) in Hene (543 nm) laserja. Co-lokalizacija dve označeni antigenov bila zaznana kot eno sliko, ko so bile obdelane slike iz obeh kanalih. Konfokalni slike so bile-ozadje odšteti in združena z konfokalna Assistant programsko opremo, in obdelani s programsko opremo Adobe Photoshop.

aneksin-V FITC in PI Double obarvanje

aneksin V /propidijevim jodidom The (BD Clontech) je bila uporabljena za kvantifikacijo števila apoptotskih celic, kot je prej [44] opisano. Celice smo dvakrat izprali s PBS in obarvamo z aneksinom V in PI 20 minut pri sobni temperaturi. Stopnja apoptoze določimo z merjenjem fluorescence celic, ki jih citometru pretoka (Becton Dickinson). pridobivanje podatkov in analizo smo izvedli s programom Cellquest (Becton Dickinson).

Živali

Živalski eksperimenti so bili izvedeni v skladu s smernicami, ki jih je odbor za preskuse na živalih, National Chung Hsing univerzi izdanih, Taichung, Tajvan. Moški BALB /c golih miši ( nu /nu
) so bile kupljene od NLAC Tajvana, Inc., Taipei, Tajvan. Miši so redili in vzdrževati v skladu s posebnimi pogoji, brez patogenov, če s sterilizirano hrano in vodo ad libitum in nameščene v ovir objektu s 12 h svetloba /tema ciklov. Eksperimentalni postopki so bile izvedene na 6 tednov starih miših. Živali so se žrtvovati, ko so se pojavili umirajočih.

Tumor Growth Vsebnost

Cell tumorogenosti bila preučena v 6 tednov star moški BALB /c golih miših. Na kratko, 4 x 10 ^{6 celic (MKN45) v eksponentni fazi rasti smo suspendirali v 1 ml medija kulture s 10% fetalnega govejega seruma. En-celična suspenzija MKN45 je podkožno vcepimo v hrbtno stran miši. Tumorji bila določena za 14 dni po MKN45 celic inokulaciji, čemur sledi obdelava z vozilom, 0,5 in 1,5 mg /kg honokiol vsak dan za 10 dni (7 miši /skupina). Prostornina vsajeno tumorja v hrbtnem delu miši smo izmerili dvakrat na teden z debelino, z uporabo formule V
= ( LW
2) Õ /6: kadar V
, volumen (mm 3); L
, največji premer (mm); W
, najmanjši premer (mm).}

Imunohistokemija

Izraz GRP94 v miške trdnega tumorja je pregledal imunohistokemijo. Pripravili smo Thin tumor oddelki (5 um), ki so določene s hladnim acetonom, blokirana s 3% vodikovega peroksidazo, in obarvali s primarne GRP94 protitelesa.

Statistična Analize

Vrednosti, podane v tej študiji so predstavljeni kot povprečje ± SEM. Vse analize smo izvedli z analizo variance sledilo Fisherjevega vsaj znatno testu razlike. P
vrednost manj kot 0,05 veljal za statistične pomembnosti.

• Plos ONE: galektin-3 Omogoča Cell gibljivost želodčnega raka, ki jih Up regulacijo proteaz aktivira receptor-1 (PAR-1) in Matrix metalo--1 (MMP-1)
• Plos ONE: Visoko manoze-Zavezujoča protivirusnih lektinom PFL od Pseudomonas fluorescens Pf0-1 spodbuja Cell Smrt želodca Cancer Cell MKN28 preko interakcije z a2-integrin