PLoS ONE: Honokiol Induziert Calpain-vermittelter Glucose-regulierten Protein-94-Spaltung und Apoptose in menschlichen Magenkrebszellen und reduziert Tumor Growth

Abstrakt

Hintergrund

Honokiol, ein geringes Molekulargewicht natürliche Produkt wurde potente anti-neoplastische und anti-angiogene Eigenschaften besitzen gezeigt. Seine molekularen Mechanismen und die Fähigkeit von anti-Magenkrebs bleiben unbekannt. Es hat sich gezeigt, dass die anti-apoptotische Funktion der Glucose-regulierte Proteine ​​(GRP) sagt voraus, dass die Induktion in neoplastischen Zellen zur Krebsprogression und Arzneimittelresistenz führen kann. Wir untersuchten die Auswirkungen von Honokiol über die Regulierung der GRPs und Apoptose in menschlichen Magenkrebszellen und das Tumorwachstum.

Methodik und wesentlichen Ergebnisse

Die Behandlung von verschiedenen menschlichen Magenkrebszellen mit Honokiol an die LED Induktion von GRP94 Spaltung, aber hatte keinen Einfluss auf GRP78 nicht. Silencing von GRP94 von small interfering RNA (siRNA) konnte Zell-Apoptose induzieren. Behandlung der Zellen mit Honokiol oder Chemotherapeutika Mittel Etoposid verbessert die Erhöhung der Apoptose und GRP94 Abbau. Die Calpain Aktivität und Calpain-II (m-Calpain) Protein (aber nicht Calpain-I (μ-Calpain)) Ebene könnte auch durch Honokiol erhöht werden. Targeting Calpain-II und Calpain-Inhibitoren Honokiol-induzierte GRP94 Herunterregulation und Apoptose in Magenkrebszellen durch siRNA könnte umgekehrt. Weiterhin zeigten die Ergebnisse der Immunfluoreszenz-Färbung und Immunfällungs eine spezifische Wechselwirkung von GRP94 mit Calpain-II in Zellen nach Honokiol Behandlung. Wir beobachteten, dass neben Tumor GRP94 Überexpression und das Tumorwachstum in Balb /c Nacktmäuse, die mit menschlichen Magenkrebszellen MKN45 beimpft wurden, werden deutlich durch Honokiol Behandlung verringert.

Schlussfolgerungen und Bedeutung

liefern diese Ergebnisse die ersten Anzeichen dafür, dass Calpain-II-vermittelte GRP94 Spaltung verursacht menschliche Apoptose Magenkrebszellen Honokiol-induziert. Wir schlagen vor, ferner, dass Honokiol ein mögliches therapeutisches Mittel sein kann, das klinische Ergebnis von Magenkrebs zu verbessern

Citation. Sheu ML, Liu SH, Lan KH (2007) Honokiol Induziert Calpain-vermittelter Glucose-regulierten Protein-94-Spaltung und Apoptose in menschlichen Magenkrebszellen und reduziert Tumorwachstum. PLoS ONE 2 (10): E1096. doi: 10.1371 /journal.pone.0001096

Academic Editor: Hany El-Shemy, Universität Kairo, Ägypten

Received: 26. Juni 2007; Akzeptiert: 10. Oktober 2007; Veröffentlicht: 31. Oktober 2007

© 2007 Sheu et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit wurde durch ein Forschungsstipendium von National Science Council von Taiwan (NSC95-2320-B040-005) unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs ist die zweithäufigste Ursache für Krebstod in der Welt [1]. Fast zwei Drittel der Fälle treten in Entwicklungsländern und 42% in China allein [1], [2]. Die molekulare Ziele und Mechanismen einer schlechten Prognose zugrunde liegen, sind nicht gut verstanden. Die Behandlung von lokal fortgeschrittenem Magenkrebs bleibt eine große Herausforderung. Trotz der jüngsten Fortschritte in der Behandlung bleibt die klinischen Ergebnisse für Patienten mit Magenkrebs schlecht. Abgesehen von der Operation, die Rolle der adjuvanten Therapie nach wie vor nicht bewiesen [2], [3]. Somit ist die Notwendigkeit, mögliche neue therapeutische und chemopräventiven Mittel zu identifizieren, ist offensichtlich.

Honokiol, eine aktive Komponente isoliert und gereinigt aus dem Magnolia officinalis
, hat sich gezeigt, um die Auswirkungen der Anti-Oxidation zu besitzen [4], gegen Lipidperoxidation [5] und entzündungshemmende in-vitro-
und in vivo
[6], [7]. Honokiol hat auch eine systemisch verfügbar und nicht-toxischen Inhibitor der Angiogenese zu sein gezeigt worden [8]. Die jüngsten Studien berichteten, dass Honokiol Caspase-abhängige Apoptose in B-Zell-chronische lymphatische Leukämie-Zellen und überwindet herkömmliche Arzneimittelresistenz in menschlichen multiplen Myelom durch Induktion von Caspase-abhängigen und -unabhängigen Apoptose [9], [10] induziert. Obwohl eine vollständige Bewertung der klinischen Potential der Verbindungen noch nicht möglich ist, wurde die Pharmakokinetik von Honokiol gründlich untersucht, dass Honokiol enthüllt auf der klinischen Krebstherapie zur Verfügung steht. Weitere natürliche Produkte eine Vielzahl von therapeutischen Verbindungen, die bei der Verhinderung der Entwicklung von bösartigen Erkrankungen entdeckt werden weiterhin enthalten; Jedoch ist sehr wenig über ihre zugrundeliegenden Wirkungsmechanismen oder deren molekulares Ziel bekannt.

Glucose-reguliertes Protein (GRP) 94a am reichlichsten vorhandene Glycoprotein in endoplasmatische Retikulum ist (ER), und nur in Vertebraten identifiziert werden. Die Überexpression Antisense und Ribozym-Ansätze in Gewebe-Kultursystemen demonstriert direkt, dass GRP78 und GRP94 Zellen vor dem Tod schützen konnte [11] - [13]. Die Schutzfunktion der GRPs hat auch im Widerstand gegen Strahlung in Gebärmutterhalskrebs [14] beobachtet. Die anti-apoptotische Funktion des GRPs sagt auch voraus, dass ihre Induktion in Tumorzellen zu Tumorprogression und Medikamentenresistenz führen kann [15] - [18]. Pathologischer Zustände, wie Tumorwachstum und Malignität wurden mit zytoprotektive Protein GRP94 Überexpression [19] zu korrelieren vorgeschlagen. Bei metastasiertem malignen Erkrankungen Modell eine signifikante Wirksamkeit des GRP94-basierten Gen /Immuntherapie Strategie gezeigt wurde, wenn es mit einer Strahlentherapie [20] kombiniert wurde. Die ER spielt eine direkte Rolle einer Untergruppe von Caspase während der Aktivierung der Apoptose bei der Aktivierung, die während ER Stress auftritt [21]. Auf der anderen Seite, sind calpains eine Familie von Ca ^{2 + -abhängigen intrazellulären Cystein-Proteasen. Ubiquitär exprimiert Calpain-I (μ-Calpain) und Calpain-II (m-Calpain) Proteasen, die in die Entwicklung der Apoptose beteiligt sind. Eine aktuelle Studie hat gezeigt, dass die allgegenwärtige calpains Caspase-12 und JNK-Aktivierung während ER-Stress-induzierten Apoptose fördern [22]. Es wurde auch angegeben, daß GRP94 mit Ca 2 + -Bindung und anti-apoptotische Eigenschaften ist ein proteolytisches Ziel von Calpain während Etoposid-induzierte Apoptose [23]. Darüber hinaus wird in mehreren experimentellen Modellen der Apoptose wurde gefunden, dass die Amino-terminale Calpain inhibitorische Einheit Calpastatin durch Caspasen gespalten werden kann, wird die Spaltung darauf hindeutet, für die Regulierung der Calpain-Aktivität während des Zelltods wesentliche gezeigt [24] - [28] . Caspase-7, die in die Notaufnahme in betonte Zellen rekrutiert wird, ebenfalls abspalten können und Caspase-12 [29] aktivieren - [31]. Die Wirkungen von Honokiol auf der GRPs bezogenen Signalisierungs und Apoptose bleiben noch unbekannt. In der vorliegenden Studie untersuchten wir die molekularen Mechanismen der Honokiol auf humane Magenkrebszellen Apoptose und Tumorwachstum In-vitro-
und in vivo
. Unerwarteterweise fanden wir, dass GRP94 von Calpain während Honokiol induzierte Apoptose spezifische proteolytische Spaltung unterzogen wird. Diese Beobachtungen können Beweise geben, dass Honokiol ist ein mögliches therapeutisches Mittel klinische Ergebnis von Magenkrebs zu verbessern.}

Ergebnisse |

Kinetik von GRP94 proteolytischen Spaltung in der menschlichen Linien Magenkrebszellen mit Honokiol
behandelt

Wir untersuchten zunächst die Auswirkungen der Honokiol auf den Ausdrücken von GRP94 und GRP78 in verschiedenen menschlichen Magenkrebszelllinien. Honokiol deutlich verringert die Niveaus von GRP94 in einer dosis- und zeitabhängigen Weise, aber GRP78 Niveaus nicht betroffen sind (Fig. 1 und 2). Kinetik der Honokiol induzierter GRP94 Spaltung in verschiedenen menschlichen Magenkrebszellen wurden in Fig. 2. MKN45 oder SCM-1-Zellen waren resistent gegen Honokiol induzierten Reaktionen als AGS oder N87-Zellen; die Pegel der GRP94 wurden doppelt so viel Zeit auf etwa 50% reduziert. Die Niveaus der GRP78 Proteine ​​bleiben unverändert in allen vier Magenkrebs-Zelllinien. Außerdem gibt es wenig GRP94-Protein Ausdrücke in normalen Maus Magenepithel Gewebe und menschlichen Endothelzellen im Vergleich mit Magenkrebszellen (Fig. 1C).

Honokiol induziert GRP94 Spaltung assoziiertes apoptotische Reaktion

wie in gezeigt. 3, Honokiol der Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) Spaltung und DNA-Schaden induzierbaren Gens CHOP /GADD153 (ein Protein identifiziert wurde ER Stress-induzierte Apoptose zu vermitteln) erhöhte Spiegel in MKN45-Zellen in einer dosis- und zeitabhängigen Weise. Honokiol 20 und 40 M ausgelöst auch die Ausdrücke gespalten Caspase-12 und Caspase-7 (p20), die die Größe der Erhöhung des Zeitpunkts proportional war (Fig. 3B). Darüber hinaus zu verstehen, ob GRP94 Spaltung im menschlichen apoptosis Magenkrebszellen beteiligt war, wurde in GRP94-siRNA-transfizierten Zellen Apoptose nachgewiesen. Silencing von GRP94 von siRNA induzierte Zellapoptose (Fig. 4A) und verringerte GRP94-Protein-Expression (Fig. 4B-a). Wir verglichen auch die Auswirkungen von Honokiol auf die Apoptose und GRP94 Abbau in menschlichen Magenkrebszellen mit Chemotherapeutika Mittel Etoposid. Die Ergebnisse zeigten, dass die Behandlung der Zellen mit Honokiol oder Etoposid die Zunahme der Apoptose (Fig. 4A) erweitert und GRP94 Abbau (Fig. 4B-b). Wenn die Zellen wurden gleichzeitig mit 40 M Etoposid und 20 M Honokiol, eine größere Zunahme der GRP94 Abbau behandelt, als sie gezeigt haben war (4B-b.); Diese Ergebnisse bedeuten, dass mit anderen Krebsmedikamenten von Honokiol die Kombination kann eine mögliche therapeutische Strategie sein.

Calpain für Honokiol-vermittelte Zell-Apoptose
erforderlich ist,

Wir bestimmt als nächstes, ob die Aktivität von Calpain (Calcium -abhängige Thiolproteasen) würde durch Honokiol in vier Magenkrebszelllinien induziert werden. Wie in gezeigt. 5A, Honokiol 20 M erhöhte Calpain-Aktivität in einer zeitabhängigen Art und Weise, die in 15 min zu erhöhen begann, und erreichte bei 60 min und fiel dann bei 4 h auf ein niedrigeres Niveau nach unten. Zellen blieben adhärenten über den Zeitverlauf, ohne Verlust der Lebensfähigkeit (Daten nicht gezeigt). In Fig. 5B zeigten die Ergebnisse, dass die Erhöhung von Calpain-Aktivität in Reaktion auf Honokiol (20 und 40 M) für 60 min in vier Magenkrebs-Zelllinien. Weiterhin hemmte Calpain-Inhibitoren, N-Acetyl-leu-leu-norleucinal (ALLN), N-Acetyl-leu-leu-methioninal (ALLM) und Z-Leu-Leu-CHO, wirksam den Anstieg von Calpain-Aktivität durch Honokiol induzierte in N87 und SCM-1-Zellen (Abb. 5C).

Wir weiter geprüft, ob Calpain Aktivität vermindert die Fähigkeit von Honokiol auf Apoptoseinduktion beeinträchtigen könnten. Wie in gezeigt. 6A, Honokiol (40 M) induzierte Zell-Apoptose in SCM-1-Zellen, die durch Calpain-Inhibitoren (ALLN oder ALLM) umgekehrt werden könnte. Honokiol erhöhte Calpain-II-Protein darüber hinaus aber nicht Calpain-I-Protein Ausdrücke in SCM-1-Zellen (Abb. 7A). zu einer deutlichen Verminderung von Honokiol (20 M) -induzierte Apoptose in menschlichen Magenkrebszellen nach 4 h Behandlung (Abb. 6B) führte eine siRNA-Ansatz zu Calpain-II-Aktivität Knockdown. SiRNA-Calpain-I hatte keinen Einfluss auf Honokiol-induzierte Apoptose (Abb. 6B).

Lokalisierung und Interaktion von Calpain-II und GRP94 folgende Honokiol Behandlung

Der nächste Schritt die Rolle aufklären sollte von Calpain-II in GRP94 Abbau Honokiol-induziert. Bei der Laser-konfokalmikroskopische Studie wurde die Lokalisierung von Calpain-II-Protein durch grüne Fluoreszenz bestimmt, während die Lokalisierung von GRP94 durch rote Fluoreszenz bestimmt. Wie in gezeigt. 7B, die beide Calpain-II und GRP94 wurden in Zytoplasma mit Co-Lokalisation in menschlichen Magenkrebszellen nachgewiesen. Die Fluoreszenz von Calpain-II wurde allmählich erhöht, aber Fluoreszenz von GRP94 wurde in menschlichen Magenkrebszellen unter Honokiol Behandlung allmählich verringert. Um die Ergebnisse von immunzytochemische Färbung bestätigen, dass Calpain-II mit GRP94 interagiert, die Tests von Co-Immunpräzipitation und Western-Blot in Magenkrebszellen durchgeführt wurden. Wie in gezeigt. 7C Calpain-II wurde speziell mit GRP94 in verschiedenen Magenkrebszellen in Gegenwart von Honokiol (20 und 40 M) zugeordnet sind, wie mit IgG Kontrolle verglichen. Außerdem untersuchten wir, ob die proteolytischen Aktivitäten von Caspase, Proteasom oder Cathepsin wurden bei der Spaltung von GRP94 beteiligt. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Behandlung der Zellen mit Caspase-Inhibitoren (Ac-DEVD-CHO, Z-VAD-FMK und Z-DEVD-FMK, 50 M) bei hoher Dosis teilweise die Spaltung von GRP94 während Honokiol-induzierter Apoptose (Fig blockiert. 8A ) als mit Calpaininhibitor verglichen ALLM 25 M, die vollständig GRP94 Spaltung blockieren könnte. Eine Vorbehandlung der Zellen mit dem Cathepsin-B-Inhibitor CA-074-Me 25 und 50 M und Cathepsin L-Inhibitor von Cathepsin L-Inhibitor II 25 und 50 M und Proteasom-Inhibitor MG132 0,1-10 M konnte GRP94 Spaltung zu blockieren (Fig. 8B und 8C) . Darüber hinaus könnte die spezifische Spaltung von GRP94 von Calpain von menschlichen Magenkrebszellen hergestellt Zelllysaten beobachtet werden (Daten nicht gezeigt).

Wir untersuchten als nächstes, ob die Aktivierung von Calpain zur Honokiol induzierte Zell-Apoptose erforderlich ist. In Fig. 9, die Erhöhungen von Calpain-II-Protein-Expression und GRP94 Abbau und Caspase-7 und Caspase-12-Aktivierung durch Honokiol induziert (40 M) wurden durch pharmakologische Calpain-Inhibitoren und transiente Transfektion von siRNA-Calpain-II in SCM-1-Zellen verhindert.

Honokiol dämpft Tumor GRP94 über~~POS=TRUNC und das Tumorwachstum in Nacktmäusen

Nacktmäuse mit 4 x 10 ^{6 undifferenzierten Adenokarzinomzellen MKN45 und mit Honokiol 0,5 und 1,5 mg behandelt wurden geimpft /kg oder Fahrzeug, wenn die Tumor wurde deutlich. Immunhistologische und Western-Blot-Analyse zeigte, dass GRP94 Überexpression und in Tumorbereich angesammelt hat, aber nicht in normalem Magengewebe (Fig. 10A-a und 10A-b). Honokiol verringert deutlich die Akkumulierung von GRP94 in Tumoren im Vergleich zu Vehikelkontrolle (Fig. 10A-a und 10A-b). Die Expression von GRP78 nicht betroffen war (Daten nicht gezeigt). Um zu bestimmen, ob Honokiol Tumorwachstum unterdrücken konnte in vivo
, solide Tumoren wurden in Mäusen hergestellt und die Antitumorwirkung von wiederholt injiziert Honokiol sucht. Wie in gezeigt. 10B, die Verabreichung von Honokiol 0,5 und 1,5 mg /kg zeigte eine signifikante Anti-Tumor-Aktivität.}

Diskussion

Wir berichteten hier zum ersten Mal, dass Calpain, ein nicht-lysosomale Ca ^{2 + -aktivierten Cysteinprotease, insbesondere Calpain-II, spielt eine wichtige Rolle bei der Spaltung von GRP94, GRP78 aber nicht beeinträchtigt ist, und bei der Regulation der Apoptose durch Honokiol in menschlichen Magenkrebszellen induziert. Insbesondere, wenn wir funktionelle Beweise, dass die Spaltung von GRP94 auf Honokiol Behandlung wirkt als ein therapeutischer Nutzen, das Tumorwachstum in der Maus-Modell der menschlichen Magenkarzinom zu hemmen. Unseres Wissens ist dies der erste Bericht, dass Honokiol zu zeigen, kann Calpain-induzierbaren Chaperon-Protein GRP94 Abbau ist das Ziel während der Apoptose zu manipulieren.}

Studien von mehreren Laboratorien in die Notaufnahme als Zielraum zeigte durch therapeutische Mittel verwickelt bei der Apoptose Ausführung. Cytosolic Ca ^{2 + hat als zweiter Bote proapoptosis sowohl die Apoptose auslösen und Regel Caspasen oder calpains [32] beteiligt verwickelt - [34]. Eine aktuelle Studie hat gezeigt, dass Calpain ein wichtiger Vermittler von Resveratrol ist (ein natürliches Pflanzen Polyphenol) -induzierten Apoptose bei Brustkrebs [35]. Sie fanden heraus, dass Resveratrol eine Erhöhung der intrazellulären Ca verursachen 2+ und aktiviert Calpain-vermittelte Apoptose, was zu der Verschlechterung der Plasmamembran Ca 2 + -ATPase-Isoform 1 und Fodrin in Caspase-3-defizienten MCF- 7-Zellen. Honokiol wurde auch berichtet worden, Ca zu induzieren 2+ -Mobilisierung in rat cortical Neuronen und humanen Neuroblastom-SH-SY5Y-Zellen, vermutlich durch die Aktivierung von Phospholipase C und IP _{3 -Rezeptoren [36]. In der vorliegenden Studie haben wir festgestellt, dass Honokiol zunehmender Calpain Aktivität fähig ist, und Calpain-II-Protein-Expression, aber nicht Calpain-I bei Magenkrebs Zell-Apoptose Honokiol-induziert. Außerdem Calpain-Inhibitoren und Silencing von Calpain-II durch siRNA umgekehrt signifikant die Honokiol-induzierte Apoptose. Diese Ergebnisse implizieren, dass Ca 2 + -triggered Calpain-II-Aktivierung eine mögliche Rolle in Honokiol-induzierte Apoptose spielen kann.}}

GRP94 /gp96 ist die ER-Mitglied der HSP90-Familie. GRP94 spielt eine wichtige Rolle zelluläre Homöostase aufrechtzuerhalten. Dieses herkömmliche Konzept der GRP94 als Proteinfaltung Chaperons durch die Entdeckungen aktualisiert, die Tumorproliferation, der Metastasierung, drug resistance GRPS fördern und Immuntherapie, die in der Prognose und Behandlung von Krebs wichtige klinische Auswirkungen haben [3]. GRP94 nachgewiesen wurde mit Tumorigenität in Krebszelllinien, Nagetier-Tumormodellen und menschlichen Krebsbiopsien assoziiert zu sein [37] - [39]. Dies steht im Einklang mit den Ergebnissen, dass die Induktion von GRPs eine Schutzfunktion, wie die Überlebensreaktionen auf Nährstoffmangel verursacht, Azidose und Hypoxie Bedingungen, die in schlecht vaskularisierte soliden Tumoren gemeinsam sind [11], [40]. Es wurde auch erschienen, dass die meisten der GRPs in Tumorzellen in multi-Chaperon-Komplexe in Eingriff ist, während es nicht in normalen Zellen [41] ist. Impfung von Mäusen mit Tumor-abgeleitete Stressproteine ​​können GRP94, hervorrufen anti-Tumor-Immunantwort, eine deutliche Hemmung des Tumorwachstums und der Metastasierung führt. Die Aktivität von Hsp90-Inhibitoren wurde in präklinischen Brustkrebs-Modelle, sowohl in Monotherapie-Studien und in Kombination mit einer herkömmlichen Chemotherapie [41] gut validiert. Außerdem wurde vorgeschlagen, daß GRP94 ein physiologisches Substrat für Calpain ist [23]. Calpain wurde an der ER-Membran aktiviert nachgewiesen werden, wo sie mit GRP94 zusammenwirkt, in seiner spezifischen proteolytischen Spaltung führt, wie die Zellen Apoptose durch Etoposid ausgelöst laufen [23]. In der aktuellen Studie fanden wir, dass Honokiol-induzierte GRP94 Spaltung und Apoptose in menschlichen Zellen Magenkrebs kann vollständig durch Calpain-Inhibitoren und Silencing von Calpain-II durch siRNA rückgängig gemacht werden. Caspase-Inhibitoren bei hoher Dosis umgekehrt teilweise die Honokiol-induzierte GRP94 Spaltung. Eine Vorbehandlung der Zellen mit dem Cathepsin B und L-Inhibitoren und Proteasom-Inhibitor konnte Honokiol induzierte GRP94 Spaltung zu blockieren. Wir zeigten auch, dass Magenkrebszellen von GRP94 durch siRNA-Silencing Apoptose induzieren kann. Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse der immunzytochemische Färbung und Immunpräzipitation eine spezifische Wechselwirkung von GRP94 mit Calpain-II in Magenkrebs-Zellen nach Honokiol Behandlung. Die spezifische Spaltung von GRP94 von Calpain auch beobachtet werden konnte von menschlichen Magenkrebszellen hergestellt Zelllysate unter Verwendung von. Diese Befunde deshalb vermuten, dass Calpain-II-vermittelte Spaltung GRP94 spielt eine wichtige Rolle in Honokiol ausgelöste Magenkrebszelle Apoptose.

Calpaine und Caspasen sind zwei Familien von Cysteinproteasen, die sie bei der Regulierung der pathologischen Zelle beteiligt sind Tod [22], [31]. Diese Proteasen teilen sich mehrere Tod im Zusammenhang mit Substraten, einschließlich Caspasen selbst, Cytoskelettproteinen, Bax und Bid [42]. Calpain-vermittelter Proteolyse erfolgt in einer begrenzten Art und Weise, aber keine spezifische Aminosäurerest wie die Caspasen erfordern. Obwohl sowohl Calpain und Caspase vorgeschlagen wurden, bei der Regulierung der pathologischen Zelltod eine bedeutende Rolle spielt, sind die Wechselwirkungen dieser beiden Familien von Proteasen unter pathologischen Bedingungen nicht klar. In der vorliegenden Studie Zuschlags und pharmakologische Inhibitoren Ansätze wesentlich zu unserem Wissen von Calpain Biologie, insbesondere in Bezug auf seine spezifische Funktion auf Zell-Apoptose bei, die möglich ist, dass Caspasen 7 und 12 von Calpain stromabwärts sind Magenkrebs in der Vermittlung Honokiol induzierten Zell-Apoptose.

Naturprodukt Medikamente wurden eine dominierende Rolle in der pharmazeutischen Versorgung zu spielen vorgeschlagen [43]. Naturprodukte sind eine der wichtigsten Quellen von möglichen chemotherapeutischen Krebs und chemopräventiven Mitteln [43]. Honokiol seit mehreren tausend Jahren in der traditionellen chinesischen und japanischen Medizin weit verbreitet, vor allem für die Behandlung von anti-thrombozytäre, antibakterielle, entzündungshemmende und anxiolytische Wirkungen. In früheren Berichten wurde gezeigt, dass Honokiol auch potent anti-neoplastische und anti-angiogenen Eigenschaften [6], [19], [38] besitzt. Jedoch ist die genaue molekulare Mechanismus der zeigte Antitumoraktivität von Honokiol nicht gut verstanden. Somit sind die Ergebnisse dieser Studie liefern Beweise für die Antitumoraktivität von Honokiol in Magenkrebs, und was noch wichtiger ist, die molekulare Grundlage für ihre Wirkung. Wir fanden, dass Honokiol induziert die Aktivierung von Calpain, GRP94 Spaltung und Apoptose in menschlichen Magenkrebszellen. Darüber hinaus wurde nach Verabreichung von Honokiol in Nackt schön implantiert mit MKN45 Magentumorzellen zeigten eine signifikante Antitumoraktivität. Diese präklinischen Studie können als Rahmen dienen und stellt einen vielversprechenden neuen zielgerichteten Ansatz. Darüber hinaus haben die natürlichen Verbindungen wurden mit herkömmlichen Zytostatika zu kombinieren gezeigt mit Krebsmedikamenten vorteilhaft klinischen sein kann. Dieser Vorteil plus die Schwellen Beweise für seine Anti-Tumor-Mechanismen machen Honokiol laufenden klinischen Anwendung für eine wirksame und sichere Antitumormittel ist.

Materialien und Methoden

Zellen, Kulturbedingungen und Reagenzien

Menschliche Zelllinien, einschließlich Europäischer Magenkrebszelllinien (AGS, ein mäßig schlecht differenzierten Adenokarzinom-Zelllinie und N87, eine gut differenzierten Karzinom-Zelllinie) und asiatischen Magenkrebs-Zelllinien (MKN45 und SCM-1, die undifferenzierten Adenokarzinom-Zellen) wurden aus Zellbank in Krebszentrum von Taipei Veterans General Hospital (Taiwan) erhalten. Zellen wurden in RPMI 1640 Medium mit 10% hitzeinaktiviertem FCS (Life Technologies) und Streptomycin /Penicillin (Life Technologies) in einem befeuchteten 5% CO _{2 -Atmosphäre gehalten. Honokiol wurde von Wako Chemical Company (Japan) erhalten, und seine Reinheit wurde bestimmt ein Minimum von 99% durch Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie zu sein.}

Western-Blot-Analyse und Immunpräzipitationen

Ganzzelllysate wie zuvor beschrieben, wurden hergestellt [44]. Proteine ​​wurden durch vorgegossenen 8-20% SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt und dann elektrophoretisch aus dem Gel auf Polyvinylidendifluorid-Membranen übertragen. Nach dem Blockieren wurden die Blots inkubiert, anti-GRP94, anti-GRP78, Anti-Caspase-12, Anti-Caspase-7, anti-PARP, anti-GADD153 (Santa Cruz Biotechnology), anti-Calpain-I (μ-Calpain), anti-Calpain-II (m-Calpain) (Santa Cruz Biotechnology) und anti-β-Actin (Sigma) in PBS-Antikörpern innerhalb von 0,1% Tween 20 für 1 h durch drei 10 min Waschen in PBS in 0,1% Tween 20. Die folgte Membranen wurden anschließend mit Meerrettich-Peroxidase-konjugierten Sekundärantikörper für 60 min inkubiert. In Immunpräzipitation, Proteine ​​(500 g) wurden mit spezifischen Antikörpern inkubiert und auf Protein-A-Sepharose-Kügelchen immobilisiert. Die Perlen wurden ausgiebig mit Bacco immunoprecipitative Puffer, gekocht, und mikrozentrifugiert gewaschen. Eingang 10% Zelllysat für IP und 50 g Proteine ​​wurden durch Western-Blotting analysiert. Der Nachweis wurde mit Western-Blot-Reagenz ECL (Amersham) durchgeführt, und die Chemilumineszenz wurde durch die Kodak X-Omat Filme belichtet.

Calpain Aktivität Assays

Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC ist ein Calpain-Protease-Substrat. Quantifizierung von 7-Amino-4-methylcumarin (AMC) Fluoreszenz erlaubt die Überwachung der Enzymhydrolyse des Peptid-AMC-Konjugats und kann verwendet werden, die Enzymaktivität zu messen. Die Zellen wurden hergestellt und behandelt auf 24-Well Corning /Costar-Platten. Vor der Zugabe von Inhibitoren Zellen wurden mit 40 M Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC (Biomol) und mit Honokiol zum angegebenen Zeitpunkt, bei 37 ° C in einem befeuchteten 5% CO _{2 Inkubator geladen. Die Proteolyse der Fluoreszenzsonde überwacht wurde eine fluoreszierende Platte Lesesystem (HTS-7000 Plus Serie BioAssay, Perkin Elmer) mit Filtereinstellungen von 360 ± 20 nm für die Anregung und 460 ± 20 nm für die Emission verwenden.}

SiRNA und Transfektionsassays

die siRNA-Duplexe spezifisch für die Hemmung von Calpain-I (μ-Calpain) und Calpain-II (m-Calpain) Ausdrücke in menschlichen Zellen, die aus Santa Cruz Biotechnology erhalten: Calpain-I, Katalog-Nr . sc-29885, ein Pool von 3 zielspezifische 20-25 nt siRNAs; Calpain-II, Katalog-Nr. SC-41459, eine zielspezifische 20-25 nt siRNA. Die Kontroll-siRNA (Katalog-Nr. Sc-37007) ist ein nicht-Targeting 20-25 nt siRNA als negative Kontrolle ausgelegt. Außerdem Duplexen die siRNA spezifisch für die Inhibierung der Expression GRP94 synthetisiert wurde kommerziell von der Firma MWG Biotech (Deutschland). Der Sinn (oben) und Antisense (unten) Sequenzen des GRP94 siRNA-Duplex waren wie folgt: 5'-GAAGAAGCAUCUGAUUACCTT-3 '; 3'-TTCUUCUUCGUAGACUAAUGG-5 '. Als nicht-spezifische Kontrolle wurde ein NC-siRNA-Duplex mit zufälligen Sequenzen wie folgt aufgebaut: 5'-AGUUCAACGAGUAUCAGCATT-3 '; 3'-TTUCAAGUUGCUCAUAGUCGU-5 '. Die siRNAs wurden in einer Konzentration von 100-200 nM für die transiente Transfektion von Zellen mit Lipofectin (Invitrogen) pro Vertiefung in einer Platte mit 6 Vertiefungen mit frischem Medium verwendet. Nach 24 h von der anfänglichen Transfektion und 24-36 h Behandlung wurden gesammelt Zellen oder Zelllysaten und für die Apoptose oder Proteinexpression analysiert sind.

Immunofluoreszenz und Laser-Scanning-konfokale Mikroskopie

Die Zellen wurden zweimal mit PBS, fixiert in 4% Paraformaldehyd für 30 min und dann blockiert durch Inkubation in 1% Rinderserumalbumin in PBS gewaschen. Primäre Antikörper wie angegeben bei einer Verdünnung von 1:500 und inkubiert bei 4 ° C auf die Objektträger über Nacht angewendet wurden. Die Proben wurden mit FITC-konjugiertem oder TRITC-konjugierten sekundären Antikörpern (Sigma) behandelt. Die FITC-markierten oder TRITC-markierten Zellen wurden dann durch Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Für Laser-Scan-Mikroskopie, wurden Immunfluoreszenz-markierten Zellen unter Verwendung eines invertierten Laser-Scanning-Mikroskop (Zeiss LSM 410 Invertzucker, Deutschland) untersucht, wobei sowohl Argonionen ausgestattet (488 nm) und He-Ne (543 nm) Laser. Co-Lokalisation von zwei markierten Antigene wurde als ein einzelnes Bild erkannt wird, wenn die Bilder von beiden Kanälen überlagert wurden. Konfokalbilder waren Hintergrund subtrahiert und fusionierte die konfokale Assistant-Software-Programm, und verarbeitet mit Adobe Photoshop-Software.

Annexin-V-FITC und PI Doppelfärbung

Die Annexin V /Propidiumiodid (BD Clontech) wurde verwendet, um Zahlen von apoptotischen Zellen zu quantifizieren, wie vorstehend [44] beschrieben. Zellen wurden zweimal mit PBS und gefärbt mit Annexin V und PI für 20 min bei Raumtemperatur gewaschen. Die Höhe der Apoptose wurde durch die Messung der Fluoreszenz der Zellen durch Durchfluß-Zytometer (Becton Dickinson) bestimmt. Datenerfassung und Analyse wurden von der Cellquest-Programm (Becton Dickinson) durchgeführt.

Tiere

Tierversuche wurden durchgeführt gemäß den Richtlinien des Ausschusses für Tierversuche, der National Chung Hsing University, Taichung, Taiwan. Männliche Balb /c Nacktmäuse ( nu /nu
) wurden von NLAC Taiwan, Inc., Taipei, Taiwan gekauft. Die Mäuse wurden unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen gezüchtet und gepflegt, mit sterilisiertem Futter und Wasser ad libitum zur Verfügung gestellt und in einer Sperranlage mit 12 h Hell /Dunkel-Zyklen untergebracht. Versuchsverfahren wurden auf 6-Wochen alten Mäusen durchgeführt. Die Tiere wurden eingeschläfert, wenn sie moribund erschien.

Tumorwachstum Assay

Zell tumorigenicity wurde in 6 Wochen alten männlichen Balb /c Nacktmäusen untersucht. Kurz gesagt, 4 x 10 ^{6 von Zellen (MKN45) in einer exponentiellen Wachstumsphase wurden in 1 ml Kulturmedium mit 10% fötalem Rinderserum suspendiert. Eine Einzelzellsuspension von MKN45 wurde subkutan in die dorsale Seite der Mäuse inokuliert. Tumoren wurden 14 Tage nach der etablierten MKN45-Zellen Inokulation und gefolgt von der Behandlung mit Vehikel, 0,5 und 1,5 mg /kg Honokiol täglich für 10 Tage (7 Mäuse /Gruppe). Das Volumen des implantierten Tumors in dorsalen Seite von Mäusen wurde zweimal pro Woche mit einem Greifzirkel gemessen, unter Verwendung der Formel V
= ( LW
2) &pgr; /6: wobei V
, Volumen (mm 3); L
, größten Durchmesser (mm); W
, kleinsten Durchmesser (mm).}

Immunhistochemie

Die Expression von GRP94 in Maus soliden Tumor durch Immunhistochemie untersucht. Dünne Tumorschnitte (5 &mgr; m) hergestellt, fixiert mit kaltem Aceton, mit 3% Wasserstoff-Peroxidase blockiert und mit für die primäre GRP94-Antikörper gefärbt.

Statistische Analysen

Die Werte in dieser Studie gegeben sind als Mittelwert ± SEM dargestellt. Alle Analysen wurden durch Varianzanalyse durch eine Fisher am wenigsten signifikanten Unterschied Test gefolgt durchgeführt. P
Wert von weniger als 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

• PLoS ONE: Galectin-3 Erleichtert Zellmotilität in Magenkrebs durch Hochregulation Protease-Activated Receptor-1 (PAR-1) und Matrix Metalloproteinase-1 (MMP-1)
• PLoS ONE: High Mannose-bindenden Lektin Antivirale PFL aus Pseudomonas fluorescens Pf0-1 Fördert Zelltod von Magenkrebszellen MKN28 über Wechselwirkungen mit α2-Integrin