Plos ONE: MicroRNA-149 zavira proliferacijo in celično Cycle napredovanja po usmeritvi ZBTB2 v humani Rak želodca

Povzetek

Vedno več dokazov kaže, da lahko miR-149 tako zatreti in spodbuja rast tumorja, odvisno od vrste tumorja. Vendar vloga miR-149 v napredovanje raka želodca (GC) ostaja neznan. Tu poročajo, da je miR-149 tumor supresor raka človeške želodčne. miR-149 izraz je zmanjšal v celičnih linijah GC in kliničnih vzorcev v primerjavi z običajnim želodca epitelijske celice in tkiva, oz. Stopnje izraženosti za miR-149 sovpada tudi z diferenciacije stopnjo GC celic in tkiv. Poleg tega, zunajmaternične izraz miR-149 v želodčnih rakavih celicah zavira proliferacijo in celičnega ciklusa napredovanje, ki ga navzdol regulacijo ZBTB2
, močan represivni za ARF-HDM2-p53-p21 poti je, s potencialno vezavno mesto za miR-149 v svojem mRNA je 3'UTR. To je bilo ugotovljeno tudi, da ZBTB2 izražanja povečanje GC celic in tkiv v primerjavi z običajnim želodca epitelijske celice in tkiva oz. Utišanje ZBTB2
vodi k zatiranju rasti celic in aretaciji celičnega ciklusa pri G0 /G1 fazo, kar pomeni, da lahko ZBTB2 deluje kot onkogen v GC. Poleg tega transfekcija miR-149 posnema v želodcu rakavih celic inducira navzdol regulacijo ZBTB2 in HDM2 in regulacijo navzgor ARF, p53 in p21 v primerjavi s kontrolno skupino. Skratka, naši podatki kažejo, da miR-149 deluje kot supresorski tumorju človeškega raka želodca vsaj delno s strani, skozi, ciljanje ZBTB2

Navedba. Wang Y, Zheng X, Zhang Z Zhou J Zhao G Yang J, et al. (2012) MicroRNA-149 zavira proliferacijo in celično Cycle napredovanja po usmeritvi ZBTB2
in človeške želodčne raku. PLoS ONE 7 (10): e41693. doi: 10,1371 /journal.pone.0041693

Urednik: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Združene države Amerike

Prejeto: 13. marec 2012; Sprejeto: 25. junij 2012; Objavljeno: 29. oktober 2012

Copyright: © 2012 Wang et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. To delo je podprta s sredstvi iz državnega Natural Science Foundation Kitajske (št. 30872966 in št. 31071135), National Natural Science Foundation Kitajske (št. 81000864, ​​št. 81172290, št. 91129723, št. 81090270, in št. 81090273) in kitajski Podoktorski Science Foundation (št. 20100471776). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca (GC) je eden od najpogostejših rakov in glavnih vzrokov smrti zaradi raka po vsem svetu, še posebej v vzhodni Aziji, v skladu z najnovejšo globalno oceno, objavljenem leta 2011 [1]. Kljub izredno zmanjšanje pojavnosti GC v večini delov sveta, je še vedno veliko breme na velikem številu primerov GC in smrti po vsem svetu. Karcinogenosti GC je zelo zapleten postopek [2] - [5], ki vključuje disregulacij več genov [6] - [8], vključno onkogenov [9] - [14] in tumor valov [15] - [18]. Vendar pa jih je treba dodatno raziskati molekularne mehanizme, ki so potrebni za razvoj GC in napredovanje.

MicroRNAs (miRNAs) so skupina endogeno izražena, nekodiran majhne RNA (20-25 nukleotidov), je znano, da negativno regulira izražanje genov z zaviranjem prevod ali zmanjšuje stabilnost mRNA neposredno veže na 3'-neprevedene regije (3'-UTR) ciljnih mRNA [19], [20]. Kopičijo dokazi kažejo, da miRNAs igrajo pomembno vlogo pri razvoju, metabolizem, proliferacijo, diferenciacijo in apoptozo. Poleg tega je zmotna post-transkripcijski regulacijo mRNA s miRNAs povezana z tumorigeneze [21]. Nenormalne izraz profili miRNAs bili odkriti v različnih vrst človeških tumorjev, vključno pljuč [22], dojke [23], prostate [24], jetra [25], kolona [26] in rak želodca [27]. Poleg tega se lahko nekateri miRNAs deluje kot onkogeni ali tumorske razbijal z regulacijo ekspresije ciljnih genov, ki igrajo pomembno vlogo pri napredovanju celičnega ciklusa, apoptozo ali orožja. miR-22 [28], miR-101 [29], in miR-7 [30] so bili vsi pokazali, da se navzdol reguliranih v tumorskih vzorcev in delujejo kot tumorskih razbijal; miR-17 [31] in miR-21 [32] se je pokazalo, da se povečana pri tumorskih vzorcev in delujejo kot onkogeni. Te študije kažejo, da je disregulacijo od miRNAs pogosto vpletena v karcinogeneze in napredovanja raka.

Nedavne študije so pokazale, da lahko miR-149 igrajo pomembno vlogo pri različnih boleznih, vključno z napredovanjem malignih tumorjev. miR-149 Dokazano je, da deluje hkrati kot tumorski supresorski [33] in onkogen [34] v razvoju več vrst čvrstih tumorjev. Na primer, izguba miR-149 zagotavlja boljšo funkcije nekaterih onkogeni in v korelaciji s stopnjo tumorja v karcinomom ledvičnih celic [35], astrocitomov [36], in karcinom prostate [37]. Ektopična ekspresija miR-149 inducira apoptozo nevroblastoma in HeLa celic [33]. Zvišane izraz miR-149 so poročali, da je pomembno pri napredovanju nazofaringealnega karcinoma [38] in melanoma metastaz [34]. Poleg tega je disregulacijo miR-149 vpleten tudi v nekaterih zunaj neoplastičnih bolezni. Na primer, downregulation miR-149 ekspresijo vključen v razvoj primarnega mielofibrozo, policitemije vere, in esencialno trombocitemijo [39] in izgubo miR-149 lahko zatiranje virusa hepatitisa C (HCV) RNA številčnost [40]. Vendar pa izraz vzorec in vloga miR-149 pri pripravi GC ostaja nejasno.

V tej študiji smo ugotovili, da je miR-149 občutno navzdol reguliranih v celičnih linijah GC in kliničnih vzorcih v primerjavi do normalna želodca epitelnih celic in sosednje niso tumor tkiva oz. Zunajmaternična izraz miR-149 zavira proliferacijo in inducira G0 /G1 aretacija AGS in SGC7901 celice in vitro
z usmerjanjem ZBTB2
. Poleg tega, izčrpavanje ZBTB2
z rezultati siRNA v inhibicijo proliferacije in celičnega ciklusa aretacijo. Izraz vzorec miR-149 in ZBTB2 v celičnih linijah GC in kliničnih vzorcih je bilo obratno povezana, nadalje kaže, da ZBTB2
je ciljni gen miR-149. Uvedba miR-149 rezultatov na spremembe v izražanju p53, p21, ARF in HDM2, člani ARF-HDM2-p53-p21 poti, s katerimi se ureja ZBTB2. Če povzamemo, ti rezultati potrjujejo, da je miR-149 navzdol reguliranih v GC celic in kliničnih vzorcih in kažejo, da miR-149 deluje kot supresorski rasti želodčnega raka celic z zaviranjem širjenja in celičnega ciklusa napredovanje.

Rezultati

izražanje miR-149 je navzdol reguliranih v GC celičnih linijah in kliničnih vzorcev

da bi ocenili vlogo miR-149 v karcinogenosti GC, smo najprej uporabili kvantitativno RT-PCR za merjenje izražanja miR-149 v GC humanih celičnih linijah (MKN45, GC9811, AGS, SGC7901 in MKN28) in ugotovili, da je miR-149 navzdol reguliranih v celičnih linijah GC primerjavi z običajnim želodčne epitelijskega linije, GES-1 (sl. 1A). Zlasti je nivo izražanja miR-149 v pozitivni korelaciji z diferenciacije stopnjo GC celic. Namreč, raven izražanja miR-149 v slabo diferencirane celične linije, kot MKN45, GC9811, in AGS, je bistveno nižja kot v srednje in dobro diferencirane-celične linije. Izraz miR-149 v zmerno diferenciranih celic, SGC7901, nižja od tiste, v dobro diferenciranim celične linije, MKN28 (sl. 1A).

Da bi ugotovili, ali sovpada tudi stopnja miR-149 z diferenciacije stopnjo tumorjev smo preučili izražanje miR-149 v 44 kliničnih vzorcih človeških GC, vključno s 13 slabo, 16 zmerno in 15 dobro diferencirane vzorcev. Ugotovili smo, da je izražanje miR-149 v želodčnih tumorjev izjemno nižje kot izravnanih običajnih sosednjih tkiv (sl. 1B). Poleg tega je izraz miR-149 v bolj diferenciranih tumorjih višja kot v manj diferenciranih tumorjih (slika 1C, F = 65,391, p
. ≪ 0,001). Poleg tega se je zmanjšala izražanje miR-149 povezana z bezgavkah metastaze (* p
= 0,046) in faza TNM (** p
= 0,0011) (tabela 1).

zunajmaternična izraz miR-149 zavira proliferacijo in inducira G0 /G1 primejo v letnem pregledu rasti in SGC7901 celice

Da bi raziskali vlogo miR-149 v GC celicah, izkoriščen smo slabo in zmerno diferencirane GC celične linije, AGS in SGC7901 oz. AGS in SGC7901 celice so bile prehodno transfekciji s eithermature miR-149 posnema, inhibitor, mock transfekcije, ali miR-NC. Kot je prikazano na sliki 2A, 2D, kvantitativni rezultati RT-PCR kažejo, da ekspresija miR-149 posnema ali zaviralci znatno upregulate ali upocasnjujejo ekspresije miR-149, in sicer v AGS in SGC7901 celic od prvega do petega dan posttransfection (sl . 2A, F = 8,429, p
= 0,003;.. fig 2D, F = 8,595, p
= 0,003) v primerjavi z NC in modelnih nadzora

AGS in SGC7901 celice transficirane z miR-149 posnema in inhibitorjev so pokazale znatno nižje in višje stopnje proliferacije celic, oziroma kot NC ali modelnih skupin, kot je določeno z MTT testom (slika 2B, F = 27.47, p. < 0.001;. sl 2E, F = 44,061, p < 0,001). Transfekciji za AGS in SGC7901 celice z miR-149 posnema posledico znatno G1 fazo prijetje v primerjavi z NC in modelnih kontrole ( p
< 0,05). Poleg tega je zdravljenje z 149 MIR zaviralcev privedla do manj AGS in SGC7901 celic v G1 prijetje v primerjavi z NC in modelnih nadzora ( p
< 0,05). (Slika 2C, F = 134,177, p
< 0,001;.. Slika 2F, F = 58,792, p
= 0,003)

ZBTB2
je cilj MIR-149

Prejšnji podatki kažejo, da lahko miR-149 supresor rasti GC celic z usmerjanjem genov, ki kontrolirajo proliferacijo in potek celičnega ciklusa (33-34) (38). Tako smo iskali dodatnih potencialnih tarč Mir-149 iz baze podatkov TargetScanHuman. Identificirali smo številne potencialne miR-149 ciljnih genov, vključno s ZBTB2
A POK družina transkripcijski faktor in močan represivni v ARF-HDM2-p53-p21 poti (41). ZBTB2
je bilo ugotovljeno, da so domnevni miR-149 veznih mest na njenem 3'UTR (sl. 3A). Luciferazne reporter analize so bile izvedene, da se preveri, ali ZBTB2
je neposreden cilj miR-149 z uporabo AGS in SGC7901 celic. Sodelujemo transfekcije AGS in SGC7901 celice oziroma z psiCHECK-2 vektorja, ki vsebuje bodisi 3'UTR za ZBTB2 ali mutirani 3'UTR za ZBTB2 in posnema Mir-149 ali zaviralci miR-149. Divjega tipa in mutant ZBTB2-3'UTR vsebuje domnevnega vezavno mesto miR-149 smo klonirali v psiCHECK-2 vektorja dolvodno od luciferazni gen (sl. S1). Uvedba miR-149 bistveno zmanjšala luciferazno aktivnost iz reporter vektorja ZBTB2 3'UTR (slika 3B, 3C, p
. ≪ 0,001), vendar ni vplivalo na luciferazno aktivnost z mutiranim ZBTB2-3 'UTR reporter vektor. Ti podatki kažejo, da miR-149 neposredno ureja ZBTB2
raven izražanja. Nadalje ni pomembno zmanjšanje relativne luciferazne aktivnosti v celicah sočasno transfektirana z miR-149 inhibitor ali 3'UTR-ZBTB2 /psiCHECK-2 vektorja (sl. 3B-3C). To je mogoče zaradi pomanjkanja interakcije med 3'UTR ZBTB2 in endogenega miR-149, zato zmanjšala miR-149 ekspresijo ni povečala luciferazno aktivnost iz ZBTB2-3'UTR reporterskega vektor. Ti rezultati še dodatno potrjujejo, da miR-149 zatira ZBTB2 izraz z osredotočanjem na 3'-UTR za ZBTB2
mRNA.

je miR-149 in ZBTB2 izraz negativni korelaciji v GC celic in kliničnih vzorcih

Da bi še dodatno raziskati odnos med miR-149 in ZBTB2 smo opisali izražanje ZBTB2 v GC celic, ki uporabljajo metodo Western blot in GC tkivih uporabo imunohistokemično. Je bilo ugotovljeno, da imajo GC celice bistveno višji nivo ekspresije ZBTB2 kot normalne želodčni epitelijske celice GES-1 (slika 4A a-b F = 167,843 p
. ≪ 0,001). ZBTB2 izraz negativno povezana z diferenciacije stopnjo GC celic; slabo diferencirane GC tkiva je pokazala bistveno višjo raven izražanja ZBTB2 kot tudi različne GC tkiv in izravnanih normalnih želodčnega tkiva (slika S2A-B, F = 117,280, p
. < 0,001). ZBTB2
nivoji mRNA izraz se ujema s stopnjami beljakovin (slika 4b a, F = 283,355, p
. ≪ 0,001). Nadalje je izraz miR-149 in ZBTB2 obratno korelirana (sl. 4B b p
= 0,033, R = -0,908). Nato smo merili raven izražanja Mir-149 in ZBTB2
s kvantitativno RT-PCR v 5 celičnih linijah GC (MKN45, GC9811, AGS, SGC7901 in MKN28) (Sl. 4C a) in 18 GC klinični vzorce (6 slabo, 6 zmerno, in 6 ter diferencirane vzorcev) (sl. 4C b). Rezultati potrjujejo, da je raven mRNA
ZBTB2 negativno korelira z miR-149 izražanja (slika 4C A, p
= 0,033, R = -0,847;.. Slika 4C b, p
< 0,001, R = -0,908). Poleg tega AGS (sl. 4D) in SGC7901 celice (sl. 4E) transfektirali z miR-149 posnema se je občutno zmanjšala izražanje ZBTB2 na ravni proteina (panelov a-b) in mRNA (panel c) v primerjavi z modelnim ali NC celice ( p
< 0,001). Naše ugotovitve kažejo, da lahko miR-149 neposredno regulira izražanje ZBTB2
.

miR-149 zatira GC celične proliferacije in celičnega ciklusa napredovanje z usmerjanjem ZBTB2

v nadaljevanju smo potrdili, da miR-149-zavrtje orožja in indukcije ustavitev celičnega cikla v GC celicah mora biti usmerjena v ZBTB2
. ZBTB2
izraz je potrkal navzdol uporabo siRNAs v letnem pregledu rasti in SGC7901 celic. Western blot (sl. 5A, a-c) in kvantitativno analizo PCR je pokazala, da izčrpavanje ZBTB2
s siRNA transfekciji bi se lahko znatno izravnajo z miR-149 zaviralec in izrazito povečanje ZBTB2 opazili v celicah transfekciji s zaviralci miR-149 (slika 5B, p
. < 0,001). MTT test kaže, da proliferacije celic, transfektiranih s siRNA-ZBTB2 je zatreti in proliferacijo celic transficiranih z zaviralci miR-149 občutno povišale v primerjavi s celic, transfektiranih s siRNA-NC (kontrola) in siRNA-ZBTB2 + miR-149 (sl. 5C ). Poleg tega je zaviranje ZBTB2
izraz spodbuja G0 /G1 aretacijo in preprečuje aretacijo mobilni cikla G0 /G1, ki ga miR-149 zdravljenja z zaviralcem v letnem pregledu rasti in SGC7901 celic v primerjavi s kontrolnimi celicami NC inducirano (sl. 5D-5E, p
< 0,001). Naše ugotovitve kažejo, da miR-149 zavira GC celično proliferacijo in potek celičnega ciklusa z zaviranjem ZBTB2
izraz.

Uvedba miR-149 spremeni izražanje ZBTB2 in celični cikel, povezane beljakovine

ZBTB2 so poročali, da je močan represivni za ARF-HDM2-p53-p21 poti je, kar je pomembno pri regulaciji celičnega cikla (41). Da bi raziskali ureditev teh proteinov z miR-149 v GC celicah, smo transfektirali AGS in SGC7901 celice miR-149 posnema ali miR-NC in izvedli RT-PCR in western-blot analizo za ZBTB2 ciljnih genov. Kot je prikazano na sliki 6A-6B, ektopična ekspresija miR-149 zmanjša število ekspresijo ZBTB in HDM2 in upregulates izražanje ARF, p53 in p21 ( p
< 0,001). Ti podatki so skladni s funkcijo ZBTB2 v zatiranje transkripcijo ARF, p53 in p21 ter aktiviranje ekspresije HDM2 (41). Poleg tega, zunajmaternične izraz ZBTB2 ga transfekciji obrnil miR-149-posredovano zmanjšanje HDM2 izražanja in povečanja ARF, p53 in p21 izražanja v letnem pregledu rasti in SGC7901 celice (sl. 6A-B). . Zunajmaternične ZBTB2 izraz je bil potrjen v transfekcirajo letnem pregledu rasti in SGC7901 celic (slika S3, SGC7901 celice, F = 806,365, p
< 0,001; AGS celice, F = 1436,300, p
< 0,001). ARF, p53 in p21 spodbujanje potek celičnega ciklusa zato njihovo downregulation z ekspresijo miR-149 posnema pojasnjuje G0 /G1 fazi aretaciji v letnem pregledu rasti in SGC7901 celice.

Pogovor

Povečanje dokazi kažejo, da miRNAs igrajo ključno vlogo pri kancerogenosti in napredovanje raka [21]. Spremenjene vrednosti izraz Mirni so bili vpleteni v začetek in razvoj tumorjev; modulacija miRNAs, ki delujejo kot negativni regulatorji onkogeni ali tumorskih valov rezultatov pri spodbujanju raka celično proliferacijo in rast [28] - [32]. Predhodne študije so pokazale, da je vloga miR-149 napredovanja različnih vrst tumorjev kontroverzna [33] - [36], [38]. Izraz vzorec in cilji miR-149 se razlikujejo po različnih vrstah tumorjev. miR-149 ekspresijo je navzdol reguliranih v nekaterih tumorjih, ki deluje kot tumorski supresorski ga ciljanje onkogenov v nekaterih rakov. Na primer, v jasni karcinoma ledvičnih celic miR-149 je navzdol reguliranih in njegovi verjetni cilji so bili opredeljeni kot KCNMA1 in Lox (35). Poleg tega je miR-149 navzdol reguliranih tudi glioblastoma celicah in je predlagal, da deluje kot tumorski supresorski z usmerjanjem RAP1B, CD47, CCN1 in NXF1 [36]. V nasprotju s tem pa lahko miR-149 deluje tudi kot tumorski supresorski ga ciljanje določene onkogenov. Odkrivanje miRNA izraznih profilov v različnih kliničnih fazah nazofaringealnega karcinoma (NPC) in NPC bezgavkah metastaze kaže, da je izraz miR-149 povečana pri NPC in izražanje svojega ciljnega gena, Smad2
, se zmanjša z napredovanje NPC [38]. Podobno onkogeni vloga miR-149 se je pokazalo tudi pri melanomu, v kateri Povecanje miR-149 povzroča downregulation za GSK3-a in uravnavanjem MCL-1, zaradi česar apoptoze odpornosti [34]. Doslej je le malo znanega o vlogi miR-149 raka želodca. Tu poročajo, da je miR-149 izraz izredno zmanjšala v več želodčnih raka celičnih linij in kliničnih vzorcev v primerjavi z običajnim želodca epitelijske celice in izravnanih sosednjih normalnih tkivih oz. Pomembneje pa je stopnja miR-149 ekspresijo povezana z diferenciacije stopnjo GC celic in osebkov; slabo diferencirane GC celice ali osebki imajo nižjo miR-149 izraza v primerjavi z dobro diferenciranimi vzorcev. Zunajmaternična izraz miR-149 zavira celice orožja in potek celičnega ciklusa z usmerjanjem ZBTB2
v letnem pregledu rasti in SGC7901 celic. miR-149 in ZBTB2 izraz so negativno povezana v GC celic in kliničnih vzorcev, in čezmernim miR-149 povzroča downregulation za ZBTB2
. Izčrpavanje ZBTB2 rezultatov na inhibicijo AGS in SGC7901 celic orožja in napredovanju celičnega ciklusa. Skupaj, ti rezultati kažejo, prvič, da ZBTB2 lahko delujejo kot onkogen v tumorigeneze raka želodca.

Naši podatki kažejo, da uvedba miR-149 v GC celice inducira aretacijo celičnega cikla, kar kaže, da miR-149 tarče lahko vpleten v uredbi celičnega cikla. ZBTB2 je POK družina transkripcijski dejavnik, ki lahko zavre ARF-HDM2-p53-p21 poti v [41]. ARF, tumor supresor [42], jih lahko povzročijo trajno mitogeni stimulaciji in igra ključno vlogo pri aktiviranju p53 neodvisno in nadzor stabilnosti p53 skozi interakcijo z HDM2 [43], ki je pomemben regulator p53. zaviralnih p53 igra ključno vlogo pri vzdrževanju celične homeostaze preko indukcijskega ustavitev celičnega cikla in apoptozo, ko so celice izpostavljene dejavnikom stresa, kot so hipoksija, poškodbe DNK in telomere disfunkcija [44]. p21, ciljni gen p53, posreduje celičnega ciklusa G1 fazo aretacija z vezavo in inhibira aktivnost ciklin-CDK2 ali kompleksov CDK1 [45]. ZBTB2 lahko zatirajo transkripcijo ARF, p53 in p21 in povzroči HDM2 izraz [41]. Za potrditev, ali se učinki celičnega ciklusa, ki ga miR-149 izražanja inducirane posreduje ZBTB2 izgubo, smo preučili izražanje HDM2, ARF, p53 in p21 za AGS in SGC7901 celic transfekciji z miR-149 posnema. Ugotovili smo, da ektopična ekspresija miR-149 rezultati povečano ekspresijo ARF, p53 in p21 ter zmanjšano ekspresijo HDM2 in ZBTB2. Ti rezultati podpirajo idejo, da miR-149 izvaja svojo vlogo zaviranjem GC celice orožja in potek celičnega ciklusa z usmerjanjem ZBTB2
tako modulacijo izražanje nadaljnjih regulatorji napredovanju celičnega ciklusa.

V povzetku naši podatki kažejo, da lahko miR-149 deluje kot supresorski tumorja v želodcu rakavih celic in igra pomembno vlogo pri zaviranju ZBTB2
. Zato downregulation miR-149 pospešuje celično proliferacijo GC in potek celičnega ciklusa. Še več, naši rezultati kažejo, da lahko ZBTB2 delujejo kot onkogen pri razvoju raka želodca. Vendar pa glede na dejstvo, da lahko vsaka miRNA uravnavajo številne ciljne gene, ki lahko vplivajo na rakotvornost na različne načine, je potrebnih več študij za preiskovanje drugih miR-149 ciljev, ki imajo lahko resne vloge v GC tumorigeneze. Pričujoči študiji zagotavlja tudi nov vpogled v vlogi miR-149 v človeške želodčne napredovanje raka, in navaja, da lahko miR-149 služi kot terapevtsko tarčo za zdravljenje raka želodca.

Materiali in metode

etika Izjava

Za vzorce tkiva, pisno privolitev je bila pridobljena iz bolnikov. Postopki, ki se uporabljajo v tej študiji je odobril revizijski odbor institucionalne četrtega vojaške Medical University in je skladna s Helsinške deklaracije, in z zakonodajo.

Celične linije in Kultura vpliva

želodca rak linije AGS so MKN28, MKN45 kupil od AGCC in so GC9811 in SGC7901 celičnih linij, pridobljenih iz Pekinga Onkološkem inštitutu. Vse celične linije se je ohranila v našem zavodu v skladu s priporočenimi protokolov. Celice smo kultivirali v RPMI-1640 medij (Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA), dopolnjenem z 10% fetalnega govejega seruma (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), pri 37 ° C v 5% CO _{2 inkubatorju .}

Človeški primerki

Vsi eksperimentalni postopke je odobril revizijski odbor institucionalne četrtega vojaške Medical University. Pisna privolitev je bila pridobljena vseh bolnikov samples.Human rakom želodca vzorcev (n = 44) in izravnanih sosednjih non-tumorskih vzorcev so bili pridobljeni pri bolnikih v bolnišnici Xijing za bolezni prebavil, je četrti vojaški Medical University, z informirano soglasje iz vsakega bolnika.

Čiščenje RNA, sinteza cDNA in kvantitativni PCR v realnem času (QRT-PCR)

Total RNA kultiviranih celic smo ekstrahirali z TRIzola reagentom (Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA) v skladu z protokol in RNA proizvajalca smo hranili pri -80 ° C pred analizo QRT-PCR. Mature miR-149 izraz je bila odkrita s pomočjo TM QRT PCR-Mirna Detection Kit za mirVana (Ambion Inc. Austin, Texas), z U6 kot notranje kontrole. ZBTB2 ekspresijo detektiramo z primerji F: 5'ACTCGGGCGAGATCCACGGC 3 ', R: 5' ACGCAGGCTGCTCATCGGAG 3 'in GAPDH smo uporabili kot notranje kontrole. PCR produkti so bili ločeni na etidijevim bromidom obarvanih 1,5% agaroznem gelu in vizualizirali z UV.

Cell transfekciji

Človeško miR-149 duplex posnemajo in inhibitor (miR-149) in negativni kontrolni oligonukleotid duplex posnemajo (miR-NC) so bili oblikovani in zagotavljajo Ribobio (Guangzhou, Guangdong, Kitajska). Majhen motečih RNA (siRNA) za ZBTB2 in negativni kontrolni RNA The (siRNA-NC) smo sintetizirali in očistili s Genepharma (Shanghai, Kitajska). miRNAs, siRNAs in ZBTB2 cDNA plazmid (FulenGen Co. Kitajska) transfektirali z LipofectamineTM 2000 reagenta (Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA) v skladu s protokolom proizvajalca. ZBTB2 siRNA zaporedje: F: 5 'GCUGGCUUCUUUCCAAGUU dTdT 3', R: 5 'AACUUGGAAAGAAGCCAGC 3'; NC siRNA zaporedje: F: 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT -3 ", R: 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT -3"

miRNA ciljna napoved

Da bi našli morebitne MIRNA ciljnih genov, TargetScanHuman spletne strani (. http://www.targetscan.org/) je bil uporabljen, je vezava prosta energija je bila izračunana in podajanje ponudb mesta smo analizirali z http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid~~HEAD=dobj spletne strani.

Vector konstrukti in luciferaza reporterski vsebnosti

za izdelavo ZBTB2-3'UTR plazmida, divje tip 3'-UTR fragment humanega ZBTB2 mRNA (1238-1244 nt, Genbank dostopovna št. NM_020861.1) vsebuje domnevni miR-7 vezave zaporedje smo pomnožili z RT-PCR in kloniramo v mesto med Xho I in ne bom dolvodno od luciferazno reporterskega gena vektorja psiCHECK ™ (Promega, ZDA). Mutant enotnega miR-7 vezavno mesto (5'GAGCCAG-3 'to 5'ACCGCGC-3) v 3' UTR za ZBTB2 bil vključen s strani-usmerjeno mutagenezo Kit (SBS GENETECH, Peking, Kitajska ). Wild in mutant vrste pmirGLO-ZBTB2-UTR vektorjev so potrdili zaporedja DNK

nukleotidnih zaporedij primerji za ZBTB2-3'UTR (MT) klon:. MutZBTB2F: 5'GGCCTCACAAGACAAAACAGACCGCGCAAGTAAGGACTGAAGGAGAA 3 'mutZBTB2R: 5' TTCTCCTTCAGTCCTTACTTGCGCGGTCTGTTTTGTCTTGTGAGGCC 3 '

nukleotidnih zaporedij primerji za ZBTB2-3'UTR (WT) klon: ZBTB2XhoIF: 5'CCGCTCGAG ATGTCACTTATCTTTTTAAAAAACTCTCA 3' ZBTB2NotIR: 5'ATAAGAATGCGGCCGC TACTCATTTAATTAAACGTTTATTC 3 'ZBTB2XhoIF2: 5'CCGCTCGAGATGTCACTTATCTTTTTAAAAAACTCTCATTTTTACAAAGACTATC 3' ZBTB2F3: 5'CCGCTCGAG CTGTAGTTCTCCATGGCATGATAC 3 '.

Celice so transfekciji s mIR-149 posnema, NC in pmirGLO plazmida v ploščah s 24 vdolbinami z uporabo Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen), v skladu z navodili. 48 ur kasneje smo celice poberemo in analizirajo za luciferazno aktivnost z Dual-luciferazno Reporter preskusnega sistema (Promega, ZDA) in zazna sistem za odkrivanje GloMaxTM 20/20 (E5331, Promega).

Western blot

Skupna količina beljakovin iz kultiviranih celic smo lizirali z Lysis Buffer vsebuje PMSF na ledu. Nato smo proteinski elektroforezi skozi 12% SDS poliakrilamidnih gelih in jih nato prenesemo v PVDF membrano (Millipore). Membrane smo blokirali s 5% nemastnega mleka v prahu, pri sobni temperaturi 1 h in inkubiramo preko noči s primarnimi protitelesi. Membrane smo inkubirali s sekundarnimi protitelesi označena s HO 1 uro pri sobni temperaturi po treh 10 min opere v TBS-T (triethanolaminebuffered solna raztopina s Tween). Končno so zaznali signale s pomočjo ECL komplet (Pierce Biotech., Rockford, IL, ZDA) in membrane so skenirani in analizirali z Bio-Rad ChemiDoc XRS sistem + slikanje s programsko opremo za slikanje (različica količina 1). Izraz protein smo normalizirali na endogeni referenco (aktin) in glede na kontrolo. Spectra multicolor široko paleto protein lestev (Fermentas) je bil uporabljen kot molekulskega označevalca. Vse protitelesa, ki se uporabljajo v zahodni blot testu so navedene v tabeli S1.

Imunohistokemija in Imunohistokemijsko sedaj

Parafinski profili, 4-um debeline, so spekli 2 uri pri 65 ° C in deparaffinized . Antigen Preiskovalna smo izvedli z uporabo citratnega pufra natrijev (pH 7,2) pri 95 ° C 15 minut in nato smo drsi ohladimo pri sobni temperaturi 30 minut. Potem se zdravijo s 3% vodikovega peroksida na 15 minut, da blokira endogenega peroksidazo, so odseki obdelamo z običajnimi kozji serum neprepustni tekočino za 30 minut za zmanjšanje nespecifične vezave in nato zajec poliklonski anti-ZBTB2 (1:500, Bioss Co. . Kitajska) je bil inkubiran odseke 12 ur pri 4 ° C.After Ponovno segrevanje 1 uro in pranje za 5-krat, smo sekcije inkubirali s sekundarnim protitelesom 30 minut pri sobni temperaturi. Diaminobenzidine (DAB) smo uporabili za barvne reakcije. Kasnejše Imunohistokemijsko je dosegel kot je opisano prej [46].

MTT test

Celice so transfekciji s 100 nM miR-149 inhibitor (Genepharma, Šanghaj, Kitajska), posnema (Ribobio, Guangzhou, guangdong, Kitajska) ali 100 nM siRNA ZBTB2 (Genepharma) .Twenty štiri kasneje, celice smo zasejali v 96-vdolbinami (2 x 103 /jamico). Sposobnost preživetja celic, so bile pregledane z MTT (3-2, 5-difenil tetrazolijevega bromida) testom (Sigma, ZDA) na dan 6 dni.

Celični ciklus test s pretočno citometrijo

rak želodca celične linije, AGS in SGC7901 gojimo v RPMI-1640 medij (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), dopolnjenem z 10% FBS v 6 vdolbinami. Transfekciji smo izvedli, ko celice dosegle 80 %% - 90% konfluentne rasti. Nato požanjemo celice izperemo dvakrat z uporabo PBS in fiksna v 70% etanolu pri 4 ° C preko noči. Nato smo celice inkubirali z propidijevim jodidom pri sobni temperaturi 1 h in so bili analizirani s pretočno citometrijo z uporabo FACSCAN pretočnega citometra (BD Biosciences, Mountain View, CA). Ti podatki so bili analizirani s pomočjo Flowjo (Flowjo).

Statistična analiza

Podatki so izražene kot povprečje ± SEM treh neodvisnih poskusov. Za statistične teste, SPSS statistični programski paket, version17.0 (SPSS, Chicago, IL, ZDA) je bila uporabljena. V t-test, ANOVA in dvosmerni test enosmerna ANOVA so bile izvedene MTT teste, kvantitativno PCR in rast tumorja krivulje. Korelacija med miR-149 in ZBTB2 smo analizirali z Spearmanu rang korelacije. P vrednosti < 0,05, so bile obravnavane statistično značilno

Podpora Informacije
sliki S1..
Wild tipa in mutant ZBTB2
-3'UTR vsebuje domnevnega vezavno mesto Mira-149 so klonirali v psiCHECK-2 vektorja. A. ZBTB2
-3'UTR smo pomnožili iz genomske DNK AGS. B. Lane 1,3, 5: rekombinantne plazmide s ZBTB2-1, ZBTB2-2, ZBTB2-3
zaporedju; lane 2,4,6: Rezultati encimsko prebavo rekombinantnih plazmidov ZBTB2-1, ZBTB2-2, ZBTB2-3
oz. Rezultati so pokazali, da je ZBTB2
-1/2/3 so uspešno vstavili v vektorjev (M1. DL2000 DNK Marker; M2: DL1 kb DNA Marker; ZTBT2-1 /2/3 razredi: 1406 bp; vektorji trakovi: 6.1 Kb). C. M1: 1 kb DNA Ladder Marker. Lane 1: ojačanje Mut ZBTB2
F1 /R1 (negativna kontrola brez Taq encima); Lane 2: ojačanje Mut ZBTB2
F1 /R1. Eden pas Mut ZBTB2
(7,6 Kb) dokazano uspešno PCR mutant ojačanja. D. Rezultati sekvenciranje wt- ZBTB2
in MT - ZBTB2
doi:. 10,1371 /journal.pone.0041693.s001
(IOD)
Slika S2 .
ZBTB2 izraz v človeške želodčne vzorcih raka in izravnanih sosednjih normalnih tkivih. A. Reprezentativni slike so prikazane pozitivne Imunohistokemijsko od ZBTB2 v človeških želodčnih vzorcih raka (b-c) in izravnanih sosednjih normalnih tkiv (a) (povečava 200 x). B. Imunohistokemijsko je dosegel kot je opisano predhodno [46]; Statistična analiza podatkov o razliki v ZBTB2 izraz med človeškimi želodca vzorcih raka in izravnanih sosednjih non-rakastih tkiv (One-Way ANOVA analize, F = 117,280, *** p
< 0,001).

• Plos ONE: CYP2E1 RSAI /PstI polimorfizem in želodca Rak dovzetnosti: Meta-analize je na podlagi 24. Case-Control študije
• Plos ONE: genetsko predispozicijo Elementi, na genov, ki sodelujejo v steroidnega hormona biosintezo pot in Progesteron Receptor za Rak želodca Risk