Plos ONE: roman Proteomika-Based Klinična diagnostika Tehnologija Prepozna Heterogenost v aktiviranih signalnih poti v želodčnih rakov

Povzetek

Namen

Cilj te raziskave je bil, da se uporabi na osnovi proteinomike Collaborative Enzyme Enhanced Reactive (CEER) imunološki raziskati protein tirozin phosphorylations kot diagnostičnih označevalcev v želodcu raka (GK ).

oblikovanja poskusov

Beljakovinski lizati iz sveže zamrznjene 434 sodobnih odrskih GK smo analizirali fosforilacije HER1, HER2, p95HER2, HER3 cMet, IGF1R in PI3K. Vzorci aktivacijo procesi so bile ločene osnovi HER2 statusa tumorja. Hierarhično grozdenje je bila uporabljena za določitev poti, coactivations v GK. Prognostični vrednosti izpostavitve vzorcev aktiviranje je bila določena s korelacijo brez bolezni časa preživetja različnih GC podskupin z uporabo Kaplan-Meier analizo preživetja. CEER je bila uporabljena tudi za ugotavljanje prisotnosti tirozina fosforilirajo signalnih kaskad v obtoku tumorske celice (CTCs) in ascites tumorske celice (ATC).

Rezultati

z uporabo nove diagnostične imunski a, CEER smo dokazana prisotnost p95HER2 in sočasno aktivira signalne poti v GC tumorskih tkivih, CTCs in ATC izolirali iz bolnikov GC prvič. p95HER2 je izražena v ~77% od HER2 (+) GK. Približno 54% GK ima aktiviran HER1, HER2, HER3 cMet ali IGF1R in pokazati slabšo prognozo kot tiste, kjer so ti receptorji tirozinkinaze (RTK) ni aktivirana. Hierarhična kopičenje RTK razkriva sodelovanje povezovanje fosforiliranega HER1: cMet, HER2: HER3 in IGF1R-PI3K. Coactivation od HER1 z cMet ometi GCS s preživetjem krajši brez bolezni, v primerjavi s samo cMet aktivira GCS.

Sklepi

Naša raziskava kaže uporabnost novega spremljevalca diagnostiko tehnologije, CEER, ki ima močne posledice za razvoj zdravil in terapevtsko spremljanje. CEER se uporabljajo za zagotavljanje večje razumevanje aktiviranih signalnih poti v naprednih GK, ki lahko bistveno izboljšajo njihovo klinično upravljanje z natančno izbiro bolnikov za ciljno terapij

Navedba. Lee J, Kim S, Kim P, Liu X, lee T Kim KM et al. (2013), roman Proteomika-Based Klinična diagnostika Technology Prepozna Heterogenost v aktiviranih signalnih poti želodčnega raka. PLoS ONE 8 (1): e54644. doi: 10,1371 /journal.pone.0054644

Urednik: Anthony W. I. Lo, kitajski University of Hong Kong, Hong Kong

Prejeto: 20. september 2012; Sprejeto: 13. december, 2012; Objavljeno: 25. januar 2013

Copyright: © 2013 Lee et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. Avtorji nimajo podpore ali sredstva za sporočanje

nasprotujočimi si interesi. Medtem ko PK, XL, TL, NH, GH, AK, AJ, GM, GL in SS zaposlen Prometej Laboratories, to ne spremeni avtorjev upoštevanje vseh PLoS ONE politike o izmenjavi podatkov in materialov.

Uvod

molekularno ciljno agenti pospešila področje onkologije. Glede na to, da je približno polovica komponente tirozin kinaze človeškega kinome vpletena v človeških rakih, ni presenetljivo, da je bil velik delež tekočih terapij ciljajo različne kinaz [1], [2]. Coactivation sprejemnik tirozin kinaz (RTK), so opazili v podskupinah več rakavih obolenj, kot so glioblastoma multiforme [3], raka dojke [2], [4] [5] [6] [7], pljučnega raka [8 ], [9], rak glave in vratu [7] in rak želodca [4], [5] [6], tako implicating jim je to potrebno za napredovanje tumorja in preživetje. Te ugotovitve dovolj klinična utemeljitev za presejalne aktiviranih RTK primerov raka, ki bi lahko nato vodijo terapevtsko ciljanje in potencialno zagotavljajo znanje za racionalno kombinatoričnih terapevtskih strategij. Vendar le analiziranje stanja ekspresije ali aktiviranja enega samega RTK, da je lahko specifična tarčni protein za določen terapevtske ne zadošča za izbiro bolnikov, kot je pogosto krat pacienti ne odzovejo na terapij kljub izražanja tarče. Več morebitna vprašanja bi lahko bil odgovoren za takšno pomanjkanje terapevtske koristi od ciljnih dejavnikov, npr 1) sočasno aktiviranje vzporednih ali nadomestnih poti, ki obide prvotno ciljno beljakovino (e), in 2) neprekinjeno spremembe v molekularni in patoloških značilnosti neoplastićnih tkiva pri napredovanju raka. Zato bi bilo idealno, da imajo spremljevalno diagnostično orodje, ki se lahko uporablja v omejenih količinah kliničnih vzorcev, da zajame celovito kompleksnost fosforiliranih signalnih mrež v tumorska tkiva poleg neposrednega cilja RTK beljakovin za spremljanje "razvijajoče" bolezen .

Ciljno analizo fosforilacije kliničnih vzorcev je oviran zaradi pomanjkanja zlahka uporabnih kliničnih testih, ki so dovolj občutljivi za delovanje na omejenih količinah kliničnih tkiv. prej smo poročali razvoj nove, ki temeljijo na bližino imuno, Collaborative encimov Okrepljeno reaktivni-imunskim testom (CEER; Slika S1) [6], ki je primerna za analizo tako skupno izražanje in stanje aktivacije signalnih proteinskih kaskad. CEER se lahko izvede v multipleksirani način neposredno na kliničnih vzorcih, ki so lahko na voljo v omejenih količinah. CEER test uporablja nastanek edinstven imunski kompleks zahteva sodelovanje lokalizacije dveh detektorskih encimov konjugiranih protiteles, ko so bile ciljne beljakovine ujeli na mikromrež. Ta oblika omogoča učinkovito in občutljivo detekcijo RTK kot tudi poti, beljakovine z nadaljnjim navzdol na celični ravni (občutljivostjo približno 100 zeptomoles). V tej študiji smo uporabili CEER testa za študij signalne poti kompleksnost v želodcu raka (GC) s.

GK so vodilni vzrok smrti zaradi raka po vsem svetu z incidenco 18,9 /100.000 primerov na leto in umrljivosti stopnja 14,7 /100.000 na leto [10] in so najpogostejši malignom v Koreji [11]. Metastatskega GC vedno terapevtski izziv za medicinske onkologi zaradi slabo prognozo. Trenutno trastuzumab je edina aktivna usmerjeno sredstvo, ki se je izkazala za učinkovito pri GC v randomiziranem preskušanju faze III [12]. Medtem ko je aktivacija več RTK poročali v GK, njihov vpliv na GC prognoze ni znan. To je pomembno za razvoj in uporabo terapij za klinično obravnavo GK.

V tej raziskavi smo uporabili multipleksiranih CEER platformo za določitev vrednosti aktiviranih RTK (HER1, HER2, okrnjenih različic HER2, tj p95HER2, HER3 cMet, PI3K in IGF1R) v 434 sveže zamrznjene GC tkiv in poskušal za kategorizacijo bolnikov GC v potencialne podskupine na podlagi njihovih proteinskih vzorcev aktivacije pot. Opazili smo več signalov beljakovin aktiviranja v podskupinah GC tumorjev, ki so povezane s preživetjem brez bolezni (DFS) pri teh bolnikih. Zato smo hipotezo, da lahko odvečna procesi aktivacije vhodi vodijo do preostalega nižji stopnji signalizacijo v GK, s čimer se zmanjša učinkovitost anti-tumorskih monoterapijah usmerjenih proti posameznih RTK. Nazadnje smo razvili potencialno močan metodologijo, ki bi lahko omogočila zdravnikom spremljati osnovne in razvijajoče se spremembe v tumorskih profilov aktiviranje RTK tekom zdravljenja z uporabo krožijo tumorske celice (CTCs) in malignih celic, izoliranih iz peritonealne tekočine (ascites tumorskih celic ali ATC ). Skupaj, naša študija zagotavlja dokaze za sočasno aktiviranje RTK v GC človeških tkiv poleg vzpostavljanja CEER kot učinkovito klinično orodje za diagnosticiranje in spremljanje aktivacije RTK med zdravljenjem GC ali napredovanje bolezni.

Materiali in metode

Bolnik kohorte in tkiv Vzorec naročila

študija je bila izvedena po odobritvi Samsung Medical Center Institutional Review Board (SMC IRB) za odvzem informirano soglasje s pomočjo arhivskih tkiv s retrospektivnih kliničnih podatkov. Osnovni vzorci tumor so bili vsi zbrani iz Samsung Medical Center. Vsi bolniki doživel želodca z radikalno bezgavk seciranje s kurativno nameri. Od marca 2001 do februarja 2005, je bilo 447 sveže zamrznjene tkiva, pridobljena iz 434 bolnikov, zbranih iz kirurško odstranjenimi primarnih želodčnih tumorjev in so na voljo za končno analizo. Vse sveže zamrznjene tkiva zberemo (znotraj < 30 minut) pri kirurškem področju in takoj smo hitro zmrznili in shranimo v tekočem dušiku, dokler kasnejšo uporabo. Tumorske vzorce smo potrdili prisotnost > 70% površine tumorja, ki jih patolog. Za analizo smo pripravili majhne koščke zamrznjenega tkiva (10 mikrometrov oddelek X 3) s pomočjo prechilled britvico in raztaplja v 100 ml liznega pufra. Nastale lizati smo hranili pri -80 ° C do poznejše analize

histopatologijo Pregled in HER2 določitev statusa

Vse razpoložljive H &. So E-obarvajo drsi centralno pregleda z dvema patologi (ID, KKM ) na eksperimentalno patologijo jedro Samsung Cancer Research Institute. Vse tumor vzorci so bili iz kirurško odstranjenimi primarnih želodčnih tumorjev. Status HER2 smo določili z imunohistokemijo in FISH. IHC Analiza je bila izvedena s pomočjo HercepTest ™ (Dako, Glostrup, Danska). HER2 stopnje izraženosti beljakovin smo ocenili kot 0 do 3+, v skladu s priporočili soglasje plošči na HER2 točkovanja za GC [13], [14]. Za ribe, je bil uporabljen PathVysion HER2 DNA kit sonda (Abbott, Des Plaines, IL). Ariol sistem za analizo slike smo uporabili za štetje hibridizacije signale (Genetix, San Jose, ZDA). Vsi vzorci z razmerji HER2 /CEP17 med 1.8 in 2.2 so ročno dosegel s štetjem več kot 60 celic ne prekrivajo. Razmerja > 2.2, 1.8 do 2.2, ali < 1.8 so razvrščene kot pozitiven, dvoumen, ali negativen za ojačanje oz. Kromosomske 17 polysomy je bila opredeljena kot CEP17 signala, ki je imel več kot šest kopij v povprečju na celico. Od 447 vzorcev, so bili 434 vzorci vključeni v končni fazi.

Collaborative Enzyme Okrepljeno Reactive imunski (CEER)

CEER diapozitivi so bili natisnjeni, inkubiranih z GC lizatov in predelano, kot je opisano prej [ ,,,0],6]. Ploščice smo skenirane na štirih nastavitev photomultiplier (PMT) dobiček povečati učinkovito dinamični razpon. Podatki so bili primerni za enačbo pet parametrov, pridobljenih v odvisnosti od koncentracije zajetje protiteles in PMT in predstavljeni v izračunanih enotah (DE).

multipleksne-mikromrež tiskanje.

Snemanje protitelesa so bile natisnjene na nitroceluloze obložene stekelca (ONCYTE®, Grace Bio-Labs) z uporabo brezkontaktne tiskalniki (Nanoplotter, GeSiM). Premer mesto je približno 175 um. Ploščice smo shranjeni v izsušen komori pri 4 ° C. Približno 500 pL za zajemanje Abs natisnjena v treh izvodih na serijskih koncentracijah redčenje z 1 mg /ml, 0,5 mg /ml in 0,25 mg /ml. Prečiščena mouse-IgG služila kot negativne kontrole. konfiguracije slide imunsko matrike so prikazani na sliki S1.

protiteles konjugacija in čiščenje.

Target specifičnih protiteles (miška monoklonska pred posebnimi epitopom na prenos signalov proteine) in ustrezne detektor encimov, oksidaza glukoze (GO) ali s hrenovo peroksidazo (HRP), so bile aktivirane z dvo-funkcionalno prečni povezovalec, sukcinimidil-4- (N-maleimidometil) cikloheksan-1-karboksilat (SMCC), in ga spojili dobimo protitelo-encim konjugatov. Konjugate smo očistili s HPLC. Aktivnost protiteles, očiščenih konjugatov, so bili določeni s konkurenčnim ELISA in encimske aktivnosti po konjugacije so odkrili po funkcionalnih testih, specifična za vsako detektor encim.

CEER testov.

Immuno-mikromrež diapozitivov smo splaknili 2X s TBST (50 mM Tris /150 mM NaCl /0,1% Tween-20, pH 7,2-7,4), blokirana s 80 u.l Whatman Blokiranje Buffer 1 uro pri sobni temperaturi, nato speremo 2x z TBST. Serijsko razredčili lizat kontrole ali vzorce v 80! Li pufra za redčenje (2% BSA /0,1% TritonX-100 /TBS, pH 7,2-7,4) dodamo k imenovanim sub-nizi za diapozitive in inkubiramo 1 uro pri sobni temperaturi. Ploščice smo spirali 4X (3 min. Vsaka) in detektorja Abs dodamo v 80 p.L reakcijskega puferja in inkubirali 2 uri pri sobni temperaturi. Po pralne diapozitive s TBST da odstranimo nevezan detektor Abs, 80 xl raztopine biotin-tyramide (5 ug /ml v 50 mM glukoze /PBS) pripravimo iz 400 ug /ml v raztopini etanola (Perkin-Elmer življenje Science) je bila dodana in inkubirana za 15 minut v temi. GO /HRP-posredovano tyramide proces ojačanje signala je bila zaključena s pranjem TBST 4X, vsake 3 minute. Lokalni nanos biotina-tyramide bil odkrit z inkubacijo s streptavidinom (SA) -Alexa647 (Invitrogen) pri 0,5 ug /ml v 2% BSA /0,1% Triton /TBS 40 minut. Po končani inkubaciji smo stekelca sprali 4X z TBST, posušimo in hrani v temi, dokler so posneli s pomočjo mikromrež skener.

Za CEER analizo podatkov, tobogani so skenirani na štirih nastavitvah PMT dobiček povečati učinkovito dinamiko območje. intenzitete signala, v ozadju korigirati bile v povprečju za lis natisnjen v treh izvodih. Več merila so bila uporabljena za filtriranje podatkov za nadaljnje analize, vključno z mejami na kraju samem stopinjah, koeficient variacije za promptnih ponovitev, in splošno pad ozadju. Za vsak test smo standardno krivuljo, ustvarjen s serijsko razredčene lizatov kontrolnih celic, pripravljenih iz celičnih linij z dobro definiranega prenos signalov proteinov. Podatki so bili primerni za enačbo pet parametrov, pridobljenih v odvisnosti od koncentracije in PMT zajemanja-protitelo. Standardno krivuljo za vsakega markiranja fit v odvisnosti od jakosti signala dnevnik, merjeno kot relativni fluorescenčno enoto (RFU) v primerjavi s koncentracijo log celičnih lizatov in sklicujemo na standardne celičnih linij. Na primer, je bila uporabljena standardna krivulja serijsko razredčene celičnih lizatov, pripravljenih iz BT474 normalizacijo HER2 izražanja in stopnjo fosforilacije v vsakem vzorcu (Slika S2). Zato, vzorec z 1 CU za HER2 izražanja ima RFU vrednostjo kot RFU vrednosti 1 standardni referenčni BT474 celico. Ker imajo referenčne celice 1~2 × 10 ^{6 HER1 in HER2 receptorjev na celico s približno 10% fosforiliranih receptorje, 1 CU predstavlja izraz 1~2 × 10 6 RTK ali 1~2 × 10 5 fosforiliranih RTK [6]. Meja detekcije vrednost (LOD) s CU je bilo ugotovljeno, da je manj kot 1 CU tako izražanja in aktiviranje HER2. Posamezne napovedi iz vsake razredčitve in dobička so se v povprečju v enem samem, končno napoved.}

Okrnjen HER2 obogatitve z

Celovečerni P185-HER2 receptorji so bili izčrpani od lizatov tumorskih tkiv z uporabo magnetno-noga spetih protitelesa značilni za zunajcelično domeno (ECD) HER2, kot je prikazano na sliki S3. Nastalo P185-HER2 izčrpane lizate, ki je vsebovala obogatene prisekane receptorjev beljakovine HER2 (t-HER2) manjkajo ECD, so bili uporabljeni za naknadno kvantifikacijo t-HER2 izražanja in fosforilacije z uporabo ustreznih CEER teste. Cut off vrednost 500 CU je bila uporabljena za rezultat za p95HER2 pozitivnosti na 20 xg analiziranih tkiva. Skupno p95HER2 test odčitavanje je glede na signale, pridobljenih s standardnimi krivuljami, pridobljenih s pomočjo nadzor celični lizat je iz dojke celične linije BT474.

celične kulture in reagenti

CEER kontrolni test celične linije so MDA-MB-468, T47D, HCC827 and BT474 celice z različnimi stopnjami ErbB-RTK izražanja, pridobljen iz ATCC in gojijo pri 37 ° C v 5% CO _{2 - za MDA-MB-468 (Dulbecco je minimalna bistveno medij (DMEM) + 10% FBS), BT474 (DMEM + 10% FBS) in HCC827 in T47D (RPMI 1640 + 10% FBS, 0,2 E /ml goveji insulin). Celice so prešteti in speremo z 1 × PBS pred stimulacijo rastnega faktorja. MDA-MB-468 celice smo stimulirali s 100 nM epidermalni rastni faktor (EGF) ali preoblikuje rastnega faktorja a (TGFα) smo T47D celice stimulirali s 20 nM heregulin ß (HRGβ) ali 100 ng /ml inzulinu podoben rastni faktor-1 (IGF1) v rastni mediji brez seruma 5 ali 15 minut. Stimulirani celice izperemo z 1 x PBS in nato liziramo (liza pufer: 50 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% trition X-100 in 2 mM Na 3VO 4) in se hranijo na ledu 30 min pred sprejetjem supernatant za naslednji test ali hraniti pri -80 ° C.}

določanje CEER dvojno podajo in toplote map povezovanje

pozitivnosti za dano biomarker je bila opredeljena kot večja od tretjega kvartila za posamezno biomarker pri populaciji pacientov te študije. Bolniki so bili razvrščeni glede na CU vrednosti iz CEER testu za dano biomarker. Tisti bolniki, večja od tretje četrtine cutoff je štela za najbolj ogrožene, da so povišane koncentracije biomarkerjev in zato lahko aktivira signalne poti. Nadaljnja analiza preživetja je bila izvedena za oceno prisojevalnega kakovost teh cutoffs.

Profil biomarker vzorcev tumorjev je predstavljal toplotne zemljevidu. Vsaka celica je Colorized osnovi decila čin aktivacijo tega markerja. Vsaka označevalna so razvrščeni po decilnih razredih, ki jih izrazito senci zastopa, z lestvico, ki označuje barvo. Oboje je prikazana vrstica (bolnik) in stolpec (marker) grozdenje. Popolna povezava Algoritem je bil uporabljen za pridobitev hierarhično grozd (ali dendrogram) z zaporedno združevanje najbolj ujemajo pripombe s funkcijo hclust v raziskave, ki se imenuje, ki funkcijo heatmap.2 na voljo s gplots knjižnico statističnega okolja R: A Jezik in okolje za statistični računalništvo (http://www.r-project.org/). Podskupine označevalcev so opredeljena s povezovanjem, ki dopušča primerjavo marker profilov za bolnike.

CTC in ATC izolacija

Za oceno CTC, 7,5 ml vzorcev krvi so bili pripravljeni v 10-mililitrsko evakuirani etilendiamina tetraocetna kislina (EDTA) cevi. CellSearch sistem (Veridex) smo uporabili za imuno-magnetni CTC izolacije v skladu s protokolom prej opisali [6] pomočjo ferrofluids konjugiranih na Ab proti adhezijski molekuli epitelijske celice. Za vrednotenje ATC so celični vsebina obogaten od 50 do 100 ml ascitesa s centrifugiranjem in izolacijo imuno-magnetno tumorskih celic smo izvedli na podoben način. Več sklopov ATC so zdravili s koktajli iz rastnih faktorjev (ESPG, HRG, HGF in IGF1), z ali brez lapatiniba in PHA-665,752 kombinaciji z zaviralcem.

Rezultati in razprave

Značilnosti bolnikov

Značilnosti 434 bolnikov GC so navedeni v tabeli 1. Vsi bolniki so prejeli gastrectomies z D2 bezgavk seciranje s 242 (55,8%) bolnikov, ki so prejemali delnih vsot gastrectomies. Po AJCC 2002 sistem odrov, je bilo 86 bolnikov s patološkim fazi I, 116 je imela fazo II, 126 je bilo stadij III in 106 imela fazi IV (35 bolnikov z metastatskim M1) GC. V času analize je bilo 226 bolnikov mrtvih in 237 bolniki so dokumentirani ponovitev. 70 bolnikov je imelo raka pečatni prstan celic. Celotna 5 let in stopnje preživetja brez bolezni je bilo 52,4% in 50,0%, v tem zaporedju. Vsa primarna GC tkiva smo nabavili v času kirurgije in takoj hitro zmrznili v prihodnje molekularno analizo.

temeljijo na CEER analize pokažejo neenakomernosti HER2 izražanja in prisotnosti HER2 prisekanega variante, p95HER2 v HER2 (+) želodčni raka

prej smo poročali razvoj temelji imuno-mikromrež CEER testih [6], [15]. Uporabili smo osnovi CEER HER2 testa, da razišče status HER2 HER2 (+) in HER2 (-) vzorcev v naši GC bolnikov kohorte, ki so ločen, ki temelji na standardu IHC HercepTest /analiza FISH. Prednost testih, ki temeljijo na CEER je njihova večja občutljivost in specifičnost v primerjavi s testi, ki temeljijo na IHK [6]. Na podlagi trenutnih HER2 (+) opredelitev za GK [13], [14], kar pomeni, vzorci z rezultatom HER2-IHC od 3+ ali 2+ in pozitiven HER2
stanje pomnožitev gena, 50 od 434 (11,5%) vzorcev v naši GC bolnikov kohorte so HER2 (+), ki ga IHC HercepTest /analiza rib (tabela S1). Nasprotno, v skladu s smernicami IHC specifičnih za raka dojke, je bilo le 78% (39/50) teh bolnikov HER2 (+) (tabela S1), ki kaže na razlike v kriterijih točkovanja za HER2 pozitivnosti med raka na želodcu in na dojki. Večina HER2 (+) GK (36 od 50 vzorcev (72%)) so bile črevesne podtipa namesto razpršenih ali mešanega tipa GK v dogovoru s objavljenih poročilih [13] [16] [17].

, ki temelji na CEER HER2 testom dokazali bistveno višjo raven HER2 izražanja v IHC /FISH HER2 (+) tumorjih v primerjavi s tistimi v HER2 (-) tumorji (s povprečno vrednostjo 77,9 CU vs. 4,3 CU, vrednost p 8.18E-10), kot je prikazano na sliki 1A. HER2 podatki temeljijo na CEER je predstavljen v CU, standard funkcionalna enota, ki temelji na celični liniji krmili z znanim HER2 izražanja [6], ki omogoča primerjavo HER2 izražanja preko vzorcev. Le 32/50 ali 64% IHC /FISH HER2 (+) GK dokazali HER2 izražanje CEER in je bila visoka stopnja heterogenosti HER2 izražanja v teh vzorcev, ki jih količinskih CEER readouts razkrila. Heterogenost HER2 izražanja lahko pojasni razlog za le zmerno stopnjo soglasju (87,5%), med IHC in FISH odčitavanje HER2 v Toga sojenja [12]. Ta razlika bi neposredno vplivala na izid, ki ciljajo HER2 terapij kot trastuzumab v GK. Poleg tega je zaradi visoke občutljivosti CEER testu je bilo ugotovljeno, da ~20% od IHC /FISH HER2 (-) GK še izrazil skupno HER2 čeprav na izrazito nižji ravni kot v HER2 (+) prebivalstva bolnik
.

s p95HER2 Preskusno platformo temelji CEER so še posebej zaznali okrnjenih oblike HER2, poleg polne dolžine HER2, pri GK prvič. p95HER2 izraz je bil analiziran 31/50 HER2 (+) vzorcih in 27/384 HER2 (-) vzorcev), ki je pokazala močno polno dolžino HER2 izražanje CEER (slika 1B). Incidenca p95HER2 v HER2 (+) GK je ~77% (pri 24/31 vzorcev) (tabela S1). Podobno kot na polno dolžino HER2 izražanja, večina p95HER2 izražanja (79% p95HER2 izraženo v HER2 (+)) je bila odkrita v GK črevesne tipa. p95HER2 izraz so opazili tudi pri majhnem odstotku HER2 (-) GK (37% ali 10/27 vzorci), da je dokazano, polne dolžine HER2 izraz. Vendar pa je bila povprečna p95HER2 izraz v HER2 (+) GC vzorcev bistveno višja, kot pri HER2 (-) GK (5083,6 CU v HER2 (+) vs 437.0 CU v HER2 (-), p-vrednost = 1.27e-05 ). p95HER2 lahko prispeva k trastuzumab neodzivnost v GC tumorjev, kot jih ima v 70-80% od HER2 raka dojk [18]. Trastuzumab plus standardno kemoterapijo postanejo splošno odziva le 47% v HER2 (+) GCS v Toga postopkom [12], ki označuje obstoj možnih mehanizmov odpornosti proti trastuzumab in našo nesposobnost za pravilno izbiro trastuzumab odzvali. Da bi se klinično potrditev p95HER2 izraz s odpornosti trastuzumab, ki je bila sporna predvsem zaradi nedavnih nasprotujočih si ugotovitev iz študij z rakom dojke GeparQuattro [19], strog p95HER2 test izpopolnjevanje v zvezi s klinično pomembnih diagnostični test za ločitev določitev in uporaba v kliničnem okolju je potrebno. Potrditvijo p95HER2 izražanja je načrtovan v neoadjuvantno lapatinibom faze II plus kemoterapije kliničnem preskušanju pri bolnikih GC kot številne študije kažejo uporabo lapatiniba v p95HER2 (+) raka [20], [21].

Skupaj naši podatki jasno opredeliti status HER2 v GK in kazale na osnovi CEER HER2 diagnostiko v vzorcih GC bolnikov za določanje njihove točne celotno dolžino in okrnjena HER2 izraz. Razvoj takih diagnostiko bo močno vplivalo na natančno izbiro HER2 (+) GK, ki so odziv na trastuzumab in drugih ciljanje agentov HER2. prej smo poročali uporabo temeljijo na CEER HER2 diagnostiki pri bolnikih z rakom dojke [6], [15], ki so pokazali večjo občutljivost in specifičnost v primerjavi z diagnostiko na osnovi IHC.

gastrični rak dokazati sočasno aktiviranje signalnih poti

Uporabili smo CEER test direktno na vzorcih GC, da oceni prisotnost skupnih in fosforiliranih (aktiviranih) oblik več signalnih molekul, ki so znani ciljev zdravil: to so vključeni več RTK (HER1, HER2, HER3 cMet, IGF1R) in PI3K. Reprezentativni slike mnogokratnih CEER procesi-nizi iz osmih različnih vzorcev so prikazani na sliki 2A. Te slike jasno kažejo heterogenost v aktiviranih procesi podpisov, ki je razširjena v GK. Na primer, oba HER1 /HER2 so coactivated v vzorcih 1 in 6, medtem ko je le HER2 aktivira v vzorcu 2, čeprav so HER1, HER2 in cMet izražena na visoki ravni. Vzorec 5 kaže aktiviranje vseh 5 analiziranih RTK vključno PI3K za nadaljnjo predelavo in SHC poti. Naslednje poglavje opisuje signalne poti heterogenost opaženo v našem GC bolnikov kohorte, ki jih CEER testov določi.

Tumorji od 202 bolnikov (46,5%) ni imela zaznavno aktivacijo RTK testiranih v naši raziskavi. aktivacijske poti vzorce za preostanek tumorjev, kot je prikazano v analizi pot gruče (slika 2B), pogosto spreminjali z nekaterimi GK dokazuje sočasno aktiviranje več RTK kot HER2 /HER3 HER1 /2/3, HER1 /3 /cMet ali HER3 /cMet drugi pa so fosforilirajo samo na enem beljakovin. Vsebnost tumor vseh analiziranih vzorcev je bila > 70% glede na njihovo histološko preiskavo. Vendar pa je bil pan-citokeratinskim (pan-CK) izraz izrazito spremenljivka kaže heterogenost v vsebini epitelijske v GK. Na podlagi teh profilov, smo kategorizirani vzorec kohorto na 434 GC v skladu s svojimi RTK aktivacijo podpisov in statusa HER2

NJENO os v želodcu raka. (Tabela 2 & tabela S1).

Vsaj en član receptor HER osi bila aktivirana pri 41% bolnikov GC. je bila odkrita HER2 fosforilacija ne le v 50% HER2 (+) bolnikov GC, ampak tudi v ~22% HER2 (-) raka v soglasju z opazovano skupno HER2 izražanja opisanega prej. 16/25 HER2 (+) vzorcev, ki so prikazali aktivirani HER2 izrazil tudi p95HER2. Prav tako je HER3 fosforilirajo tudi višji odstotek HER2 (+) GK (36%), v primerjavi s HER2 (-) raka (~24%). Vendar fosforilirata HER1 ni imela tako prednost in je ekvivalentno aktivirana v obeh vrstah GC (26% v HER2 (+) in 25% na HER2 (-)). Poleg tega je večina HER držav aktiviran GC tumorjev (~64%) pokazala sočasno aktiviranje drugih RTK, tj, cMet ali IGF1R. Histološko, večina na HER2 (+), črevesne tip GK izrazil aktiviran HER2 (v 22/36 ali ~61%), sledi HER3 (v 13/36 ali ~36%), s skupno 36% GK črevesnih tipa izraža aktivirano HER2 pot. Na splošno je bilo aktiviranje HER2 bolj koncentrirani v črevesju tipa (55/154 ali 35,7%), v primerjavi z rakom na difuzna tipa (43/225 ali 19,1%). V nasprotju s tem pa je bila aktivirana HER1 enako upoštevati tako v črevesni tipa (38/154 ali 24,7%) in razpršeni tip (58/225 ali 25,8%) GK. Aktivirani HER3 je tudi enakovredno prisotna (29,9% in 21,8%), med obema Lauren klasifikacijskih podvrstami.

Ker je funkcija signalizacija HER-kinaze osi odvisna od aktivnega dimerizacije receptorja, smo pogledali na različnih parov HER člana coactivations. Coactivation HER2 z HER3 je imela prednost v HER2 (+) raka (13/50 ali 26%), z 7/13 HER2: HER3 aktivirane GCS brez HER1 coactivation. Približno 54% od HER2: HER3 coactivated HER2 (+) GK hkrati izraženi p95HER2. Po drugi strani, HER2 (-) GK niso dokazali prednost za vse posebne NJENO kinaze dimera paru z vsemi tremi možnimi aktiviranih dimernih pari (HER1: HER2, HER1: HER3 in HER2: HER3), izražena v ~15% vsakega od HER2 (-) vzorci. Triple aktiviranje HER1 /2/3 receptorje so opazili pri 11,1% od GK z nekoliko višjo distribucijo v HER2 (-) raka

cMet aktivirana želodčni rak (tabela 3 & Tabela S1).
.

Podobno HER1 je cMet fosforilacije enakovredno porazdeljena med HER2 (+) (22%) in HER2 (-) (~25%) GCS. Poleg tega je bila aktivirana cMet porazdelitev glede na Lauren histotype podobna med črevesju (48/154 ali 31,2%) in difuzno tipa (55/225 ali 24,4%) GK.

Večina cMet aktivirana GC vzorcev (~ 71% ali 77/108), so pokazali sočasno aktiviranje HER članov kinaze receptorja. Vsi vzorci s fosforiliranim cMet prikazati cMet
ojačanja (podatki niso prikazani). Preučevali smo raje njo osi receptorje, ki so navzkrižno pogovora z cMet poti. 77 GC vzorcev, ki kažejo na cMet coactivation s HER člana, 66 vzorcev (~86%) so bili z HER1. Na splošno preveč je cMet prednostno coactivated s HER1 (15,2%), v primerjavi z HER2 (10,1%) ali HER3 (9,7%). Te ugotovitve kažejo na možno presluh med signalnih poti cMet in HER1 v GK. Aktivacija cMet nikoli soobstajala z aktiviranim HER3 če niso bile fosforilirajo tudi HER1 in /ali HER2 v istem vzorcu. Približno 7% bolnikov GC pokazala coactivation vseh treh članov HER os receptorjev s cMet. Aktivirani cMet soobstajala z p95HER2 izražanju vzorcev v 5/24 in 1/10 HER2 (+) in HER2 (-) GCS oziroma

IGF1R aktivirani želodčni rak (Tabela 4 & tabela S1)..

Podobno aktivacijo HER3 je bila signalizacijo pot receptorja IGF1 poganja aktivna v visokem odstotku HER2 (+) GK (30%) kot HER2 (-) GK (24,7%). Poleg tega, kot je bilo ugotovljeno s fosforiliranim HER3, aktivira IGF1R je enakovredno porazdeljena med črevesju (26%) in razpršenih tipa (~24%) GK. Ta porazdelitev nas vodijo, da razišče, če je prišlo do IGF1R: HER3 coactivation v kohorti GC bolnikov. IGF1R je dejansko maksimalno coactivated s p-HER3 predvsem na HER2 (+), GK, kjer 22% ali 11/50 HER2 (+) GK pokazala IGF1R: HER3 coactivation. Vendar pa je v HER2 (-) GK, odstotek IGF1R coactivation z HER3 (v 51/384 vzorcev ali 13,8%), je bil podoben IGF1R coactivation z HER1 (v 53/384 vzorcev ali 13,3%). IGF1R: HER2 coactivation (v 45/384 vzorcev ali 11,7%), sledi blizu zadaj. Na splošno, 34/434 GC vzorci pokazali, coactivation vseh članov HER kinaze osi z IGF1R od tega 28 vzorcev dokazalo tudi cMet coactivation. Vendar cMet je redko sočasno aktivira z IGF1R v odsotnosti HER člana kinaze receptorja coactivation. Poleg tega, c-MET: IGF1R coactivations so predvsem opazili HER2 (-) GK

vzorca GC so hierarhično zbrani na podlagi njihovih temelji na decilnih aktivacijskih dvojno podajo profilov (slika 2b).. Analiza je pokazala, da cMet: HER1, HER2: HER3 in IGF1R: vzorci aktivacije PI3K so tesno povezana z cMet: HER1 cluster tvori posebno podskupino.

• Plos ONE: Izražanje AFP in stat3 je vpleten v arzenov trioksid, inducirane apoptoze in zaviranje proliferacije pri AFP-produkcijo Rak želodca Cells
• Plos ONE: Funkcionalna Promotor -308G > varianta v faktor tumorske nekroze a sklepati Gene je povezana s tveganjem in napredovanja želodčnega raka v kitajski Population