PLoS ONE: A Novel Proteomics-Based Clinical Diagnostics Technologie Identifiziert Heterogene Activated Signaling Pathways in Gastric Cancers

Abstrakt

Zweck

Das Ziel dieser Studie war es, die Proteomik-basierte Collaborative zu nutzen Enzym Verbesserte Reactive (CEER) Immunoassay-Protein-Tyrosin-Phosphorylierungen als diagnostische Marker in Magenkrebs (GCS).

Experimentelles Design

Proteinlysate von fresh-frozen 434 fortgeschrittenen Stadium GCs zu untersuchen, wurden für die Phosphorylierung analysiert von HER1, HER2, p95HER2, HER3, cMET, IGF1R und PI3K. Der Weg Aktivierungsmuster wurden basierend auf den Tumor HER2 Status getrennt. Hierarchical Clustering wurde Weg coactivations in GCs zu bestimmen, verwendet. Prognostischen Wert der Weg Aktivierungsmuster wurde durch Korrelieren des krankheitsfreien Überlebenszeiten der verschiedenen GC Untergruppen mit Kaplan-Meier-Überlebensanalyse bestimmt. CEER wurde auch die Anwesenheit von Tyrosin Signalkaskaden in zirkulierenden Tumorzellen (CTCs) und Aszites-Tumorzellen (ATCs).

Ergebnisse phosphoryliert zu bestimmen

Mit Hilfe eines neuartigen Diagnostik-Immunoassay, CEER, wir das Vorhandensein von p95HER2 und damit aktiviert Signalwege in GC Tumorgeweben zeigen, CTCs und ATCs isoliert aus GC Patienten zum ersten Mal. p95HER2 wird in ~77% von HER2 (+) GCs ausgedrückt. Ungefähr 54% der GCs haben eine aktivierte HER1, HER2, HER3, cMET oder IGF1R und zeigen eine schlechtere Prognose als solche, bei denen diese Rezeptor-Tyrosin-Kinasen (RTKs) nicht aktiviert sind. Hierarchical Clustering von RTKs zeigt Co-Clustering von phosphoryliert HER1: cMET, HER2: HER3 und IGF1 R-PI3K. Koaktivierung HER1 mit cMET macht GCs mit einer kürzeren krankheitsfreie Überleben im Vergleich zu nur cMET GCs aktiviert.

Schlussfolgerungen

Unsere Studie den Nutzen eines neuen Companion Diagnostics Technologie unterstreicht, CEER, der hat starke Auswirkungen auf die Entwicklung von Medikamenten und Therapiekontrolle. CEER wird verwendet, um ein besseres Verständnis der aktivierten Signalwege in fortgeschrittenen GCs zu schaffen, die deutlich ihre klinische Behandlung durch genaue Auswahl der Patienten für gezielte Therapeutika zu verbessern

Citation:. Lee J, Kim S, Kim P, Liu X, Lee T, Kim KM, et al. (2013) A Novel Proteomics-Based Clinical Diagnostics Technologie Identifiziert Heterogene Activated Signaling Pathways in Magenkarzinome. PLoS ONE 8 (1): e54644. doi: 10.1371 /journal.pone.0054644

Editor: Anthony W. I. Lo, der Chinese University of Hong Kong, Hong Kong

Empfangen: 20. September 2012; Akzeptiert: 13. Dezember 2012; Veröffentlicht: 25. Januar 2013

Copyright: © 2013 Lee et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Die Autoren haben keine Unterstützung oder Finanzierung zu berichten

Konkurrierende Interessen. Während PK, XL, TL, NH, GH, AK, AJ, GM, GL und SS von Prometheus Laboratories verwendet werden, diese "die Autoren nicht verändert Einhaltung aller Richtlinien PLoS ONE auf den Austausch von Daten und Materialien.

Einführung

haben molekular zielgerichtete Agenten auf dem Gebiet der Onkologie beschleunigt. Da etwa die Hälfte der Tyrosinkinase-Komponente des menschlichen Kinoms in menschlichen Krebsarten beteiligt ist, ist es nicht überraschend, dass ein großer Teil der derzeitigen Therapien zielen verschiedene Kinasen [1], [2]. Koaktivierung von Rezeptor-Tyrosin-Kinasen (RTKs) wurde in Teilmengen von mehreren Krebserkrankungen wie Glioblastom multiforme [3], Brustkrebs [2], [4], [5], [6], [7], Lungenkrebs beobachtet [8 ], [9], Kopf- und Halskrebs [7] und Magenkrebs [4], [5], [6] so bei Bedarf für die Tumorprogression und Überleben verwickelt. Diese Beobachtungen liefern eine ausreichende klinische Gründe für aktivierte RTKs in Krebs-Screening, die dann therapeutische Targeting führen könnte und bieten potenziell Wissen für rationale kombinatorische therapeutische Strategien. Jedoch Analyse einfach die Expression oder Aktivierungsstatus eines einzelnen RTK, dass die spezifische Zielprotein für einen bestimmten therapeutischen Patienten so oft unzureichend sein für die Auswahl ist Zeiten Patienten nicht auf Therapien trotz der Expression des Ziel zu reagieren. Mehrere potenzielle Probleme von gezielten Wirkstoffen, zB 1) die gleichzeitige Aktivierung von parallelen oder alternativen Wege verantwortlich für einen solchen Mangel an therapeutischen Nutzen, die die ursprünglich angestrebte Protein (e) umgehen könnte, und 2) kontinuierliche Veränderung in der molekularen und pathologischen Merkmale von Tumor Geweben während der Tumorprogression. Daher wäre es ideal, einen Begleiter diagnostisches Werkzeug zu haben, das auf begrenzte Mengen an klinischen Proben angewendet werden, um die Gesamtkomplexität von phosphoryliertem Signalisierungsnetze in dem neoplastischen Gewebe zusätzlich zu dem direkten Ziel RTK-Protein zu fangen die "entwickelt" Krankheit zu überwachen, .

Gezielte Phosphorylierung Analyse von klinischen Proben ist wegen des Fehlens von leicht nutzbare klinische Assays behindert worden, die auf die begrenzte Mengen an klinischen Gewebe empfindlich genug sind, zu funktionieren. Wir haben bereits berichtet die Entwicklung eines neuen Näherungsbasierten Immunoassay, Collaborative Enzyme Verbesserte Reactive-Immunoassay (CEER, Fig S1) [6], die für die Analyse sowohl die Gesamtexpression und Aktivierungsstatus von Protein-Signalkaskaden geeignet ist. CEER auf klinischen Proben direkt in einem gemultiplexten Art und Weise durchgeführt werden, die in begrenzten Mengen verfügbar. Der CEER Assay nutzt die Bildung einer einzigartigen Immunkomplexes erfordert die Co-Lokalisation von zwei Detektor enzymkonjugierten-Antikörper einmal die Zielproteine ​​wurden auf einem Microarray erfasst wurde. Dieses Format ermöglicht die effiziente und empfindliche Detektion von RTKs sowie die nachgelagerten Weg Proteine ​​bis auf die Ebene einzelner Zellen (eine Empfindlichkeit von etwa 100 Zeptomol). In dieser Studie haben wir die CEER-Test zur Untersuchung der Signalweg Komplexität bei Magenkrebs (GC) verwendet.

GCs sind die führende Ursache für Krebstod weltweit mit einer Inzidenz von 18,9 /100.000 Fälle pro Jahr und einer Sterblichkeit Rate von 14,7 /100.000 pro Jahr [10] und sind die häufigste maligne Erkrankung in Korea [11]. Metastasiertem GC bleibt eine therapeutische Herausforderung für die medizinische Onkologen aufgrund seiner schlechten Prognose. Derzeit ist Trastuzumab der einzige aktive gezielte Wirkstoff, der in einer randomisierten Phase-III-Studie [12] für die GC als wirksam erwiesen hat. Während Aktivierung mehrerer RTK hat in GCs, deren Auswirkungen auf die GC-Prognose berichtet, ist unbekannt. Dies ist wichtig für die Entwicklung und Anwendung von Therapeutika für die klinische Behandlung von GCs.

In dieser Studie haben wir die gemultiplexten CEER Plattform verwendet Ebenen aktiviert RTKs (HER1, HER2, trunkierte Varianten von HER2, um zu bestimmen, dh p95HER2, HER3, cMET, PI3K und IGF1 R) in 434 frisch gefrorene GC Gewebe und versucht GC Patienten in potenzielle Untergruppen Muster auf der Grundlage ihrer Protein Stoffwechselwegaktivierung zu kategorisieren. Wir haben mehrere Signalprotein Aktivierungen in Untergruppen von GC Tumoren beobachtet, die mit krankheitsfreie Überleben (DFS) bei diesen Patienten zu korrelieren. Daher theoretisieren wir, dass redundante Stoffwechselwegaktivierung Eingänge Rest nachgeschalteten Signal in GCs führen könnte, wodurch die Anti-Tumor-Wirksamkeit von Monotherapien Begrenzung gegen einzelne RTKs gezielt. Schließlich haben wir eine potentiell leistungsfähige Methode entwickelt, die Kliniker ermöglichen, Basislinie und sich entwickelnde Veränderungen in Tumor RTK Aktivierungsprofile über den Verlauf einer Behandlung unter Verwendung von zirkulierenden Tumorzellen (CTCs) und maligne Zellen von Peritonealflüssigkeit (Ascites Tumorzellen oder ATCs isoliert zu überwachen ). Zusammengenommen unsere Studie liefert den Beweis für die gleichzeitige RTK-Aktivierung in GC menschlichen Geweben neben Gründung CEER als effizientes klinisches Werkzeug zur Diagnose und Überwachung von RTK-Aktivierung während GC Behandlung oder Krankheitsprogression.

Materialien und Methoden

Patientenkohorte und Gewebeprobe Beschaffung

die Studie wurde nach Zustimmung der Samsung Medical Center Institutional Review Board (SMC IRB) für eine informierte Zustimmung Verzicht mit Archiv-Gewebe mit retrospektiven klinischen Daten durchgeführt. Die primären Tumorproben wurden alle von Samsung Medical Center gesammelt. Alle Patienten wurden Gastrektomie mit radikalen Lymphadenektomie mit kurativer Absicht. Von März 2001 bis Februar 2005 447 frisch von 434 Patienten erhalten gefrorenen Gewebe wurden aus chirurgisch entfernten primären Magentumoren gesammelt und waren für die endgültige Analyse zur Verfügung. Alle frischen gefrorenen Gewebe wurden gesammelt (in < 30 Minuten) in das Operationsfeld und wurden sofort schockgefroren und in flüssigem Stickstoff bis zur späteren Verwendung gespeichert. Tumorproben wurden auf das Vorhandensein von >bestätigt; 70% Tumorbereich durch den Pathologen. Für die Analyse wurden kleine Stücke von gefrorenem Gewebe (10 &mgr; m Abschnitt X 3) hergestellt vorgekühltem Rasierklinge und in 100 &mgr; l Lysepuffer lysiert. Die erhaltenen Lysate wurden bei -80 ° C bis zu einer späteren Analyse gespeichert

Histopathologie Kommentieren und HER2-Status Bestimmung

Alle verfügbaren H &. E-gefärbten Objektträger zentral durch zwei Pathologen (ID überprüft wurden, KKM ) an der experimentellen Pathologie Kern des Samsung Cancer Research Institute. Alle Tumorproben wurden von chirurgisch entfernten primären Tumoren des Magens. HER2-Status wurde von IHC und FISH bestimmt. IHC-Analyse wurde mit der HercepTest ™ (Dako, Glostrup, Dänemark) durchgeführt. HER2-Protein-Expressionsniveaus wurden als 0 bis 3+ erzielte, nach dem Konsens-Panel Empfehlungen auf HER2 für GC Scoring [13], [14]. Für FISH, PathVysion HER2 DNA-Sonde Kit (Abbott, Des Plaines, IL) verwendet. Ariol Bildanalysesystem wurde verwendet, um die Hybridisierungssignale (Genetix, San Jose, USA) zu zählen. Alle Proben mit Verhältnissen von HER2 /CEP17 zwischen 1,8 und 2,2 wurden manuell Tor von mehr als 60 nicht-überlappenden Zellen zu zählen. Verhältnisse von > 2,2, 1,8 bis 2,2, oder < 1,8 wurden als positiv eingestuft, zweideutig oder negativ für die Amplifikation, respectively. Chromosomale 17 Polysomie wurde als CEP17 Signal definiert, die im Durchschnitt pro Zelle mehr als sechs Kopien hatte. Von den 447 Proben, 434 Proben wurden in der letzten Analyse einbezogen.

Collaborative Enzym Verbesserte Reactive-Immunoassay (CEER)

CEER Objektträger wurden gedruckt, mit GC-Lysaten inkubiert und verarbeitet werden, wie zuvor beschrieben [ ,,,0],6]. Die Objektträger wurden bei vier Photomultiplier (PMT) Gain-Einstellungen gescannt, um die effektive Dynamikbereich zu erhöhen. Die Daten wurden an ein Fünf-Parameter-Gleichung abgeleitet als Funktion der Capture-Antikörper-Konzentration und PMT und in berechneten Einheiten (CU) dargestellt.

Multiplexed-Microarray-Druck.

Capture-Antikörper wurden gedruckt auf nitrozellulosebeschichtete Glasplättchen (ONCYTE® Grace Bio-Labs) unter Verwendung von berührungslosen Druckern (Nanoplotter, GeSiM). Der Punktdurchmesser betrug etwa 175 &mgr; m. Die Objektträger wurden in einem trockenen Kammer bei 4 ° C gehalten. Etwa 500 pL von Erfassungs Abs wurden dreifach bei Reihenverdünnungskonzentrationen von 1 mg /ml, 0,5 mg /ml und 0,25 mg /mL gedruckt. Gereinigtes Maus-IgGs dienten als negative Kontrollen. Immuno-Array Dia-Konfigurationen sind in Abbildung S1 gezeigt.

Antikörper-Konjugation und Reinigung.

Ziel-spezifischen Antikörper (monoklonaler Maus gegen spezifische Epitope auf die menschliche Signaltransduktion Proteine) und den entsprechenden Detektor Enzyme, Glucoseoxidase (GO) oder Meerrettich-Peroxidase (HRP), wurden mit bifunktionellen Vernetzers, Succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexan-1-carboxylat (SMCC) aktiviert und gekoppelte Antikörper-Enzym-Konjugate erhalten wurden. Konjugate wurden durch HPLC aufgereinigt. Antikörperaktivitäten in den gereinigten Konjugate wurden durch kompetitiven ELISA bestimmt und die post-Konjugation Enzymaktivitäten wurden durch funktionelle Assays spezifisch für jeden Detektor Enzym erkannt.

CEER-Assays.

Immuno-Microarray-Slides wurden gespült 2X mit TBST (50 mM Tris /150 mM NaCl /0,1% Tween-20, pH 7,2-7,4), blockiert mit 80 ul Whatman Blockierungspuffer für 1 Stunde bei RT, dann gewaschen mit 2X TBST. Seriell Lysat Kontrollen oder Proben verdünnt in 80 &mgr; l Verdünnungspuffer (2% BSA /0,1% Triton X-100 /TBS, pH 7,2-7,4) wurden bezeichnet Subarrays auf Objektträger gegeben und 1 Stunde bei RT inkubiert. Die Objektträger wurden 4X (3 min. Jeweils) gewaschen und Detektor Abs wurden in 80 ul Reaktionspuffer und inkubiert 2 h bei RT zugegeben. Nach dem Waschen Folien mit TBST ungebundenen Detektor Abs zu entfernen, 80 &mgr; l Biotin-Tyramid-Lösung (5 &mgr; g /ml in 50 mM Glucose /PBS), hergestellt aus 400 &mgr; g /ml in Ethanol-Lösung (Perkin-Elmer Life Science) wurde zugegeben und inkubiert, für 15 Minuten in Dunkelheit. GO /HRP-vermittelte Tyramid Signalverstärkungsverfahren wurde durch Waschen mit TBST 4X beendet, 3 min pro. Lokale Abscheidung von Biotin-Tyramid wurde durch Inkubation mit Streptavidin (SA) -Alexa647 (Invitrogen) bei 0,5 ug /ml in 2% BSA /0,1% Triton /TBS für 40 min. Nach Beendigung der Inkubation wurden die Objektträger 4X mit TBST gewaschen, getrocknet und gehalten in der Dunkelheit, bis sie über einen Microarray-Scanner abgebildet wurden.

Für CEER Datenanalyse, wurden bei vier PMT Gain-Einstellungen gescannten Dias die effektive Dynamik zu erhöhen Angebot. Hintergrund korrigierten Signalintensitäten wurden für Flecken in dreifacher Ausfertigung gedruckt gemittelt. Mehrere Kriterien wurden für weitere Analysen zum Filtern von Daten verwendet werden, einschließlich Grenzen vor Ort Fußabdrücke, Variationskoeffizient für Spot-Replikate, und die allgemeine Pad Hintergrund. Für jeden Test wurde eine Standardkurve von seriell verdünnten Steuer Zelllysaten von Zelllinien mit gut charakterisierten Signaltransduktion hergestellten Proteine ​​erzeugt. Daten wurden an ein Fünf-Parameter-Gleichung als Funktion der Erfassung-Antikörperkonzentration und PMT abgeleitet. Die Standardkurve für jeden Marker wurde als Funktion der log-Signalintensität passen, gemessen als relative Fluoreszenzeinheit (RFU) vs. log Konzentration von Zell-Lysaten und den Standardzelllinien verwiesen. So wurde beispielsweise Standardkurve von seriell verdünnten Zelllysate, hergestellt aus BT474 verwendet HER2 Expression und das Ausmaß der Phosphorylierung in jeder Probe (Abbildung S2) zu normieren. Daher hat eine Probe mit 1 CU von HER2-Expression der RFU-Wert entspricht RFU-Wert von 1 Standard-Referenz-BT474 Zelle. Als Referenzzellen haben 1~2 × 10 ^{6 HER1 oder HER2-Rezeptoren pro Zelle mit etwa 10% phosphoryliert Rezeptoren, 1 CU stellt die Expression von 1~2 × 10 6 RTKs oder 1~2 × 10 5 phosphorylierten RTKs [6]. Die Nachweisgrenze (LOD) Wert von CU war entschlossen, auf weniger als 1 CU sowohl für Expression und Aktivierung von HER2. Einzelvorhersagen aus jeder Verdünnung und Gewinn wurden in eine einzige, endgültige Vorhersage gemittelt.}

Abgeschnittene HER2 Enrichment

in voller Länge p185-HER2-Rezeptoren wurden aus Tumorgewebe Lysaten verarmt unter Verwendung von Magnetperle gekoppelten Antikörpern spezifisch für extrazelluläre Domäne (ECD) von HER2 wie in S3 gezeigt. Resultierende p185-HER2-abgereicherten Lysaten, die abgeschnitten HER2 (t-HER2) Rezeptorproteinen angereichert enthielt die ECD fehlt, wurden für die anschließende Quantifizierung von T-HER2-Expression und Phosphorylierung unter Verwendung der jeweiligen CEER-Assays verwendet. Ein Schnittwert von 500 CU verwendet wurde, für p95HER2 Positivität ein Tor pro 20 ug Gewebe analysiert. Der Gesamt p95HER2 Test Anzeige war in Bezug auf die Signale aus den Standardkurven erzeugt ein Steuer Zelllysat aus der Brustkrebs-Zelllinie BT474 erzeugt.

Zellkultur und Reagenzien

CEER-Testkontroll-Zelllinien , MDA-MB-468, T47D, mit HCC827 und BT474-Zellen Grade ErbB-RTK-Expression wurden von ATCC und gezüchtet bei 37 ° C in 5% CO erhalten _{2 variierende - für MDA-MB-468 (Dulbeccos minimal essential Medium (DMEM) + 10% FBS), BT474 (DMEM + 10% FBS) und HCC827 und T47D (RPMI 1640 + 10% FBS, 0,2 U /ml Rinderinsulin). Die Zellen wurden mit 1 × PBS vor Wachstumsfaktor Stimulation gezählt und gewaschen. MDA-MB-468-Zellen mit 100 nM epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) oder transforming growth factor a (TGFa) stimuliert wurden, wurden T47D-Zellen mit 20 nM Heregulin β (HRGβ) oder 100 ng /mL Insulin-like growth factor-1 stimuliert (IGF1) in serumfreiem Wachstumsmedium für 5 oder 15 min. Stimulierten Zellen wurden mit 1 × PBS gewaschen und anschließend lysiert (Lysepuffer: 50 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% Trition X-100 und 2 mM Na 3VO 4) und auf Eis gehalten für 30 Minuten vor den Überstand für einen nachfolgenden Test oder gehalten bei -80 ° C unter.}

CEER Marker-Bestimmung und Heatmap-Clustering

Positivität für einen bestimmten Biomarker als größer als der dritte Quartil definiert wurde für einen einzelnen Biomarkers in der Patientenpopulation dieser Studie. Die Patienten wurden auf der Grundlage der CU Wert aus dem CEER Assay für einen bestimmten biomarker rangiert. Diejenigen Patienten größer als die dritte Quartil Cutoff wurden mit dem höchsten Risiko betrachtet erhöhten Biomarker Niveaus zu haben und damit potentiell aktiviert Signalwege. Die anschließende Überlebensanalyse erfolgte die prädikative Qualität dieser Cutoffs zu beurteilen.

Das Biomarkerprofil der Tumorproben wurde durch eine Wärme Karte dargestellt. Jede Zelle wurde auf der Grundlage der Dezil Rang der Aktivierung dieser Marker koloriert. Jeder Marker wurde von Dezilen Platz, durch eine deutliche Schatten dargestellt, mit der Skala, der die Farbe. Sowohl die Reihe (Patient) und Spalte (Marker) Clustering wurde gezeigt. Der komplette Verknüpfung Algorithmus wurde verwendet, um eine hierarchische Cluster (oder dendrogram) zu erhalten, indem der Reihe nach die meisten korrelierten Beobachtungen Gruppierung der hclust Funktion in R, genannt durch die heatmap.2 Funktion, die bei der gplots Bibliothek der statistischen Umgebung R mit: eine Sprache und Umgebung für statistische Berechnungen (http://www.r-project.org/). Subgruppen von Markern wurden durch das Clustering definiert, die Vergleiche von Markerprofile für Patienten erlaubt.

CTC und ATC Isolation

Für CTC Bewertung, 7,5 ml Blutproben wurden in 10-ml evakuierten Ethylendiamin gezogen tetraessigsäure (EDTA) Röhren. Das Cellsearch-System (Veridex) wurde für immunmagnetischen CTC Isolierung verwendet gemäß dem Protokoll vorher beschrieben [6] unter Verwendung von Ferrofluiden, konjugiert an Ab gegen epithelial cell adhesion molecule. Für ATC Auswertung wurden Zellinhalt von 50 bis 100 ml Ascites-Flüssigkeit durch Zentrifugation und immuno-magnetische Tumorzellisolierung angereichert wurde in ähnlicher Weise durchgeführt. Mehrere Sätze von ATCs wurden mit Cocktails von Wachstumsfaktoren behandelt (EGF, HRG, HGF und IGF1) mit oder ohne Lapatinib und PHA-665752-Inhibitor-Kombination.

Ergebnisse und Diskussionen

Die Patientencharakteristika

Eigenschaften von 434 GC Patienten in Tabelle 1 erhielten alle Patienten zur Verfügung gestellt werden gastrectomies mit Lymphadenektomie D2 Lymphe mit 242 (55,8%) Patienten, die Wert Ihrer gastrectomies. Nach AJCC 2002 Staging-System, hatte 86 Patienten pathologische Stadium I, II hatte 116 Stadium hatte 126 Stadium III und 106 haben die Stufe IV (35 Patienten mit metastasierendem M1) GC. Zum Zeitpunkt der Analyse wurden 226 Patienten gestorben und 237 Patienten hatten Rezidiv dokumentiert. 70 Patienten hatten Zellkarzinom Siegelring. Die 5-Jahres-Gesamt-und krankheitsfreie Überlebensrate betrug 52,4% und 50,0% betragen. Alle primären GC Gewebe zum Zeitpunkt der Operation wurden beschafft und sofort für zukünftige molekulare Analyse schockgefroren.

CEER-basierte Assays zeigen Heterogenität in HER2-Expression und das Vorhandensein von HER2 verkürzte Variante, p95HER2, in HER2 (+) Magen- Krebs

Wir haben bisher die Entwicklung von Immunmicroarray-basierten Assays CEER berichtet [6], [15]. Wir nutzten die CEER-basierten HER2-Test des HER2-Status der HER2 (+) und HER2 zu untersuchen (-) Proben in unserer GC Patientenkohorte, die auf Basis von Standard IHC HercepTest /FISH-Analyse getrennt wurden. Der Vorteil CEER basierten Assays ist ihre höhere Empfindlichkeit und Spezifität, im Vergleich zu IHC-basierte Assays [6]. Basierend auf den aktuellen HER2 (+) Definitionen für GCs [13], [14], dh Proben mit einem HER2-IHC-Score von 3+ oder 2+ und einem positiven HER2
Genamplifikation Status, 50 von 434 (11,5%) Proben in unserer GC-Patientenkohorte waren HER2 (+) von IHC HercepTest /FISH-Analyse (Tabelle S1). Im Gegensatz dazu wird gemäß den Richtlinien IHC spezifisch für Brustkrebs, nur 78% (39/50) dieser Patienten waren HER2 (+) (Tabelle S1), um die Unterschiede in Bewertungskriterien für HER2-Positivität zwischen Magen und Brustkrebs hindeutet. Eine Mehrheit der HER2 (+) GCs (36 von 50 Proben (72%)) waren der Darm Subtyp eher als die diffuse oder Mischtyp GCs in Übereinstimmung mit veröffentlichten Berichten [13], [16], [17].

CEER Basis HER2 Assay demonstriert deutlich höhere HER2-Expressionsniveaus in IHC /FISH HER2 (+) Tumoren im Vergleich zu denen in der HER2 (-) Tumoren (mit einem Mittelwert von 77,9 CU vs. 4,3 CU, p-Wert 8.18E-10), wie in 1A gezeigt. Der CEER-basierte HER2 Daten in CU präsentiert wird, eine Standard-Funktionseinheit basierend auf Zelllinie steuert mit bekannten HER2-Expression [6], die einen Vergleich von HER2-Expression in Proben ermöglicht. Nur 32/50 oder 64% der IHC /FISH HER2 (+) GCs demonstriert HER2-Expression von CEER und es gab ein erhebliches Maß an Heterogenität in HER2-Expression in diesen Proben, wie durch die quantitative CEER Ablesungen ergab. Heterogene HER2-Expression kann der Grund für nur einen moderaten Grad der Übereinstimmung (87,5%) zwischen dem IHC und FISH-Ablesungen für HER2 in der ToGA-Studie [12] erklären. Diese Diskrepanz würde sich unmittelbar auf das Ergebnis der HER2-gezielte Therapeutika wie Trastuzumab in GCs. Darüber hinaus aufgrund der hohen Empfindlichkeit des CEER-Test wurde festgestellt, dass ~ 20% des IHC /FISH HER2 (-) GCs noch insgesamt HER2 wenn auch auf deutlich niedrigerem Niveau als die HER2 (+) Patientenpopulation ausgedrückt
.

mit der CEER-basierten p95HER2-Assay-Plattform, verkürzte Formen von HER2 wurden neben voller Länge HER2, in GCs zum ersten Mal speziell erkannt. (-) Proben), die einen wesentlichen voller Länge HER2 Expression durch CEER (1B) gezeigt p95HER2 Expression wurde in 31/50 HER2 (+) Proben und 27/384 HER2 analysiert. Die Inzidenz von p95HER2 in HER2 (+) GCs war ~77% (in 24/31 Proben) (Tabelle S1). Ähnlich wie in voller Länge HER2-Expression, die Mehrheit der p95HER2 Ausdruck (79% der p95HER2 in HER2 ausgedrückt (+)) wurde in Darm-Typ GCs nachgewiesen. (-) GCs (37% oder 10/27 Proben), die in voller Länge HER2-Expression zeigte p95HER2-Expression wurde auch in einem kleinen Prozentsatz von HER2 beobachtet. Allerdings war der durchschnittliche p95HER2 Ausdruck in HER2 (+) GC-Proben signifikant höher als bei HER2 beobachtet (-) GCs (5083,6 CU in HER2 (+) vs 437,0 CU in HER2 (-), p-Wert = 1.27e-05 ). p95HER2 beitragen können nicht-Ansprechempfindlichkeit in GC Tumoren Trastuzumab, wie es in 70-80% der HER2 überexprimieren Brustkrebs tut [18]. Trastuzumab plus Standard-Chemotherapie gemacht eine allgemeine Ansprechrate von nur 47% bei HER2 (+) GCs in der ToGA-Studie [12] Angabe Existenz möglicher Trastuzumab Resistenzmechanismen und unsere Unfähigkeit, Trastuzumab Responder genau zu wählen. Um klinisch p95HER2 Ausdruck mit Trastuzumab Widerstand zu validieren, die vor allem aufgrund der jüngsten widersprüchliche Ergebnisse aus den GeparQuattro Brustkrebs Studien umstritten ist [19], strenge p95HER2 Assay Verfeinerung im Hinblick auf die klinisch relevanten diagnostischen Test Cut-off-Bestimmungen und Anwendbarkeit in klinischen Umgebungen erforderlich ist. Eine Validierung von p95HER2 Ausdruck wird in einer Phase-II neoadjuvante Lapatinib plus Chemotherapie klinischen Studie bei GC Patienten geplant, wie mehrere Studien, die die Verwendung von Lapatinib in p95HER2 (+) Krebserkrankungen [20] deuten darauf hin, [21].

Insgesamt unsere Daten deutlich den HER2-Status in GCs definieren und die Nützlichkeit von CEER-basierten HER2-Diagnostik in GC Patientenproben zur Bestimmung ihrer genauen voller Länge und verkürzten HER2-Expression zeigen. Die Entwicklung einer solchen Diagnose wird stark die genaue Auswahl von HER2 (+) GCs Auswirkungen, die Responder auf Trastuzumab und anderen HER2 Targeting-Mittel sind. Wir haben bereits berichtet, die Verwendung von CEER-basierten HER2-Diagnostik bei Patientinnen mit Brustkrebs [6], [15], die eine höhere Sensitivität und Spezifität nachgewiesen, im Vergleich zu IHC-basierte Diagnostik.

Magenkrebs zeigen die gleichzeitige Aktivierung von signal~~POS=TRUNC

Wir haben die CEER Test das Vorhandensein von Gesamt- und phosphoryliert (aktiviert) Formen mehrerer signal~~POS=TRUNC, die bekannt sind drug targets direkt auf GC-Proben zu Grunde gelegt werden: Dazu gehörten mehrere RTKs (HER 1, HER2, HER3, cMET, IGF1 R) und PI3K. Repräsentative Bilder von gemultiplexten CEER Pathway-Arrays aus acht verschiedenen Proben sind in 2A gezeigt. Diese Bilder zeigen deutlich die Heterogenität in aktivierten Weg Signaturen, die weit verbreitet in GCs ist. Beispielsweise sowohl HER1 /HER2 sind in den Proben 1 und 6 coaktiviert, während HER2 nur in Probe 2 wird aktiviert, obwohl HER1, HER2 und cMET auf hohen Niveaus exprimiert werden. Probe 5 zeigt Aktivierung aller 5 analysiert RTKs einschließlich der nachgelagerten PI3K und Shc Wege. Der folgende Abschnitt den Signalweg Heterogenität in unserer GC Patienten Kohorte beschreibt, wie durch die CEER-Assays bestimmt.

Die Tumoren von 202 Patienten (46,5%) hatten keine nachweisbare Aktivierung der in unserer Studie getestet RTKs. Pathway Aktivierungsmuster für den Rest der Tumoren, wie in einem Stoffwechselweg Clustering-Analyse (2B) dargestellt ist, variiert stark mit einigen GCs gleichzeitige Aktivierung mehrerer RTKs wie HER2 /HER3, HER1 /2/3, HER1 /3 /cMET demonstrieren oder HER3 /cMET während andere nur auf einem einzigen Protein phosphoryliert. Der Tumor Gehalt aller untersuchten Proben war > 70% bezogen auf ihre histologischen Untersuchung. Allerdings ist die Pan-Cytokeratin (Pan-CK) Gesichtsausdruck war deutlich variable was darauf hindeutet, Heterogenität in der epithelialen Gehalt von GCs. Auf der Grundlage dieser Profilierung kategorisiert wir die Kohorte 434 GC-Probe entsprechend ihrer RTK-Aktivierung Signaturen und HER2-Status

HER Achse in Magenkrebs. (Tabelle 2 & Tabelle S1).

Mindestens ein Rezeptor Mitglied der HER-Achse wurde in 41% der GC-Patienten aktiviert. HER2-Phosphorylierung wurde nicht nur in 50% der HER2 (+) GC-Patienten nachgewiesen, sondern auch in ~ 22% der HER2 (-) Krebs in Übereinstimmung mit der beobachteten Gesamt HER2-Expression früher beschrieben wurde. 16/25 HER2 (+) Proben, die HER2 aktiviert demonstrierten ausgedrückt auch p95HER2. Ebenso HER3 wurde auch in einem höheren Prozentsatz von HER2 (+) GCs (36%) phosphoryliert verglichen mit HER2 (-) Karzinome (~ 24%). Allerdings phosphoryliert HER1 nicht so eine Vorliebe hatte und in äquivalenter Weise wurde in beiden GC-Typen aktiviert (26% in HER2 (+) und 25% bei HER2 (-)). Darüber hinaus zeigten die meisten der HER Mitglied aktiviert GC Tumoren (~64%) eine gleichzeitige Aktivierung anderer RTKs, das heißt, cMET oder IGF1 R. Histologisch eine Mehrheit der HER2 (+), intestinalen Typ GCs ausgedrückt eine aktivierte HER2 (in 22/36 oder ~61%), gefolgt von HER3 (in 13/36 oder ~36%) mit einer insgesamt 36% der intestinalen Typ GCs einen aktivierten HER2 Pathway exprimiert. Insgesamt war HER2 Aktivierung konzentrierter in intestinalen Typ (55/154 oder 35,7%) im Vergleich zu den diffuse-type Krebsarten (43/225 oder 19,1%). Im Gegensatz dazu wurde aktiviert HER1 gleichermaßen in beiden Darm-Typ beobachtet (38/154 oder 24,7%) und diffusen Typ (58/225 oder 25,8%) GCs. Aktivierte HER3 war äquivalent auch vorhanden (29,9% und 21,8%) zwischen den beiden Klassifikations Subtypen des Lauren.

Da die Signalfunktion der HER-Kinase-Achse bei aktivierter Rezeptor-Dimerisierung abhängig ist, haben wir uns mit den verschiedenen Paaren von HER Mitglied coactivations. HER3 aktiviert GCs ohne HER1 Koaktivierung: Koaktivierung von HER2 mit HER3 wurde in HER2 (+) Tumoren (13/50 oder 26%) mit 7/13 HER2 bevorzugt. Etwa 54% des HER2: HER3 coaktiviert HER2 (+) GCs coexprimiert p95HER2. (: HER2, HER1: HER3 und HER2: HER3 HER1), ausgedrückt in ~ 15% von jeweils HER2 - auf der anderen Seite, HER2 () GCs nicht eine Präferenz für eine bestimmte HER-Kinase-Dimer-Paar mit allen drei möglichen Paaren aktivierte Dimer demonstrieren (-) Proben. (-) Triple-Aktivierung von HER 1/2/3-Rezeptoren wurde in 11,1% der GCs mit einem geringfügig höheren Verteilung in HER2 beobachtet Krebs

cMET Magenkarzinome (Tabelle 3 & Tabelle S1) aktiviert.
. (-) (~ 25%) GCs

Ähnlich wie HER 1, cMET Phosphorylierung wurde in äquivalenter Weise zwischen HER2 (+) (22%) und HER2 verteilt. Ferner ist die Abgabe auf dem Lauren basierend cMET aktiviert histotype war ähnlich zwischen Darm (48/154 oder 31,2%) und diffus-Typ (55/225 oder 24,4%) GCs.

Die Mehrheit der cMET aktiviert GC-Proben (~ 71% oder 77/108) zeigten eine gleichzeitige Aktivierung von HER-Kinase-Rezeptor Mitglieder. Alle Proben mit einem phosphorylierten cMET demonstriert a cMET
Verstärkung (Daten nicht gezeigt). Wir untersuchten die HER-Achse Rezeptoren bevorzugt, dass Cross-Talk mit dem cMET Weg. Von den 77 GC-Proben ein cMET Koaktivierung mit einem HER Mitglied demonstriert, 66 Proben (~86%) waren mit HER 1. Insgesamt wurde auch cMET bevorzugt coaktiviert wie bei HER1 (15,2%) auf HER2 verglichen (10,1%) oder HER3 (9,7%). Diese Beobachtungen legen nahe, eine mögliche Übersprechen zwischen den cMET und HER1-Signalwege in GCs. cMET Aktivierung nie koexistierten mit Aktiv HER3 sofern HER1 und /oder HER2 auch in der gleichen Probe phosphoryliert wurden. Etwa 7% der GC-Patienten zeigten eine Koaktivierung aller drei HER Achse Rezeptor Mitglieder mit cMET. Aktivierte cMET koexistierten mit p95HER2 exprimierenden Proben in 5/24 und 1/10 HER2 (+) und HER2 (-) GCs jeweils

IGF1R aktiviert Magenkarzinome (Tabelle 4 & Tabelle S1)..

Ähnlich HER3-Aktivierung, der Signalweg durch den IGF1-Rezeptor angetrieben war aktiv in einem höheren Prozentsatz von HER2 (+) GCs (30%) als die HER2 (-) GCs (24,7%). Weiterhin wurde als mit phosphorylierten HER3 beobachtet, aktiviert IGF1R äquivalent zwischen dem Darm (26%) und diffuse-type (~ 24%) GCs verteilt. Diese Verteilung führen uns zu untersuchen, ob es eine IGF1R war: HER3 Koaktivierung in der GC-Patientenkohorte. HER3 Koaktivierung: IGF1 R war in der Tat mit p-HER3 insbesondere in HER2 (+) GCs, wo 22% oder 11/50 HER2 (+) GCs zeigte eine IGF1R maximal coaktiviert. Doch in HER2 (-) GCs, Prozentsatz der IGF1R Koaktivierung mit HER3 (in 51/384 Proben oder 13,8%) war ähnlich IGF1R Koaktivierung mit HER 1 (in 53/384 Proben bzw. 13,3%). IGF1 R: HER2 Koaktivierung (in 45/384 Proben oder 11,7%), gefolgt dicht hinter. Insgesamt 34/434 GC-Proben zeigten Koaktivierung aller Mitglieder der HER-Kinase-Achse mit IGF1 R, von denen 28 Proben auch eine cMET Koaktivierung demonstriert. Jedoch war cMET selten IGF1R in Abwesenheit eines HER-Kinase-Rezeptor Mitglied Koaktivierung co-aktiviert. Des Weiteren c-MET: IGF1R coactivations wurden vor allem in HER2 beobachtet (-) GCs

GC-Proben wurden hierarchisch gruppierten auf der Grundlage ihrer Dezil-basierten Marker Aktivierungsprofile (2B).. Die Analyse zeigte, dass cMET: HER1, HER2: HER3 und IGF1 R: PI3K Aktivierungsmuster wurden eng mit dem cMET korreliert: HER1 Cluster eine deutliche Untergruppe bilden.

• PLoS ONE: Expression von AFP und STAT3 beteiligt ist in Arsentrioxid-induzierte Apoptose und Hemmung der Proliferation in AFP-produzierenden Magenkarzinomzellen
• PLoS ONE: Funktionelle Promoter -308G > eine Variante, bei Tumor-Nekrose-Faktor-Gen a ist mit Risiko und Progression von Magenkrebs in einem chinesischen Bevölkerung Assoziierte