Plos ONE: Mycoplasma hyorhinis Aktivira NLRP3 Inflammasome in spodbuja migracije in invazije želodčnega raka celic

Povzetek

Ozadje

Mycoplasma hyorhinis
( M.hyorhinis, M.hy
), ki je povezana z razvojem na želodcu in prostati. NLRP3 inflammasome, protein kompleks nadzor dozorevanje pomembnih pro-vnetnih citokinov interlevkin (IL) -1β in IL-18, ki je vključen tudi v tumorigeneze in metastaz različnih vrst raka.

Metodologija /Glavne ugotovitve

Da bi razčistili, ali M.hy PODJETJA
spodbuja razvoj tumorja preko inflammasome aktivacije, smo analizirali monocitov za IL-1β in IL-18 proizvodnje na M.hy
izziv. Kadar je izpostavljen M.hy
, človekove monociti razstavljena hitro in robustno IL-1β in IL-18 izločanje. nadalje smo ugotovili, da je bil membrane protein-lipidni povezana (LAMP) iz M.hy
odgovoren za IL-1β indukcijo. Uporaba kompetitivni inhibitorji, specifičnega gena shRNA in genske ciljno miši, smo preverili, da je M.hy PODJETJA
povzroča IL-1β izločanje bil NLRP3 odvisna od in vitro
in in vivo
. Katepsina B dejavnost, K ^{+ iztok, Ca 2+ pritok in proizvodnjo ROS so bile vse potrebno za aktiviranje NLRP3 inflammasome s M.hy
. Pomembno je, da je IL-1β, vendar ne IL-18, izdelano iz makrofagov izpodbijanih s M.hy PODJETJA
spodbujati migracije želodčni rak celic in invazijo.}

Sklepi

Naši podatki kažejo, da aktiviranje NLRP3 inflammasome z M.hy
je lahko povezana s spodbujanjem želodca metastaze raka, in anti M.hy
terapija ali omejevanje NLRP3 signalizacijo je lahko učinkovit pristop za nadzor želodca teku raka

Navedba. Xu Y Li H, Chen W, Yao X, Y Xing, Wang X, et al. (2013) Mycoplasma hyorhinis
Aktivira NLRP3 Inflammasome in spodbuja migracije in Invasion od želodca rakavih celic. PLoS ONE 8 (11): e77955. doi: 10,1371 /journal.pone.0077955

Urednik: Suresh Yenugu, Univerza v Hyderabad, India

Prejeto: 5. junij 2013; Sprejeto: 6. september 2013; Objavljeno: 6. november 2013

Copyright: © 2013 Xu et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. To delo je podprta s sredstvi iz 100 Talent Program kitajske akademije znanosti, Natural Science Foundation Kitajske (91029707, 31170868), Shanghai Natural Science Foundation (11ZR1442600), Novo Nordisk-CAS Research Foundation, SA-SIBS Scholarship Program, kot tudi nepovratna sredstva iz nacionalnih ključnih programov za nalezljive bolezni (2012ZX10002007-003). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

mikroplazme so pleomorfne, brez sten, prokariontske organizme, ki prebivajo bodisi na evkariontskih celičnih membran ali znotraj celic, in so najmanjši ki so sposobni samostojnega razmnoževanja [1]. Do sedaj je bilo najmanj 16 mikoplazma vrste izoliran od ljudi [2]. Mycoplasma hyorhinis
( M.hy
) je štelo, ki niso patogeni za ljudi, kot je običajno okuži prašiči, ki vodi do bolezni dihal in vnetje prsi in sklepov [3], [4] . Vendar pa se kopičijo dokazi kažejo, da je M.hy
okužbe pri ljudeh ne povzroči klinične izide. M.hy
so našli v 56% raka želodca, 55% raka na debelem črevesu in 52,6% za pljučnega karcinoma biopsije [5]. Poleg tega je 36% moških z benigno hiperplazijo prostate (BPH) in 52% moških z rakom na prostati, so M.hy
serološko pozitivna. Te klinična opažanja kažejo na možno povezavo med M.hy
izpostavljenost s želodca, debelega črevesa, pljuč in prostate raka [5], [6].

Ob mikrobne infekcije, gostitelj vzorec receptorji prepoznavanje ( PRRS), kot so TLR občutek za patogene in sprožijo sintezo vnetnih citokinov, kot so pro-IL-1β in pro-IL-18 prek aktivacije NF-κB. Hkrati, druga skupina PRRS vključno NLRP3 zaposliti PSZ vmesniške beljakovin in vodi do aktivacije kaspaze-1, ki je dejaven proteaze, ki cepi oblika predhodnik citokinov, vključno s pro-IL-1β in pro-IL-18 v zrelo, izločenega obliko [7]. Patogeni ali izziv agenti povzroči kalijev iztok, poškodbe mitohondrijev, mitohondriji javnost DNA, proizvodnjo ROS, znotrajcelično povečanje kalcija ali mobilnega ciklično zmanjšanje AMP v prirojenih imunskih celic, ki so vse vpletene v kaspaze-1 aktivacijo [8], [9], [10 ], [11] [12] [13]. V tem procesu je NLRP3, ASC in pro-kaspaze-1 oblika molekularni platformo imenovano inflammasome. Do sedaj so bile ugotovljene številne inflammasomes, med njimi je NLRP3 inflammasome je ugotovila, povezana z razvojem tumorjev [14], [15], čeprav polemike obstaja iz različnih modelov [16], [17]. Kljub temu, so poročali IL-1β za spodbujanje rasti celic tumorja in metastaz z indukcijo več pro-metastaznih gene kot matriksnih metaloproteinaz in endotelialnih adhezijskih molekul, kakor tudi TGF-P, kemokinov in rastnih faktorjev [18]. V korejski prebivalstva, kombinacija povečane ravni IL-1β sluznice in homozigotnosti za IL-1β -31T polimorfizma posameznih nukleotidov (SNP), oba povezana s povečanim tveganjem za raka želodca [18]. Poleg tega Tu sod. ugotovljeno, da je v želodcu specifično izražanje humanega IL-1β v transgenih miših privedlo do spontanega želodca vnetja in raka [19], ki nadalje kaže, da lahko IL-1β spodbujanje človeškega želodca karcinogenezo. V nasprotju s tem, IL-18 poveča aktivnost NK celic, zmanjšuje tumorigeneze, inducira apoptozo in zavira angiogenezo v tumorskih celicah učinkuje anti-tumorskih učinkov [20], [21]. Poleg tega je bilo ugotovljeno, neprimeren proizvodnjo IL-18, da prispevajo k patogenezi raka in lahko vplivajo na klinični izid bolnikov [22]. IL-18 so poročali za spodbujanje matrične metaloproteaze-9 proizvodnje, ki izhajajo iz povečane migracije in invazije v koronarnih arterij gladkih mišičnih celic in HL-60 mieloične levkemije celic [23], [24]. Navedeno je bilo tudi, da je bila stopnja serum IL-18 v raka želodca skupini bolnikov bistveno višja kot v želodca skupini bolnikov [25] in IL-18 lahko poveča metastaze in imunski pobeg raka na želodcu preko zmanjšanjem števila CD70 in vzdrževanje CD44 v želodčni rak celične linije človeških NCI-N87 in SNU16 [26]. Prav tako je pomemben posrednik-VEGF okrepljeno migracij v človeške želodčne raka celičnih linijah snu-601 [27]. Zgornje ugotovitve kažejo, da je Mycoplasma hyorhinis
lahko spodbujajo migracije in vdor želodčnih rakavih celic z aktiviranjem inflammasome.

Do sedaj, širok spekter mikroorganizmov, vključno z virusi, bakterije, glive in praživali so bili ugotovil, da aktivirate NLRP3 inflammasome [28]. Nedavna študija je pokazala, da je Mycoplasma pneumoniae
lahko povzroči produkcijo IL-1β v humanih celic [29] prav. Vendar, če M.hy
, ki je pomemben dejavnik pri razvoju raka želodca, kot je navedeno zgoraj, [5], [30], [31] aktivira NLRP3 inflammasome in če je to aktiviranje prispeva k raka želodca razvoj ostajajo neznani. V tej raziskavi smo ugotovili, da je M.hy
sproži IL-1β izločanje v NLRP3 inflammasome odvisnega način in posledično IL-1β inducirane migracije in invazije želodčnih rakavih celic.

Rezultati

M.hy
Sprožilci IL-1β in IL-18 Proizvodnja THP-1 celice

Če želite ugotoviti, ali M.hy
povzroča IL -1β proizvodnja iz prirojenih imunskih celic, smo spremljali zrelih ravni IL-1β v monocitno humani celični liniji celic THP-1 izpodbijala z različnimi količinami M.hy
. V tem poskusu, so opazili močan indukcijo IL-1β na način, ki je odvisen od odmerka (slika 1A). Dalje, smo merili pro-IL-1β ravni mRNA v celicah in zrel IL-1β raven beljakovin v supernatante kulture v različnih časovnih točkah po M.hy
izziv. Ugotovljeno je bilo, da je raven IL-1β mRNA dosegla 3 ure po izzivu (slika 1B) in zrel IL-1β (slika 1C) in IL-18 (Slika 1D) koncentracije proteina je dosegla 12 ur po izzivu. Poleg tega THP-1 izpeljani makrofagov tudi razstavljeni robustno izločanje IL-1β, IL-18 kot tudi drugih vnetnih citokinov, kot so IL-6 in IL-8 (slika 1E, slika S1). Za potrditev zgornje ugotovitve v THP-1 celične linije, smo pregledali IL-1β proizvodnje v osnovnih človeških monocitov iz zdravih darovalcev izpodbijati s M.hy
, kjer je IL-1β močno inducirano (slika 1F) . Ti podatki kažejo, da je M.hy
sprožil močan IL-1β in IL-18 izločanje iz mieloidnih celic.

LAMP izhaja iz M.hy
je odgovoren za IL -1β Indukcijsko skozi TLR2

Naprej smo raziskovali, ali je bila zahteva replikacija M.hy
za IL-1β proizvodnje v monociti. Kot je prikazano na sliki 2A, M
.hy
inaktiviran s segrevanjem ali ultravijolični (UV) zdravljenje inducirane toliko IL-1β izločanje iz celic THP-1 v živo M .hy
. To kaže, da je bila določena na vročino in UV odporna del M.hy
odgovoren za indukcijo IL-1β izločanja. Lipidov povezano membrane (LAMP) je obilno izražen na površini M.hy
[32], in prejšnje študija je pokazala, da membranski lipoproteini iz drugih vrst mikoplazem povzroča IL-1β izločanje [33]. Tako smo predvidevali, da je M.hy PODJETJA
izhaja LAMP (MLAMP) lahko odgovorna za IL-1β indukcijo v celicah THP-1. Nato smo ga dobili svetilka iz M.hy
(slika 2B) in testirali sposobnost MLAMP za induciranje IL-1β izločanje v celicah THP-1. Ugotovili smo, da MLAMP jasno povzroča izločanje IL-1β na način, ki je odvisen od odmerka, medtem ko vodna faza M.hy
izvleček ni mogel storiti, tako da (slika 2C). Da bi izključili morebitno RNA in /ali kontaminacije DNA v MLAMP smo obravnavala MLAPMs z RNaze in DNazo in ugotovila, da je bil MLAMP glavna sestavina za IL-1β indukcijo (Slika S2).

so poročali, da MLAMP predvsem aktivira NF-κB skozi TLR2 in TLR6 [34], [35]. Zato smo najprej uporabili TLR2 T2.5 nevtralizirajočih protiteles, da blokira signal TLR2, s ConT2 služi kot nadzor izotipna [36]. Kot je prikazano na sliki 2D, T2.5 popolnoma blokiran izločanje IL-1β z TLR2 agonisti P3CSK4 ne pa ligandnim LPS TLR4 stimulirati. Pomembno je, da IL-1β izloček M.hy
okuženih celic se je močno zmanjšala za T2.5, kar kaže, da je bila TLR2 vključen v MLAMP sproži IL-1β izločanje v človeških monocitov. Zanimivo je, da IL-1β izloček M.hy PODJETJA
okuženih celic ni bila popolnoma blokirana, ki jih T2.5 (slika 2D), ki nakazujejo, da je bila TLR2 neodvisen signalizacijo pot vključeni tudi v MLAMP sproži IL-1β izločanje, ki si zasluži nadaljnjo preiskavo v prihodnosti.

M.hy
povzroča IL-1β Izločanje skozi Aktiviranje NLRP3 Inflammasome

Če želite preveriti, ali M.hy
povzročene IL-1β izločanje skozi inflammasome aktivacijo, smo najprej uporabili LPS napolniti THP-1, ki izhajajo makrofage preveriti, če lahko M.hy
aktivirati inflammasome kot ATP ali MSU, ki so znani inflammasome aktivatorji. Kot je prikazano na sliki 3A, M
.hy
mogel povzročiti IL-1β sproščanje v že cepljenih celicah. Naprej smo preučili cepitev kaspaze-1 in oligomerizacijo PSZ, dve pomembni oblikovalci za aktiviranje inflammasome. Ugotovili smo, da je M.hy
spodbujati cepljenje kaspaze-1 in oligomerizacijo ASC (slika 3B), kar kaže na neposredno aktiviranje inflammasome s M.hy.

Poleg tega smo testirali, ali M.hy PODJETJA
povzroča IL-1β izločanje je odvisno od določenih sestavnih delih inflammasome. Prvič, smo ugotovili, da je specifična kaspaza-1 inhibitor AC-YVAD-CHO zmanjšal izločanje IL-1β v celicah THP-1 na način, odvisen od doze (slika 3C). Dalje, ko je bila specifična shRNA zaposlen utišati izražanje kaspaze-1 in ASC (slika 3D), produkcija IL-1β je močno zmanjšalo na M.hy
izziv (Slika 3E), kar kaže, da je M.hy PODJETJA
povzroča IL-1β izločanje je odvisno od kaspaze-1 in PSZ.

Potem, smo preizkusili, ali je bil NLRP3 potrebna za M.hy PODJETJA
povzroča IL-1β izločanje. Najprej smo ugotovili, da NLRP3 inhibitor Glybenclamide zatreti M.hy PODJETJA
inducirano IL-1β izločanje na način, ki je odvisen od odmerka (slika 3F) [37]. Ko je bila specifična shRNA zaposleni za utišanje izražanja NLRP3 (Slika 3G), je bila produkcija IL-1β močno zmanjšal na M.hy
izziv (slika 3H), kar kaže, da je M.hy
povzroča izločanje IL-1β je odvisna od NLRP3. To je bilo potrjeno z imuno, v katerem je bilo kaspaze-1 aktivacija in IL-1β proizvodnja tako NLRP3 odvisno (Slika 3i). Poleg tega smo nadalje ugotovili, da je bil MLAMP glavna sestavina odgovoren za NLRP3 aktivacijo inflammasome z M.hy
(slika S2C). Poleg tega so poročali AIM2 inflammasome se aktivira DNK [38], in smo ugotovili, da je M.hy
DNA povzroča IL-1β izločanje preko AIM2 inflammasome (slika S3A). Zanimivo je, M.hy PODJETJA
povzroča IL-1β izločanje je predvsem odvisna od NLRP3, medtem ko je bila AIM2 le delno vključeni (slika S3A). Skupaj, se ti rezultati jasno dokazano, da je M.hy PODJETJA
povzroča IL-1β izločanje preko aktivacije inflammasome NLRP3 v monocitnih celic.

mehanizme, ki podpirajo M.hy
sproži NLRP3 Inflammasome Aktivacija

Aktivacija NLRP3 inflammasome na različne dražljaje, je odvisno od aktivnosti katepsina B, K ^{+ iztočno, kalcijev prihoda in /ali proizvodnje reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS) [11], [ ,,,0],12], [13] [39]. Raziskati mehanizme, ki podpirajo IL-1β javnost v odgovor na M.hy
izziv, smo prvič uporabil katepsina B-specifični zaviralec CA-074 Me in opazili precejšnje dušenje IL-1β izločanja na M .hy
izziv. Pri koncentraciji 100 pM, CA-074 Me popolnoma blokiran IL-1β sproščanje (slika 4A). To zaviranje ni bilo zaradi kakršne koli toksičnega učinka na celice kot IL-8 izločanja s tem zavira prizadela bil zelo blag (slika 4E). Pomembno je, da ko smo celice zdravijo z katepsina K inhibitorjev I, zmanjšanje IL-1β izločanja ni bila očitna na vseh (slika 4B in 4F), kar kaže, da je bila aktivnost katepsina B izrecno vključeni v NLRP3 aktivacijo inflammasome v M .hy
izziv. Poleg tega, ko smo blokirali K + iztok s povečanjem zunajcelični K + koncentracijo, IL-1β izločanje s THP 1 celicah ob M.hy
izziv se je bistveno zmanjšalo v od odmerka odvisen način (slika 4C). Ponovno ni bilo toksični učinek od KCl kot IL-8 proizvodnje iz istih celic je normalna (slika 4G). Ugotoviti, ali Vtok kalcija pomagal inflammasome aktivacijo, smo dodali različne odmerke EGTA v mediju celične kulture in ugotovila, da zdravljenje EGTA blokiran M.hy
inducirano IL-1β izločanje na način, ki je odvisen od odmerka, in niso opazili toksični učinek od EGTA kot je razvidno iz IL-8 proizvodnje (slika 4D in 4H).}

Poleg tega smo preizkusili, ali M.hy
izziv povzroča nastajanje ROS v celicah THP-1 . Pri tem preizkusu smo celice THP-1 najprej naložen z redoks občutljiv fluorofora DCFDA in nato izpodbijati z M.hy
, ATP bila vključena kot pozitivno kontrolo. Kot je prikazano na sliki 5A, je bilo 16,9% CM-H2DCFDA pozitivne celice zaznali 30 minut po M.hy
zdravljenja v primerjavi z 1,6% v neobdelanih celicah. Ti podatki kažejo, da lahko ROS prispevajo k NLRP3 aktivacijo inflammasome odgovor na M.hy
izziv. Da bi preverili to možnost, smo obdelamo THP-1 celice z zaviralcem ROS diphenyliodonium (DPI) za 30 minut, nato izpodbijala celice s M.hy
pred merjenjem IL-1β proizvodnje 6 ur kasneje. Kot je bilo pričakovati, DPI dramatično zmanjšala M.hy PODJETJA
povzroča IL-1β sproščanje (slika 5B). Nedavna študija je pokazala, da ROS inhibitor kot DPI odpravljena sproščanje IL-1β v makrofagov miši z zaviranjem NLRP3 izražanje genov [40]. Zato smo spremljali tudi raven mRNA pro-IL-1β in NLRP3 zdravljenjem z DPI. Ugotovili smo, da DPI izrazito zmanjšala izražanje pro-IL-1β in NLRP3 (slika 5C-D), ki je v skladu z ugotovitvijo iz mišjih celic [40]. Poleg tega smo pregledali tudi aktivacije kaspaze-1, in ugotovili, da nizki odmerki (1 oziroma 10 uM) zdravljenja DPI ni vplivala aktivacije kaspaze-1, medtem ko je 100 uM za DPI zaviral kaspaza-1 aktivacijo (slika 5e). Ta je pokazala, da v človeških celicah DPI moti NLRP3 aktivacijo inflammasome z zaviranjem NLRP3 transkripcijo kot tudi kaspaze-1 aktivnostjo, ko je bila uporabljena z velikim odmerkom. Kolektivno, ti podatki kažejo, da katepsina B dejavnost, K ^{+ izliva, Ca 2+ pritok in ROS prispevali k NLRP3 aktivacijo inflammasome odgovor na M.hy
izziv.}

M.hy
Aktivira NLRP3 Inflammasome in vivo

Ko so miši kosti dendritične celice mozga izhaja (BMDCs) okužene z M.hy
je trajna indukcijo IL-1β opazili (slika 6A). Nadaljnji poskusi na BMDCs izolirane iz divjega tipa (WT) miši ali miši s pomanjkanjem za kaspaze-1, ASC ali NLRP3 s M.hy
izziv, je potrdil, da M.hy
indukcijo IL- 1β je NLRP3 inflammasome odvisno (slika 6B). Poleg tega sistemsko inokulacijo M.hy
in WT miših induciranih IL-1β proizvodnjo v serumu in peritonealno izpiranje tekočine (PLF), ne pa tudi pri miših, ki nimajo ASC ali NLRP3 (slika 6C-D). Zanimivo je, da je bila bazalna raven IL-1β pri miših pomanjkljivo ASC očitno višja kot pri miših s pomanjkanjem WT ali NLRP3, ampak izziv, s M.hy
ni dodatno povečajo izločanje IL-1β v teh miših (Slika 6C-D). Kolektivno, te ugotovitve je potrdil, da
M.hy aktivira tudi NLRP3 inflammasome v miši in vitro
in in vivo
.

M. hy
povzročena IL-1β Spodbuja tumorja želodca mobilni migracije in invazije

Zgornji podatki jasno pokazala, da je je M.hy
lahko povzroči IL-1β proizvodnje iz prirojenih imunskih celic skozi NLRP3 inflammasome aktiviranje. Študije zgodnje epidemije pokazala možne vloge mikoplazme pri razvoju raka želodca [5]. In Mycoplasma hyorhinis
je bilo dokazano spodbujajo migracijo tumorskih celic, invazijo in metastaze in vitro
in in vivo
[41]. Domnevali smo, da lahko obstajajo še mehanizem za to promocijo, ki je, da M.hy
lahko spodbuja želodčne kancerogenosti in /ali metastaz s spodbujanjem IL-1β proizvodnjo. In smo potrdili, da je M.hy PODJETJA
spodbujati migracije želodčni rak celic in napad (Slika S5). Ker je bila M.hy
dokazano okužbo želodčne rakavih celic ([41], slika S4), zato je možno, da M.hy
lahko povzroči inflammasome aktivacijo v rakavih celicah neposredno. Vendar pa ni bila aktivacija inflammasome odkrili pri želodčnih rakavih celic (slika S6).

Naslednja določen vpliv človeškega rekombinantnega IL-1β (rIL-1β) na rakave celice rakotvornost želodca v testu nastanek kolonije, ki je pokazala, da rIL-1β ni vplivala na širjenje raka celične linije želodca MGC-803 (Slika S7). Ker je bil IL-1β poročali za spodbujanje metastaze drugih tumorjev [18], smo preverili učinke rIL-1β na migracije in invazije MGC-803 celic. Naši rezultati so pokazali, da so migracije in invazije MGC-803 okrepljeno z rIL-1β zdravljenja (Slika 7a in 7c), medtem ko je zdravljenje z rIL-18 ni pokazal nobenega učinka (Slika 7B in 7D). Dalje smo obravnavajo te želodčne rakave celice z supernatante kulture iz M.hy PODJETJA
izpodbijala THP-1, ki izhajajo makrofagov ali makrofagov z utišanje NLRP3, ASC in kaspaze-1 za migracije in invazijo testu. Naši rezultati so pokazali, da
kulture supernatanti s M.hy izpodbijala makrofag celice žoga močno izboljšane migracije in vdor želodčnih rakavih celic, medtem ko kultura supernatante iz NLRP3, ASC ali kaspaze-1 rasklapanje makrofagov ni, verjetno zaradi zmanjšanega IL-1β izločanja (slika 8A in 8C). To okrepljeno migracije in invazijo MGC-803 celic, je bila odpravljena z obdelavo celic z anti-IL-1β mAb (slika 8B in 8D). Skupaj, naši rezultati pokazali, da je M.hy PODJETJA
inducirane migracije in vdor želodčnega raka celične linije MGC-803 s spodbujanjem IL-1β izločanje iz monocitnih celic. Še več, naši podatki kažejo, da je M.hy PODJETJA
povzroča aktiviranje inflammasome lahko spodbuja M.hy
replikacija (slika S8), ki lahko ustvari pozitiven odziv in na koncu pripelje do kroničnosti bolezni.

Pogovor

mikroplazme se razlikuje od drugih bakterij, ki jih majhnosti, minuto genoma in pomanjkanje celične stene. Veliko mikoplazme vzpostaviti kolonizacijo in okužbo z upoštevanjem gostitelja tkiva. Ker je njihova dinamična površina arhitektura je antigensko in funkcionalno vsestranski, mikoplazme so sposobni izogniti gostinskih imunski napad in prilagajanje številnih habitatov in povzročajo kronične bolezni [32]. Ker identifikacijo M.hy
prašičev leta 1962, je bilo malo preiskavo na ta patogen, dokler je bilo ugotovljeno, da je povezana s številnimi človeškimi raka [5], [41] [42], [ ,,,0],43]. V zadnjem času so znanstveniki ugotovili, da je M.hy
protein P37 odgovorna za spodbujanje rakavih celic invazivnosti in metastaze [30], [44]. Poleg tega neposredni mehanizem, lahko ta mikrob inducira tudi tumorigeneze ali metastaz posredno preko lokalnega kronične vnetne procesa. Znano je, da je IL-1β pomemben pro-vnetnih citokinov, ki spodbuja rast rakavih celic na debelem črevesu in povečuje invazivnosti in metastaze B16 melanoma celic [19], [45]. Čezmerno izražanje IL-1β je bilo ugotovljeno, da povzroči želodčne vnetja in raka pri miših [19]. V tej študiji smo raziskovali, ali NLRP3 inflammasome, ki nadzoruje IL-1β zorenja, je bil aktiviran s M.hy
, in ali lahko to aktivacija prispeva k M.hy PODJETJA
povezana metastaze v želodcu . Naši rezultati so pokazali, da je M.hy
aktivirali NLRP3 inflammasome in vitro
in in vivo
in spodbujanje migracij želodca rakave celice in vdor M .hy
je odvisna od NLRP3 aktiviranje inflammasome. Poleg NLRP3, smo ugotovili, da je M.hy
DNA aktivira tudi AIM2 inflammasome, vendar MLAMP aktivacija NLRP3 je prevladujoči element za IL-1β indukcije z M.hy.

bilo je pred kratkim poročali, da je bil aciliran lipopeptidna iz toplotno ubitih mikoplazme Acholeplasma laidlawii
(HKAL) inducirane IL-1β proizvodnja po NLRP7 inflammasome v človeških celicah, medtem ko je skupno HKAL povzroča IL-1β izločanje delno NLRP3 odvisna [46], kar kaže, da se več inflammasomes lahko aktivira določene mikoplazme. Naši podatki ne izključuje morebitno udeležbo NLRP7 v M.hy PODJETJA
povzroča IL-1β proizvodnje, vendar M.hy
predvsem aktiviral NLRP3 inflammasome, ker je bilo izločanje IL-1β skoraj popolnoma odpravi v NLRP3 utihnile celic (Slika 3h in 3i).

Zgodnje študije predlaga, da ROS aktivirali NLRP3 inflammasome z aktivacijo kaspazo-1 [47]. Vendar pa je nedavna raziskava pokazala, da so zaviralci ROS posegel prepis IL-1β in NLRP3, vendar ne vpliva aktivacije kaspaze-1 v mišjih celicah [40]. V naši raziskavi, čeprav zaviranje ROS majhnih odmerkih DPI (10 mikrometrov) občutno zmanjšala proizvodnjo IL-1β na M.hy
izziv, da ni zaviral cepljenje kaspaze-1, je označevalca inflammasome aktivacije. Vendar, ko je bil uporabljen visok odmerek DPI (100 uM), kaspaze-1 cepitev je bilo jasno inhibiran (slika 5E), kar pomeni, da lahko visoka doza DPI zatreti sestavljanje inflammasome kompleksa, čeprav ne moremo izključiti možnosti, da bi lahko ta učinek so bili posledica iz NLRP3 mRNA odpravi od izhodiščne vrednosti (Slika 5D). Verjetno je, da bi lahko inhibitor ROS moti tako pro-IL-1β sintezo in aktivacije kaspaze-1.

Kako M.hy
spodbuja nastajanje ROS v makrofaga še vedno nedosegljiva. Pomanjkanje celične stene iz M.hy
omogoča neposreden stik mikoplazma membrane in gostitelja celične membrane, kar stik lahko privede do fuzije mikoplazme z evkariotsko gostiteljsko celico. Ta fuzija ne sme povzročiti le mikoplazem komponent dali v celico gostiteljico, ampak tudi vstavljanje komponent mikoplazma membranskih v membrano evkariontski gostiteljski celici. V zadnjem času, M.hy
membrane je bilo ugotovljeno, da imajo fosfolipaze A (PLA), ki so lahko vključeni v proces motnje plasma membrane, ki se pojavi ob invaziji gostiteljskih celic [48], [49]. Med tem procesom, lahko gostiteljske celice proizvajajo ROS. To bi bilo vredno preiskuje, ali je PLA potreben za M.hy PODJETJA
povzroča nastajanje ROS in IL-1β izločanje.

Kot je razvidno iz naših podatkih lizosomalne prelom, K ^{+ iztok, Ca 2+ pritok in ROS so bili vsi vpleteni v M.hy PODJETJA
inducirane aktivacijo NLRP3. Kot so poročali prej, K + lahko iztok in fagolizosomsko rupture povzroči Ca 2+ pritok, medtem ko Ca 2+ pritok lahko povzroči motnje v delovanju mitohondrijev, kar ima za posledico sproščanje oksidira mitohondrijsko DNK (mtDNK) v citosol, kjer se veže na in aktivirati NLRP3 inflammasome [9], [12]. Mitohondriji se zdi, da deluje kot osrednje vozlišče za integracijo različnih signalov po NLRP3 zaznanih, a relativni prispevek ROS in mtDNK za NLRP3 aktivacijo inflammasome še vedno ni jasno, do danes [9].}

Čeprav M .hy
ni zelo agresiven, lahko dokaže, kronično okužbo. Postopno in v vedno večji interakciji z gostiteljske celice, da povzroči kromosomske nestabilnosti in maligne transformacije, s čimer se spodbuja rast tumorja, migracije ali invazijo [50], [51]. M.hy
P37 protein spodbujati želodčni rak celic, karcinom prostate in melanoma celične linije invazivnost [30], [31]. Poleg tega lahko pro-vnetnih mikro-okolje, kot so proizvodnja IL-1β prav tako prispevajo k temu procesu [19]. Naša raziskava je pokazala, da je M.hy PODJETJA
povzroča IL-1β spodbujati migracije in vdor želodca rakavih celic, medtem ko je M.hy PODJETJA
povzroča IL-18 ni prispeval k migraciji in invazijo želodca rakave celice, ki je bila drugačna od drugih poročil [26], [27]. Možna razlaga je, da so IL-18 lahko napredujejo v želodcu rakave celice migracije in vdor preko regulacije CD70, CD44 in VEGF izražanja v imunskih celic, ki si zasluži naše nadaljnje preiskave [26]. Druga razlaga bi lahko bila, da je odmerek rIL-18 se uporablja (150 ng /ml), precej višji od tistega, kar smo vajeni [27]. Poleg tega, IL-1β spodbujati migracije in vdor želodca rakavih celic lahko posreduje matrika metalo-9 (MMP9), druge iskalce poročali [52]. Kljub temu, da bi dobili neposreden in bolj trdne dokaze in ustrezne mehanizme o povezavi med aktivacijo NLRP3 inflammasome z M.hy,
in želodca metastaz raka, primernih živalskih modelih je sprožil primer in vivo
tumorska invazija Test [53] in bolnikov študije so potrebna za nadaljevanje študija v prihodnosti.

materiali in metode

Cell Culture

THP-1 celice, PMA-inducirane makrofagov in želodčni rak celic MGC-803 smo vzdrževali v RPMI 1640 mediju z osnovnimi dodatki. Človeški monociti izoliramo s Percol TM gostote gradientno centrifugiranje (GE Healthcare, bio-znanosti, Švedska), od človekove enojedrnih celicah periferne krvi (PBMC), pridobljenega iz Shanghai Blood Center (Shanghai, Kitajska).

M.hy
Strain in PCR zaznavanje

M.hy
sev v naši raziskavi je bilo pridobljeno iz kontaminiranega celične kulture. detekcija mikoplazma je bila izvedena s pomočjo dveh krogih PCR z mediju celične kulture [54]: Najprej teče PCR s štirimi primerji 5'-ACACCATGGGAGYTGGTAAT-3 ', 5'-CTTCWTCGACTTYCAGACCCAAGGCAT-3', 5'-AAAGTGGGCAATACCCAC GC-3 ', 5'-TCACGCTTAGATGCTTTCAGCG-3 's celično kultiviranim mediju kot predlogo. Drugič, da 1 xl zgornjega PCR produkta kot šablono in vodijo PCR s tremi primerji 5'-GTGSGGMTGGATCACCTCCT-3 ', 5'-GCATCCACCAWAWACY CTTT-3', 5'-CCACTGTGTGCCCTTTGTTCCT-3 '. Prva in druga PCR poteka pod enakimi pogoji cikla. Nato smo zaporedje proizvod PCR in pridobil naslednje sekvence: ACTCTTACTTAATTTAAAAGTTAATACAACTTTAATATT GCCTATTATTGCTAAAGATAAATATCTTAAGGTATTTTAATATTGGTAATCTATTTTAGAAATTTAATTTAAAAATTAAACTCGGTTATAAAAAAGATCGTTGAAATAATAAATATGAAGTTAATCATATTGTTATTTGCTATTCAGTTTTCAAAGAACTATAATTGAGAACTTAAAGCTCTCAAAACTAGACACGAATCGATTATGTAATAAGTCAATTAAGACTAACGGAAAGCGGAAAAAGAAGGTGATCCGTCCCCACG. Z BLAST v bazi podatkov NCBI, smo dobili informacijo, da je mikoplazma M.hy
. Lahko se zgodi, SK76, GDL-1 ali MCLD sev.

M.hy
Kultura, DNA Pridobivanje in MLAMP Priprava

M.hy
WAS gojijo v spremenjeni SP-4 medij, ki vsebuje 20% novorojenčkov, goveji serum, 10% ekstrakt kvasa, 1% glukoze, 0,00024% phenolsulfonphthalein in 1000 IU /ml penicilina. ekstrakcijo DNK iz M.hy
je bila izvedena v skladu z navodili z reagenti, ki jih zagotavlja Shanghai Lifefeng Biotechnology Co., Ltd. M.hy
bila količinsko kot enote barva spremembe (CCU), na mililiter, kot je opisano [55]. Ekstrakcijo MLAMP smo izvedli kot je opisano predhodno [34].

realnem času PCR

NLRP3 in IL-1β mRNA izraz smo določili z Kvantitativno PCR v realnem času. Relativna kvantifikacija genov smo normalizirali pred endogenega nadzor P-aktina po formuli [2 ^{-ΔCt (ciljni gen-β-aktina)]. Primerji, ki se uporabljajo, so bili: Homo sapiens (hs), IL-1β, 5'-CACGATGCACCTGTACGATCA- (naprej) 3 ', 5'-GTTGCTCCATATCC TGTCCCT- (nazaj) 3'; beta-aktin, 5'-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG- (naprej) 3 ', 5'-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC- (nazaj) 3'; NLRP3, 5'-AAGGGCCATGGACTATTTCC- (naprej) 3 ', 5'-GACTCCACCCGATGACAGTT- (nazaj) 3'. M.hy
DNA izvodov je opredeljen s Kvantitativni PCR v realnem času z metodologijo standardne krivulje za absolutne številke na papirju. Posebne primerji za M.hy
bilo. 5'CGATTCGTGTCTAGTTTTGAG - (naprej), 3 ', 5'ATTGCCTATTATTGCTAAAG - (nazaj) 3 "}

ELISA

smo analizirali supernatante iz gojenih celic, miška serumu in miška peritonealno izpiranje tekočine za citokinov IL-1β, IL-18, IL-6 in IL-8 izločanje z ELISA (BD Biosciences) v skladu z navodili proizvajalca.

generacija THP-1 celic, ki izražajo shRNAs usmerjenost genov kraji

shRNA vektorji proti človeški NLRP3, kaspaze-1 in ASC, in njihove žoga vektorji so darila iz dr Jürg Tschopp [56]. O generacijo celic THP-1, ki izražajo shRNAs, na kratko, nt GATGCGGAAGCTCTTCAGTTTCA zaporedja človeškega ASC kodiranja, nt CAGGTTTGACTATCTGTTCT od NLRP3 kodiranje zaporedja človeškega, nt GTGAAGAGATCCTTCTGTA na 3 'UTR človeškega kaspaze-1 so bili vstavljeni v pSUPER. V Pol III promotorja shRNA kasete iz teh vektorjev in iz Lamina A /C-poseben nadzorni pSUPER konstrukt so bili vstavljeni v lentivirusni vektor pAB286.1, derivat phr, ki vsebuje SV40-puromicina acetil transferaze kaseto za antibiotike izbiro.

• Plos ONE: Negativno Node Štetje Izboljšanje prognostični Napoved sedme izdaje TNM klasifikacije za želodca Cancer
• Plos ONE: Naravna zgodovina malignega boleznijo kosti želodčnega raka: Končni rezultati raziskave Večsrediščna kostnih metastaz