PLoS ONE: Mycoplasma hyorhinis Aktiverer NLRP3 Inflammasome og Fremmer Migration og Invasion af Gastric Cancer Cells

Abstrakt

Baggrund

Mycoplasma hyorhinis
( M.hyorhinis , M.hy
) er forbundet med udviklingen af ​​gastrisk og prostatakræft. Den NLRP3 Inflammasome, et protein kompleks kontrollerende modning af vigtige pro-inflammatoriske cytokiner interleukin (IL) -1β og IL-18, er også involveret i tumorgenese og metastase af forskellige kræftformer.

Metode /vigtigste resultater

for at afklare, om M.hy
fremmet tumor udvikling via inflammasome aktivering, vi analyserede monocytter til IL-1β og IL-18 produktion på M.hy
udfordring. Ved udsættelse for M.hy
, humane monocytter udviste hurtig og robust IL-1β og IL-18-sekretion. Vi identificerede endvidere, at lipid-associeret membranprotein (LAMP) fra M.hy
var ansvarlig for IL-1β induktion. Anvendelse kompetitive inhibitorer, genspecifikke shRNA og gen-målrettede mus, vi bekræftet, at M.hy
induceret IL-1β sekretion var NLRP3-afhængige in vitro
in vivo
. Cathepsin B-aktivitet, K ^{+ efflux, Ca 2+ tilstrømning og ROS produktion var alle nødvendige for NLRP3 inflammasome aktivering af M.hy
. Vigtigere er det IL-1β, men ikke IL-18 produceret af makrofager udfordret med M.hy
fremmet mavekræft celle migration og invasion.}

Konklusioner

Vores data tyder at aktivering af NLRP3 inflammasome af M.hy
kan være forbundet med dets fremme af mavekræft metastase, og anti- M.hy
terapi eller begrænse NLRP3 signalering kunne være effektiv tilgang til kontrol af gastrisk fremskridt kræft

Henvisning:. Xu Y, Li H, Chen W, Yao X, Xing Y, Wang X, et al. (2013) Mycoplasma hyorhinis
Aktiverer NLRP3 Inflammasome og Fremmer migration og invasion af Gastric Cancer Cells. PLoS ONE 8 (11): e77955. doi: 10,1371 /journal.pone.0077955

Redaktør: Suresh Yenugu, University of Hyderabad, Indien

Modtaget: Juni 5, 2013; Accepteret: September 6, 2013; Udgivet: November 6, 2013 |

Copyright: © 2013 Xu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra 100 Talent Program af det kinesiske Academy of Sciences, Natural Science Foundation of China (91.029.707, 31.170.868), Shanghai Natural Science Foundation (11ZR1442600), Novo Nordisk-CAS Research Foundation, SA-SIBS Scholarship Program, samt tilskud fra de nationale Key programmer på infektionssygdomme (2012ZX10002007-003). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Mycoplasmaer polymorfe, væg fri, prokaryote organismer, der er placeret enten på disse eukaryote cellemembraner eller inde i cellerne, og de er de mindste organismer i stand til selv-replikation [1]. Til dato er mindst 16 Mycoplasma arter blevet isoleret fra mennesker [2]. Mycoplasma hyorhinis
( M.hy
) blev betragtet som ikke-patogene for mennesker som det normalt inficerer svin, der fører til luftveje sygdom og betændelse i brystet og led [3], [4] . Men akkumulere tyder, at M.hy
infektion hos mennesker medfører kliniske resultater. M.hy
blev fundet i 56% af gastrisk karcinom, 55% af colon karcinom og 52,6% af lunge carcinoma biopsier [5]. Desuden 36% mænd med benign prostatahyperplasi (BPH) og 52% mænd med prostatakræft er M.hy
sero-positive. Disse kliniske fund antyder en mulig forbindelse mellem M.hy
eksponering med gastrisk, tyktarms-, lunge- og prostatakræft [5], [6].

Upon mikrobiel infektion, host mønster anerkendelse receptorer ( PRRS), såsom TLR'er fornemmer patogener og udløse syntesen af ​​pro-inflammatoriske cytokiner, såsom pro-IL-1β og pro-IL-18 via NF-KB-aktivering. Samtidig, en anden gruppe af PRRS herunder NLRP3 rekruttere adapteren protein ASC og føre til aktivering af caspase-1, som er en aktiv protease, som spalter precursor form af cytokiner, herunder pro-IL-1β og pro-IL-18 til modne, secernerede form [7]. Patogener eller udfordrende agenter forårsage kalium efflux, mitokondrier skader, mitokondrier DNA udgivelse, ROS produktion, intracellulær calcium stigning eller cellulær cyklisk AMP fald i medfødte immunceller, som alle er involveret i caspase-1-aktivering [8], [9], [10 ], [11], [12], [13]. Under denne proces, den NLRP3, ASC og pro-caspase-1 formular en molekylær platform kaldet Inflammasome. Indtil videre er der blevet identificeret en række inflammasomes, af dem, den NLRP3 inflammasome er blevet fundet i forbindelse med tumor udvikling [14], [15], selv om kontroverser findes fra forskellige modeller [16], [17]. Ikke desto mindre blev IL-1β rapporteret at fremme tumorcellevækst og metastase ved at inducere flere pro-metastatiske gener, såsom matrixmetalloproteinaser og endotheliale adhæsionsmolekyler, samt TGF-β, kemokiner og vækstfaktorer [18]. I en koreansk population, er kombinationen af ​​forøget mucosal IL-1β-niveau og homozygoti for IL-1β -31T enkelt-nukleotid polymorfisme (SNP) begge forbundet med øget risiko for mavekræft [18]. Endvidere Tu et al. fandt, at mave-specifik ekspression af human IL-1β i transgene mus førte til spontan gastrisk betændelse og kræft [19], hvilket yderligere tyder på, at IL-1β kan fremme menneskers gastrisk carcinogenese. I modsætning hertil IL-18 forøger NK-celleaktivitet, reducerer tumorigenese, inducerer apoptose og inhiberer angiogenese i tumorceller at udøve antitumorvirkninger [20], [21]. Desuden blev en uhensigtsmæssig produktion af IL-18 vist sig at bidrage til patogenesen af ​​cancere og kan påvirke det kliniske resultat hos patienter [22]. IL-18 blev rapporteret at stimulere matrixmetalloprotease-9 produktionen, hvilket resulterer i øget migration og invasion i koronararterie glatte muskelceller og HL-60 myeloide leukæmiceller [23], [24]. Det blev også rapporteret, at serum IL-18-niveau i gastrisk cancer patientgruppe var signifikant højere end den, mavesår patientgruppe [25] og IL-18 kan forøge metastase og immun udslip af mavekræft via nedregulering af CD70 og vedligeholdelse af CD44 i human gastrisk cancercellelinie NCI-N87 og SNU16 [26]. Det er også en kritisk mediator af VEGF-forstærket migration i humane gastriske cancercellelinier SNU-601 [27]. Ovenstående resultater tyder på, at Mycoplasma hyorhinis
kan fremme migration og invasion af gastriske kræftceller ved at aktivere Inflammasome.

Til dato, et bredt spektrum af mikroorganismer, herunder vira, bakterier, svampe og protozoer har været identificeret at aktivere NLRP3 inflammasome [28]. En nylig undersøgelse viste, at Mycoplasma pneumoniae
var også i stand til at inducere IL-1β-produktion i humane celler [29]. Men om M.hy
, hvilket er en vigtig faktor i gastrisk udvikling af kræft som nævnt ovenfor [5], [30], [31], aktiverer NLRP3 inflammasome, og om denne aktivering bidrager til mavekræft udvikling forbliver ukendte. I denne undersøgelse fandt vi, at M.hy
udløst IL-1β-sekretion i en NLRP3 inflammasome-afhængig måde, og det resulterende IL-1β-induceret migration og invasion af gastriske cancerceller.

Resultater

M.hy
Triggers IL-1β og IL-18 Produktion i THP-1 Celler

For at afgøre, om M.hy
inducerer IL -1β produktion fra medfødte immunceller, monitorerede vi modne IL-1-niveauer i human monocytisk cellelinie THP-1-celler udfordret med forskellige mængder af M.hy
. I dette forsøg blev en stærk induktion af IL-1β i en dosisafhængig måde observeret (figur 1A). Næste målte vi pro-IL-1β-mRNA-niveauer i cellerne og modne IL-1β proteinniveauer i kultursupernatanterne på forskellige tidspunkter efter M.hy
udfordring. Det blev observeret, at IL-1β mRNA niveauer toppede ved 3 timer efter challenge (figur 1 B) og modent IL-1β (figur 1C) og IL-18 (figur 1 D) proteinniveauer toppede ved 12 timer efter udfordring. Desuden THP-1-afledte makrofager udviste også robust sekretion af IL-1β, IL-18 samt andre inflammatoriske cytokiner såsom IL-6 og IL-8 (Figur 1E, fig S1). For at bekræfte de ovenstående resultater i THP-1 cellelinje, undersøgte vi IL-1β produktion i primære humane monocytter fra raske donorer udfordret med M.hy
, hvor IL-1β blev også stærkt induceret (figur 1F) . Disse data viste, at M.hy
udløste robust IL-1β og IL-18-sekretion fra humane myeloide celler.

LAMP stammer fra M.hy
er Ansvarlig for IL -1β Induktion gennem TLR2

Næste vi undersøgt, om replikering af M.hy
var påkrævet for IL-1β produktion i monocytter. Som vist i figur 2A, M
.hy
inaktiveres ved opvarmning eller ultraviolet (UV) behandling induceret så meget IL-1β-sekretion fra THP-1-celler som levende M .hy
. Dette indikerede, at visse varme- og UV resistent bestanddel af M.hy
var ansvarlig for induktion af IL-1β sekretion. Lipid-associeret membranprotein (LAMP) er rigeligt udtrykt på overfladen af ​​ M.hy
[32], og tidligere undersøgelse viste, at membran lipoproteiner fra andre mycoplasma arter induceret IL-1β sekretion [33]. Vi spekulerede derfor, at M.hy
afledt LAMP (MLAMP) kan være ansvarlig for IL-1β induktion i THP-1 celler. Vi derefter ekstraheret LAMP fra M.hy
(figur 2B) og testet evne MLAMP at inducere IL-1β-sekretion i THP-1-celler. Vi fandt, at MLAMP klart induceret sekretion af IL-1β i en dosisafhængig måde, medens den vandige fase af M.hy
ekstrakt ikke var i stand til det (figur 2C). For at udelukke mulige RNA og /eller DNA-kontaminering i MLAMP, vi behandlede de MLAPMs med RNase og DNase og fandt, at MLAMP var hovedbestanddelen for IL-1β induktion (figur S2).

Det blev rapporteret, at MLAMP hovedsageligt aktiveret NF-KB gennem TLR2 og TLR6 [34], [35]. Derfor vi først anvendt en TLR2 neutraliserende antistof T2.5 at blokere TLR2 signal med Cont2 tjener som en isotypekontrol [36]. Som vist i figur 2D, T2.5 blokerede fuldstændigt IL-1β-sekretion stimuleret af TLR2 agonist P3CSK4 men ikke af de TLR4 ligand LPS. Vigtigt er, IL-1β-sekretion fra M.hy
inficerede celler var stærkt reduceret med T2.5, hvilket indikerer, at TLR2 var involveret i MLAMP udløst IL-1β-sekretion i humane monocytter. Interessant nok blev IL-1β sekretion fra M.hy
inficerede celler ikke er helt blokeret af T2.5 (figur 2D), som foreslog, at TLR2-uafhængig signalvej også var involveret i MLAMP udløst IL-1β sekretion, som fortjener yderligere undersøgelser i fremtiden.

M.hy
inducerer IL-1β Sekretion gennem Aktivering af NLRP3 Inflammasome

for at teste, om M.hy
induceret IL-1β sekretion gennem inflammasome aktivering, vi først udnyttet LPS primet THP-1 afledte makrofager til at kontrollere, om M.hy
kan aktivere inflammasome ligesom ATP eller MSU, som er kendt Inflammasome aktivatorer. Som vist i figur 3A, M
.hy
var i stand til at inducere IL-1β-frigivelse i de primede celler. Næste vi undersøgte spaltningen af ​​caspase-1 og oligomerisering af ASC, to vigtige beslutningstagere for inflammasome aktivering. Vi fandt, at M.hy
fremmet spaltningen af ​​caspase-1 og oligomerisering af ASC (figur 3B), hvilket indikerer en direkte aktivering af inflammasome af M.hy.

Desuden testede vi, om M.hy
induceret IL-1β sekretion var afhængig af visse Inflammasome komponenter. Først fandt vi, at den specifikke caspase-1-inhibitor AC-YVAD-CHO faldt IL-1β-sekretion i THP-1-celler på en dosis-afhængig måde (figur 3C). Dernæst når specifikke shRNA blev ansat til at lukke munden på ekspression af caspase-1 og ASC (figur 3D), IL-1β produktion blev kraftigt reduceret på M.hy
udfordring (figur 3E), hvilket indikerer, at M.hy
induceret IL-1β sekretion var afhængig af caspase-1 og ASC.

Så vi testede, om NLRP3 var nødvendig for M.hy
induceret IL-1β sekretion. Først fandt vi, at NLRP3 inhibitoren Glybenclamide undertrykt M.hy
induceret IL-1β-sekretion i en dosisafhængig måde (figur 3F) [37]. Når specifikke shRNA blev ansat til at lukke munden udtryk for NLRP3 (figur 3G), blev IL-1β produktion kraftigt faldt på M.hy
udfordring (figur 3H), hvilket indikerer, at M.hy
induceret IL-1β-sekretion afhang NLRP3. Dette blev yderligere bekræftet ved immunoblotting, hvori Caspase-1-aktivering og IL-1β produktion var begge NLRP3 afhængig (figur 3I). Desuden har vi endvidere fundet, at MLAMP var hovedbestanddelen ansvarlig for NLRP3 inflammasome aktivering af M.hy
(Figur S2C). Desuden blev AIM2 inflammasome rapporteret at blive aktiveret ved DNA [38], og vi fandt, at M.hy
DNA induceret IL-1β-sekretion via AIM2 inflammasome (fig S3A). Interessant, M.hy
induceret IL-1β sekretion primært afhængig af NLRP3, mens AIM2 var kun delvist involveret (figur S3A). Tilsammen disse resultater klart vist, at M.hy
induceret IL-1β sekretion gennem aktivering af NLRP3 inflammasome i humane monocytiske celler.

mekanismerne bag M.hy
udløst NLRP3 Inflammasome Aktivering

Aktivering af NLRP3 inflammasome af en række stimuli afhænger Cathepsin B aktivitet, K ^{+ udstrømning, calciuminflux og /eller produktion af reaktive ilt arter (ROS) [11], [ ,,,0],12], [13], [39]. At udforske mekanismerne bag IL-1β frigivelse som reaktion på M.hy
udfordring, vi først anvendt Cathepsin B-specifik inhibitor CA-074 Mig og observeret en signifikant dæmpning af IL-1β sekretion på M .hy
udfordring. Ved en koncentration på 100 uM, CA-074 Me blokerede fuldstændigt IL-1β frigørelse (figur 4A). Denne inhibering skyldtes ikke nogen toksisk virkning på cellerne som IL-8 sekretion påvirkes af denne inhibitor var meget mild (Figur 4E). Vigtigt er, når cellerne blev behandlet med Cathepsin K Inhibitor I, faldt IL-1β-sekretion ikke var tydelig på alle (figur 4B og 4F), hvilket antyder, at Cathepsin B-aktivitet specifikt var involveret i NLRP3 inflammasome aktivering under M .hy
udfordring. Hertil kommer, når vi blokerede K + udstrømning ved at øge ekstracellulære K + koncentration, IL-1β sekretion af THP-1 celler efter M.hy
udfordring var signifikant reduceret på en dosis- afhængig måde (figur 4C). Igen var der ingen toksisk virkning fra KCL som IL-8-produktion fra de samme celler var normal (Figur 4G). For at finde ud af, om caiciumindstrømning hjalp inflammasome aktivering, vi tilføjet forskellige doser af EGTA i celledyrkningsmediet og fandt, at EGTA behandling blokeret M.hy
-induceret IL-1β-sekretion på en dosis-afhængig måde, og blev observeret nogen toksisk virkning fra EGTA som det fremgår af IL-8-produktion (figur 4D og 4H).}

Desuden testede vi, om M.hy
udfordring induceret ROS generation i THP-1-celler . Til dette assay blev THP-1-celler først belastet med det redox-sensitive fluorophor DCFDA og derefter udfordret med M.hy
, ATP blev inkluderet som en positiv kontrol. Som vist i figur 5A, blev påvist 16,9% CM-H2DCFDA positive celler 30 minutter efter M.hy
behandling sammenlignet med 1,6% i ubehandlede celler. Disse data antydede, at ROS kan bidrage til NLRP3 inflammasome aktivering som reaktion på M.hy
udfordring. For at verificere denne mulighed, vi forbehandlet THP-1 celler med ROS inhibitor diphenyliodonium (DPI) i 30 minutter, og derefter udfordret cellerne med M.hy
før måling af IL-1β produktion 6 timer senere. Som forventet, DPI dramatisk reduceret M.hy
induceret IL-1β frigørelse (figur 5B). En nylig undersøgelse viste, at ROS inhibitor, såsom DPI afskaffet IL-1β-frigivelse i mus makrofager ved at hæmme NLRP3 genekspression [40]. Derfor monitorerede vi også mRNA-niveauet af pro-IL-1β og NLRP3 under DPI behandling. Vi fandt, at DPI markant reduceret ekspressionen af ​​pro-IL-1β og NLRP3 (figur 5C-D), hvilket var i overensstemmelse med den konklusion fra museceller [40]. Derudover undersøgte vi også aktiveringen af ​​caspase-1 og fandt, at lave doser (1 eller 10 uM) af DPI behandling ikke påvirkede aktivering caspase-1, mens 100 uM DPI hæmmede caspase-1-aktivering (figur 5E). Dette viste, at DPI i humane celler forstyrret NLRP3 inflammasome aktivering via hæmning af NLRP3 transkription samt caspase-1 aktivitet, når høj dosis blev anvendt. Kollektivt, disse data antyder, at Cathepsin B-aktivitet, K ^{+ udstrømning, Ca 2+ tilstrømning og ROS alle bidraget til NLRP3 inflammasome aktivering som reaktion på M.hy
udfordring.}

M.hy
Aktiverer NLRP3 Inflammasome in vivo

Når museknoglemarvs dendritiske celler (BMDCs) blev inficeret med M.hy
blev en vedvarende IL-1β induktion observeret (figur 6A). Yderligere eksperimenter på BMDCs isoleret fra vildtype (WT) mus eller mus mangelfulde for caspase-1, ASC eller NLRP3 med M.hy
udfordring bekræftede, at M.hy
induktion af IL 1β var NLRP3 Inflammasome afhængig (figur 6B). Endvidere systemisk inokulation af M.hy
i WT-mus induceret IL-1β-produktion i serum og peritoneal lavage fluid (PLF), men ikke i mus, der manglede ASC eller NLRP3 (figur 6C-D). Interessant det basale niveau af IL-1β i ASC deficiente mus var klart højere end den WT eller NLRP3 deficiente mus, men udfordring med M.hy
ikke yderligere at øge udskillelsen af ​​IL-1β i sådanne mus (figur 6C-D). Kollektivt, disse resultater bekræftede, at M.hy også
aktiveret NLRP3 inflammasome i mus in vitro
in vivo
.

M. hy
induceret IL-1β Fremmer gastrisk tumor Cell Migration og invasion

ovenstående data viste klart, at M.hy
var i stand til at fremkalde IL-1β produktion fra medfødte immunceller gennem NLRP3 Inflammasome aktivering. Tidlige epidemiske undersøgelser afslørede en mulig rolle af mycoplasma i udviklingen af ​​gastrisk cancer [5]. Og Mycoplasma hyorhinis
blev demonstreret at fremme tumorceller migration, invasion og metastase in vitro
in vivo
[41]. Vi antager, at der kan eksistere en anden mekanisme til denne kampagne, som er, at M.hy
kan fremme gastrisk carcinogenese og /eller metastase ved at fremme IL-1β produktion. Og vi bekræftet, at M.hy
fremmet mavekræft celle migration og invasion (figur S5). Da M.hy
blev demonstreret at inficere gastriske kræftceller ([41], figur S4), er det således muligt at M.hy
kan fremkalde inflammasome aktivering i kræftceller direkte. Der blev imidlertid ikke inflammasome aktivering detekteret i gastriske cancerceller (fig S6).

Derefter bestemte vi effekten af ​​human rekombinant IL-1β (rIL-1β) om gastrisk cancercellelinie carcinogenese i en koloni formation assay, som afslørede, at rIL-1β ikke påvirkede udbredelsen af ​​mavekræft cellelinje MGC-803 (figur S7). Da IL-1β blev rapporteret at fremme metastase af andre tumorer [18], vi kontrollerede virkningerne af rIL-1β på migration og invasion af MGC-803 celler. Vores resultater viste, at migration og invasion MGC-803 blev forbedret med rIL-1β behandling (figur 7A og 7C), mens behandling med rIL-18 ikke havde nogen virkning (figur 7B og 7D). Dernæst behandlede vi disse gastriske cancerceller med kultursupernatanterne fra M.hy
udfordret THP-1 afledte makrofager eller makrofager med lyddæmpning af NLRP3, ASC og caspase-1 for migration og invasion assay. Vores resultater viste, at kultursupernatanterne fra M.hy
udfordret scramble makrofagceller stærkt forbedrede migration og invasion af gastriske cancerceller, mens kultursupernatanterne fra NLRP3, ASC eller caspase-1 Knockdown makrofager ikke gjorde det, sandsynligvis på grund af det formindskede IL-1β-sekretion (figur 8A og 8C). Denne øgede migration og invasion af MGC-803 celler blev afskaffet ved behandling af cellerne med anti-IL-1β mAb (figur 8B og 8D). Tilsammen vores resultater viste, at M.hy
induceret migration og invasion af mavekræft cellelinje MGC-803 ved at fremme IL-1β sekretion fra monocytiske celler. Desuden vores data viste, at M.hy
induceret inflammasome aktivering kan fremme M.hy
replikation (figur S8), som kan skabe en positiv feedback og endelig fører til kroniske sygdomme.

diskussion

Mycoplasmaer adskiller sig fra andre bakterier ved lille størrelse, minut genom og manglende cellevæg. Mange mycoplasmaer etablere kolonisering og infektion via overholdelse vært væv. Fordi deres dynamiske overflade arkitektur er antigent og funktionelt alsidig, mycoplasma er i stand til at unddrage sig vært immun angreb og tilpasning til mange levesteder og forårsage kroniske sygdomme [32]. Da identifikation af M.hy
fra svin i 1962, var lille undersøgelse udført på dette patogen indtil det viste sig at være forbundet med flere humane kræftformer [5], [41], [42], [ ,,,0],43]. For nylig fandt forskerne, at M.hy
protein P37 var ansvarlig for at fremme kræft celle invasionsevne og metastase [30], [44]. Udover denne direkte mekanisme, kan denne mikrobe også fremkalde tumorgenese eller metastase indirekte gennem en lokal kronisk inflammatorisk proces. Det er velkendt, at IL-1β er et vigtigt proinflammatorisk cytokin, der fremmer væksten af ​​kolon kræftceller og øger invasionsevne og metastase af B16 melanomceller [19], [45]. Overekspression af IL-1β viste sig at inducere gastrisk inflammation og cancer hos mus [19]. I denne undersøgelse undersøgte vi, om NLRP3 inflammasome, der kontrollerer IL-1β modning, blev aktiveret af M.hy
, og om dette aktivering kan bidrage til M.hy
associerede gastriske metastase . Vores resultater viste, at M.hy
aktiverede NLRP3 inflammasome in vitro
og in vivo
, og fremme af mavekræft celle migration og invasion af M .hy
var afhængig af NLRP3 Inflammasome aktivering. Udover NLRP3, fandt vi, at M.hy
DNA også aktiveret AIM2 inflammasome, men MLAMP aktivering af NLRP3 var den dominerende bestanddel for IL-1β induktion af M.hy.

Det blev for nylig rapporteret, at acyleret lipopeptid fra varme-dræbt mycoplasma Acholeplasma laidlawii
(HKAL) induceret IL-1β produktion gennem NLRP7 inflammasome i humane celler, mens den samlede HKAL induceret IL-1β sekretion var delvist NLRP3 afhængig [46], hvilket indikerer, at multiple inflammasomes kan aktiveres ved visse mycoplasma. Vores data ikke udelukke mulig inddragelse af NLRP7 i M.hy
induceret IL-1β produktion, men M.hy
hovedsageligt aktiveret NLRP3 inflammasome, fordi IL-1β sekretion var næsten helt afskaffet i NLRP3 tavshed celler (figur 3h til 3i).

Tidlige studier foreslog, at ROS aktiveret NLRP3 inflammasome ved at aktivere caspase-1 [47]. viste imidlertid nylig undersøgelse, at ROS-hæmmere forstyrrede transkription af IL-1β og NLRP3, men ikke påvirket aktivering af caspase-1 i museceller [40]. I vores undersøgelse, selvom ROS inhibering med lavdosis DPI (10 uM) reducerede signifikant IL-1β produktion på M.hy
udfordring, det hæmmede ikke caspase-1-spaltning, markør af inflammasome aktivering. Men når høj dosis af DPI (100 uM) blev påført, caspase-1-spaltning blev klart inhiberet (figur 5E), hvilket antyder, at høj dosis af DPI kan undertrykke samlingen af ​​inflammasome kompleks, selv om vi ikke kan udelukke en mulighed for, at denne virkning kan er blevet ført fra NLRP3 mRNA afskaffelse fra baseline (figur 5D). Det er sandsynligt, at ROS-hæmmer kan forstyrre både pro-IL-1β syntese og caspase-1-aktivering.

Hvordan M.hy
fremmer ROS produktion i makrofager stadig undvigende. Manglen på cellevæggen fra M.hy
tillader direkte kontakt af mycoplasma membran og værtscellens membran og denne kontakt kan føre til sammensmeltning af mycoplasma med eukaryot værtscelle. Denne fusion kan ikke kun føre til mycoplasma komponenter leverer i værtscellen, men også tillade indsættelse af mycoplasma membrankomponenter i membranen af ​​den eukaryote værtscelle. For nylig, M.hy
membraner viste sig at besidde Phospholipase A (PLA), der kan være involveret i plasmamembranen forstyrrelser proces, der forekommer ved invasionen af ​​værtsceller [48], [49]. Under denne proces kan værtscellerne producere ROS. Det ville være værd at undersøge, om PLA er nødvendig for M.hy
induceret ROS produktion og IL-1β sekretion.

Som det fremgår af vores data, lysosomale brud, K ^{+ efflux, Ca 2+ tilstrømning og ROS var alle involveret i M.hy
induceret NLRP3 aktivering. Som rapporteret før, K + efflux og fagolysosomale brud kan inducere Ca 2+ tilstrømning, mens Ca 2+ tilstrømning kan forårsage dysfunktion af mitokondrier, hvilket resulterer i frigivelse af oxideret mitokondrie-DNA (mtDNA) ind i cytosolen, hvor det binde til og aktivere NLRP3 inflammasome [9], [12]. Mitokondrier synes at fungere som et centralt knudepunkt for integration af diverse signaler føles af NLRP3, men det relative bidrag af ROS og mtdna for NLRP3 inflammasome aktivering er stadig ikke klart til dato [9].}

Selvom M .hy
er ikke meget virulent, kan det etablere kronisk infektion. Ved en gradvis og fremadskridende interaktion med værtsceller, det fremkalder kromosomal ustabilitet og malign transformation, hvilket vil fremme tumorvækst, migration eller invasion [50], [51]. M.hy
p37 protein fremmet mavekræft celle, prostata karcinom og melanom cellelinjer invasiv [30], [31]. Derudover kan den pro-inflammatoriske mikromiljø såsom IL-1β produktion også bidrage til denne proces [19]. Vores undersøgelse viste, at M.hy
induceret IL-1β fremmet migration og invasion af mavens kræftceller, mens M.hy
induceret IL-18 har ikke bidraget til migration og invasion af gastriske kræftceller, hvilket var anderledes end andre rapporter [26], [27]. En mulig forklaring er, at IL-18 kan have fremmet gastrisk migration og invasion kræftceller via reguleringen af ​​CD70, CD44 og VEGF-ekspression i immunceller, som fortjener vores yderligere undersøgelser [26]. En anden forklaring kunne være, at dosen af ​​rIL-18 de brugte (150 ng /ml) er langt højere end hvad vi brugte [27]. Desuden IL-1β fremmes migration og invasion af mavens cancerceller kan medieres af matrixmetalloproteinase-9 (MMP9) som andre søgende rapporteret [52]. Men for at få direkte og mere solid dokumentation og de tilsvarende mekanismer om forbindelsen mellem NLRP3 inflammasome aktivering udløst af M.hy,
og gastrisk kræft metastase, passende dyremodeller såsom in vivo
tumorinvasion assay [53] og patient undersøgelser til yderligere undersøgelse i fremtiden.

Materialer og Metoder Salg

Cellekultur

THP-1-celler, PMA-induceret makrofager og gastrisk cancercellelinie MGC-803 blev opretholdt i RPMI 1640 medium med essentielle kosttilskud. Humane monocytter blev isoleret ved Percol TM tæthed-gradient centrifugering (GE Healthcare, Bio-videnskaber, Sverige) fra Human mononukleære celler fra perifert blod (PBMC'er) opnået fra Shanghai Blood Center (Shanghai, Kina).

M.hy
stamme og PCR Detection

M.hy
stamme i vores undersøgelse blev opnået fra forurenet cellekultur. Plasma detektion blev udført gennem to runder af PCR med cellekulturmedium [54]: Først køre PCR med fire primere 5'-ACACCATGGGAGYTGGTAAT-3 ', 5'-CTTCWTCGACTTYCAGACCCAAGGCAT-3', 5'-AAAGTGGGCAATACCCAC GC-3 ', 5'-TCACGCTTAGATGCTTTCAGCG-3 'med celle dyrket medium som template. Sekund, tage 1 pi af ovenstående PCR-produkt som template og køre PCR med tre primere 5'-GTGSGGMTGGATCACCTCCT-3 ', 5'-GCATCCACCAWAWACY CTTT-3', 5'-CCACTGTGTGCCCTTTGTTCCT-3 '. Den første og anden PCR kører under den samme cyklus tilstand. Derefter sekventeret vi PCR-produktet og opnåede de følgende sekvenser: ACTCTTACTTAATTTAAAAGTTAATACAACTTTAATATT GCCTATTATTGCTAAAGATAAATATCTTAAGGTATTTTAATATTGGTAATCTATTTTAGAAATTTAATTTAAAAATTAAACTCGGTTATAAAAAAGATCGTTGAAATAATAAATATGAAGTTAATCATATTGTTATTTGCTATTCAGTTTTCAAAGAACTATAATTGAGAACTTAAAGCTCTCAAAACTAGACACGAATCGATTATGTAATAAGTCAATTAAGACTAACGGAAAGCGGAAAAAGAAGGTGATCCGTCCCCACG. Ved BLAST i NCBI database, opnåede vi de oplysninger, som mycoplasma er M.hy
. Det kan være SK76, GDL-1 eller MCLD stamme.

M.hy
Kultur, DNA Udvinding og MLAMP Forberedelse

M.hy
WAS dyrket i modificeret SP-4-medium indeholdende 20% nyfødt okseserum, 10% gærekstrakt, 1% glucose, 0,00024% phenolsulfonphthalein, og 1000 IU /ml penicillin. DNA ekstraktion fra M.hy
blev gennemført i henhold til instruktionerne med reagenserne, som Shanghai Lifefeng Biotechnology Ltd M.hy
blev kvantificeret som farveskift enheder (CCU) pr milliliter som beskrevet [55]. Udvindingen af ​​MLAMP blev udført som tidligere beskrevet [34].

Real-time PCR

NLRP3 og IL-1β-mRNA-ekspression blev bestemt ved kvantitativ realtids-PCR. Relativ kvantificering af gener blev normaliseret mod en endogen kontrol β-actin via formel [2 ^{-ΔCt (målgen-β-actin)]. De anvendte primere var: Homo sapiens (hs) IL-1β, 5'-CACGATGCACCTGTACGATCA- (fremad) 3 ', 5'-GTTGCTCCATATCC TGTCCCT- (reverse) 3'; p-actin, 5'-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG- (fremad) 3 ', 5'-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC- (reverse) 3'; NLRP3, 5'-AAGGGCCATGGACTATTTCC- (frem) 3 ', 5'-GACTCCACCCGATGACAGTT- (tilbage) 3'. M.hy
DNA-kopier blev dertermined af Quantitative real-time PCR med standard-kurve metode til absolutte kopiantal. De specifikke primere til M.hy
var:. 5'CGATTCGTGTCTAGTTTTGAG - (frem) 3 ', 5'ATTGCCTATTATTGCTAAAG - (tilbage) 3'}

ELISA

supernatanter fra dyrkede celler, museserum og muse peritoneal lavage fluid blev analyseret for cytokiner IL-1β, IL-18, IL-6 eller IL-8-sekretion ved hjælp af ELISA (BD Biosciences) ifølge producentens instruktioner.

Generation af THP-1 celler, der udtrykker shRNAs målretning gener af interesse

shRNA vektorer mod menneskelig NLRP3, caspase-1 og ASC, og deres kapløbet vektorer er gaver fra Dr. Jurg Tschopp [56]. Om dannelsen af ​​THP-1-celler, der udtrykker shRNAs, kortvarigt, nt GATGCGGAAGCTCTTCAGTTTCA af human ASC kodende sekvens, nt CAGGTTTGACTATCTGTTCT af human NLRP3 kodende sekvens, nt GTGAAGAGATCCTTCTGTA af 3'UTR af human caspase-1 blev indsat i pSUPER.

• PLoS ONE: Negativ Node Count Forbedring Prognostisk Forudsigelse af syvende udgave af TNM klassifikation for mavekræft
• PLoS ONE: Natural History af malignt knoglesygdom i Gastric Cancer: endelige resultater af en multicenter knoglemetastaser Survey