Ploche ONE: Co-Dodávka doxorubicínu a SATB1 zhrnie podľa termocitlivý Magnetické kationických lipozómov rakovina žalúdka Therapy

abstraktné

V predchádzajúcej štúdii sme vyvinuli nový systém termosenzitívny magnetickej dodávky na základe lipozómov. Cieľom tejto štúdie bolo vyhodnotiť účinnosť tohto systému pre spoločné dodávky oboch liečiv a génov do rovnakej bunky a jeho protinádorové účinky na karcinómu žalúdka. Doxorubicín (DOX) a SATB1 zhrnie vektor bol vložený do čo-doručovacej systému, a in vitro DOX aktivitu termosenzitívny uvoľňovanie, cielené umlčanie génu účinnosť, cielené bunkový príjem, in vitro cytotoxickej a aj in vivo protinádorová aktivita bola stanovená. Výsledky ukázali, že táto spolupráca zavádzací systém mal žiaduce cielené účinnosť, DOX termosenzitívny uvoľňovanie a SATB1 umlčania génu. Okrem toho, čo-dodávka DOX a SATB1 zhrnie vykazovali zvýšenú aktivitu pre inhibíciu žalúdočné rast nádorových buniek in vitro a in vivo, v porovnaní s jediným dodania. Záverom možno povedať, román termosenzitívny magnetické drog a gén ko-delivery systém má sľubnú uplatnenie v kombinovanej chemoterapii a génovej terapie pre rakovinu žalúdka

Citácia :. Peng Z, Wang C, E Fang, Lu X, Wang G, tong Q (2014) Co-Dodávka doxorubicínu a SATB1 zhrnie podľa termocitlivý magnetické kationických lipozómov rakovina žalúdka terapie. PLoS ONE 9 (3): e92924. doi: 10,1371 /journal.pone.0092924

Strih: Elena A. Rozhkov, Argonne National Laboratory, Spojené štáty |

prijatá: 04.12.2013; Prijaté: 26. februára 2014; Uverejnené: 27. marca 2014

Copyright: © 2014 Peng et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Táto štúdia bol podporený národná prírodná Science Foundation Číny (No. 81172186). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

karcinóm žalúdka je štvrtým typom rakoviny a druhou najčastejšou príčinou úmrtí na rakovinu na celom svete [1]. V roku 2008 bolo približne 989.000 nových prípadov rakoviny žalúdka a 738,000 úmrtí na svete, ku ktorému došlo najmä vo východnej, južnej a strednej Ázii; Strednej a východnej Európy; a Južnej Amerike [2], [3]. V Číne, rakovina žalúdka je tretím typom rakoviny s odhadovanými 380.000 nových prípadov a najvyššiu úmrtnosť o 26,3 na populácii 100,000 každý rok [4], [5]. Chirurgická resekcia je spoločný liečebný voľbou, ale nie je vhodné pre väčšinu pacientov, ktorí sú v pokročilom štádiu rakoviny žalúdka. Iné terapie, ako je rádioterapia a chemoterapia vykazujú určitú účinnosť, ale sú často neuspokojivé [4], [6]. Okrem toho, systémové podávanie chemoterapie spôsobuje nežiaduce účinky [7], [8].

Vzhľadom k rozvoju liekovej rezistencie k chemoterapii, tradičné chemoterapia má tiež vykazovali obmedzenú protinádorovú účinnosť [9]. Preto, multi-agent čo-doručovacia systém získal viac pozornosti v poslednej dobe, pretože by to mohlo priniesť rôzne typy činidiel na rovnakej nádorových buniek, ktoré potom vykazujú synergické protinádorové účinky. Napríklad dva rôzne chemické látky môžu byť kombinované alebo chemické činidlo môže byť kombinovaný s malou interferujúce RNA (siRNA) proti onkogénu. Okrem toho je cielená dodávka a riadené uvoľňovanie lieku môže ďalej zvýšiť protinádorové účinky a zníženie nežiaducich účinkov.

Špeciálna AT-bohaté na väzobný proteín (SATB1) je globálna chromatín organizátor, ktorý reguluje expresiu génu a podieľa sa na modulácia zhubných biologických správanie rakoviny [10]. Aberantne expresia SATB1 bolo preukázané, že podporoval rakoviny prsníka, rakoviny pľúc a lymfómu [11] - [13]. Naše predchádzajúce štúdie ukázali, že SATB1 hrá dôležitú úlohu v rakovine žalúdka, a môže byť nezávislý prognóza marker karcinómu žalúdka [14], [15]. Potlačenie expresie SATB1 doručením siRNA alebo plazmid kódujúci špecifická interferujúce RNA (krátke harpin zhrnieme) proti SATB1 môže inhibovať proliferáciu a inváziu, a podporovať apoptózu nádorových buniek [16], [17]. Tieto výsledky naznačujú, že SATB1 je potenciálnym terapeutickým cieľom pre rakovinu žalúdka.

Domnievame sa, že kombinácia génovej terapie a chemoterapia môže významne zvýšiť terapeutickú účinnosť proti rakovine žalúdka. V našej predchádzajúcej štúdii sme vyvinuli cielené termosenzitívny ko-delivery systém založený na termosenzitívnych magnetických katiónových lipozómov (TSMCL). Tým kalceínu testu uvoľňovania, mali sme optimalizovali termosenzitívny lipozomálny formulácie, a potom merali magnetické vlastnosti a dodávka gén účinnosť TSMCL. V tejto štúdii sme vložený doxorubicín a SATB1-zhrnie vektora do tohto systému pre kombináciu génovej terapie a chemoterapie, a hodnotí ich synergický protinádorový účinok proti rakovine žalúdka in vitro a in vivo.

Materiály a metódy

materiály

Cholesterol, 1,2-phosphatidylethanolamine sn-glycero-3-fosfocholin (DPPC), a 3β- [N- (N ', N'-dimethylaminoethane) karbamoyl] cholesterol (DC-Chol) boli zakúpené od firmy Avanti Polar Lipids (USA). Dimethyldioktadecylamoniumbromid (Doab) boli získané od Sigma-Aldrich (USA). Magnetic Fluid Fe _{3O 4 sa syntetizuje Galaxy Nanotech (Čína). FAM značený siRNA a plazmid pGFP-SATB1 zhrnieme boli poskytnuté GenePharma (Shanghai, Čína). Doxorubicín bol zakúpený od HISUN Pharmaceutical (Zhejiang Čína). Fetálne hovädzie sérum (FBS), kultivačné médium, penicilín /streptomycín (PEST) a trypsín boli dodané od firmy Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). SATB1 králičie monoklonálna protilátka bola od Epitomics (abca, UK). Všetky ostatné chemikálie boli analytickej čistoty komerčných a použitá bez ďalšieho čistenia.}

Príprava čo-zavádzacieho systému

Táto spolupráca dodávacej systém bol založený na termosenzitívnych katiónových lipozómov, ktoré boli pripravené na teplo citlivého katiónové formulácie DPPC, DC-cholesterolu, Doab a cholesterolu v molárnom pomere 80: 5: 5: 10 optimalizované v našich predbežných pokusoch. Lipozómy (TsCl), boli pripravené metódou tenkého filmu hydratácie, nasleduje extrúzie [18]. Metóda síran amónny Gradient bol použitý na načítanie DOX do TSCL (TSCL-DOX). Na prípravu magnetických lipozómov (TSMCL), magnetické kvapaliny Fe _{3O bolo použité 4 ako jadro a čo-zapuzdrených pufrom síranu amónneho do lipozómov. Po vytvorení tenkého filmu v banke s guľatým dnom sa pridá Jeden mililiter suspenzie železa a síranu amónneho na hydratáciu filmu, a potom sa vytláča cez polykarbonátové filtre a zaťaží sa DOX (TSMCL-DOX) metódou síranu amónneho gradientu , A konečne, výrobky z gélovej filtrácie boli centrifugovány pri 1000 g počas 15 minút pre odstránenie neopuzdrených Fe 3O 4.}

pGFP-SATB1-zhrnieme (shSATB1) vektora bola inkubovaná s rôznymi lipozómy v bez médiu bez séra pri teplote miestnosti po dobu 30 minút, na prípravu TsCl-shSATB1, TsCl-DOX-shSATB1, TSMCL-shSATB1 a TSMCL-DOX-shSATB1, resp.

Stanovenie zeta potenciálu, veľkosť častíc, a disperzity

priemerná veľkosť častíc a disperzity distribúcie veľkosti častíc lipozómov boli stanovené pri teplote 25 ° C, dynamickým rozptylom svetla pri použití ZetaPALS častíc dimenzovanie nástroja (Brookhaven Instruments Corporation, USA). Zeta potenciál liposomálnych disperziou sa merala s použitím rovnakého prístroja pri teplote 25 ° C, podľa elektroforetické pohyblivosti.

Stanovenie Doxorubicín vložený účinnosť

koncentrácia DOX v lipozómoch bola meraná fluorodenzitometrom ( Perkin Elmer, USA) s excitáciou 485 nm a 590 nm emisných filtrov s sériou riedení voľného DOX ako štandard. DOX vložený účinnosť bola vypočítaná na základe koncentrácie DOX.

diferenčné skenovacej kalorimetria (DSC)

DSC bola vykonávaná pre vyhodnotenie thermosensitivity lipozómov stanovením teplota fázového prechodu (tm). Tm bola hodnotená pomocou nano DSC (TA Instruments, USA) pri rýchlosti zahrievania 20 ° C /h s 20 mg /ml fosfolipidu.

in vitro thermosensitive teste uvoľňovania DOX

20 pl DOX naložené lipozómy boli inkubované v 1 ml PBS a PBS s 50% fetálnym hovädzím sérom (FBS), ktorý napodobňuje in vivo prostredie oddelene v Eppendorfových skúmavkách. Vzorky boli zahrievané vo vodnom kúpeli pri 37 ° C a 42 ° C po dobu 1 hodiny, v danom poradí. Potom sa intenzita fluorescencie DOX bola meraná v fluorodenzitometrom (Perkin Elmer, USA) za použitia 485 nm excitácie a 590 nm emisných filtrov. Za 100% uvoľnenie, vzorky boli inkubované v 1 ml PBS s 1% Triton X-100 po dobu 1 min. Percentá uvoľňovanie DOX bola vypočítaná nasledovne: kde F _{y bolo fluorescencie vzoriek po zahrievanie, F 0, počiatočné fluorescencie vzoriek pred zahriatím, a F 100 bola fluorescencie vzoriek spracuje Triton X-100.}

bunková kultúra

Human adenokarcinóme žalúdka MKN-28 bunková línia bola získaná od keygen Biotech (Nanjing, Čína) a kultivované v DMEM high-glukózy, doplnenom 10% FBS, 100 u /ml penicilínu a 100 ug /ml streptomycínu vo zvlhčenej atmosfére 5% CO _{2 pri teplote 37 ° C.}

In vitro prenos buniek

MKN-28 bunky boli schovať v 12-jamkové doštičky v hustote 4 x 10 ^{5 buniek /jamku a pestované cez noc, aby približne 80% zhlukovania. Nasledujúci deň boli bunky dvakrát premyté predhriatym PBS, potom TSCL-shSATB1 a TSMCL-shSATB1 bolo pridané do každej jamky a inkubuje sa po dobu 6 hodín. Bunky inkubované s TSMCL-shSATB1 boli umiestnené na 12-jamkové magnetickej dosky v priebehu prvých 30 minút, aby sa ponúknuť magnetické pole. Ďalšie inkubácie bolo médium nahradené DMEM doplnenom 10% FBS a bunky boli inkubované po dobu 24 hodín. Úroveň expresie GFP bola hodnotená na základe fluorescenčného mikroskopu (Nikon 80i) a prietokový cytometer (BD FACS Canto II).}

Real-time kvantitatívne polymerázovej reťazovej reakcie (RT-qPCR)

Celková RNA bola extrahovaná z MKN-28 buniek pomocou TRIzolu vladára (Invitrogen, Carlsbad, CA) týchto inštrukcií výrobcu a cDNA sa syntetizuje za použitia PrimeScript RT master Mix (Takara, Dalian). PCR bola vykonaná za použitia SYBR Premix Ex Taq II (Takara, Dalian) na StepOne Plus Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA). Sekvencie primérov boli nasledovné: SATB1 sense 5'-ACAGAACCCTGTGGGAGAAC-3 'a antisencie 5'-GCGTTGCTCTCCTGTTCATA-3' GADPH zmysel 5'-ACAGAACCCTGTGGGAGAAC-3 'a antisencie 5'-GCGTTGCTCTCCTGTTCATA-3'. Úroveň SATB1 mRNA je normalizované k tomu GAPDH.

Western blot analýza

MKN-28 boli bunky zozbierané a lyžovanie v RIPA pufri. Supernatanty boli zbierané po centrifugáciu pri 10000 g počas 10 min. Koncentrácia proteínu v supernatante bola stanovená pomocou testu BCA Protein Kit. Potom 40 ug vzoriek boli vykonávané na 15% SDS-PAGE a proteíny boli prenesené na PVDF membrány. Ďalej boli membrány inkubované v 5% netučného mlieka po dobu 1 hodiny na blokovanie nešpecifickej väzby a potom inkubované cez noc pri 4 ° C s SATB1 alebo p-aktínu protilátky (1: 500 riedenie). Membrány potom boli testované s HRP-konjugovanou kozie anti králičie sekundárne protilátky po dobu 30 minút. Nakoniec sa membrány boli vizualizované s rozšíreným systémom chemiluminiscencie (ECL, Pierce) a vystavený röntgenovému filmu.

In vitro hodnotenie vychytávania bunkami

Pre vyhodnotenie intracelulárnej umiestnenie dodaného DOX a pGFP-SATB1 zhrnie a lepšie prenikanie lipozómov do žalúdočných rakovinových buniek magnetickej cielené, je FAM značené siRNA (zelená fluorescencia) bol použitý pre napodobniť pGFP-SATB1 zhrnieme, a DOX samo o sebe má inštinkt červenú fluorescenciu pre sledovanie bunkové vychytávanie , MKN-28 bunky boli schovať na 12-jamkové doštičky pri 4 x 10 ^{5 buniek /jamku a pestované cez noc. Potom boli bunky inkubované s voľným siRNA, TsCl-siRNA, TSMCL-siRNA, TsCl-DOX, TSMCL-DOX, TsCl-DOX-siRNA alebo TSMCL-DOX-siRNA po dobu 6 hodín. Pre magnetické lipozómov, doštičky boli umiestnené na 12-jamkové magnetickej dosky v priebehu prvej hodiny inkubácie. Bunky boli vizualizované pod fluorescenčným mikroskopom lokalizovať fluorescenčné značky DOX a siRNA. Jadrá boli zafarbené DAPI (modrá fluorescencie).}

MTT test

MKN-28 bunky boli schovať v hustote 2 x 10 ^{4 buniek /jamku v 96-jamkových doštičkách a pestované cez noc. Bunky potom boli inkubované s rôznymi lipozómov pri teplote 37 ° C po dobu 2 hodín v CO _{2 inkubátora. Pre magnetické lipozómov, doštičky boli umiestnené do 96-jamkové magnetickej dosky v priebehu prvých 1 h inkubácie. Ďalšie boli bunky dvakrát premyté PBS a inkubované po dobu 46 hodín v čerstvom médiu. Následne sa životaschopnosť buniek bola meraná MTT testom. Médium v ​​každej jamke bolo nahradené 20 ul roztoku MTT (Sigma-Aldrich, USA) a inkubované po dobu 4 hodín pri teplote 37 ° C, potom sa supernatanty boli odstránené a formazanové kryštály sa rozpustí v 200 ul DMSO. Doštičky sa meria pri 490 nm v čítačke mikrotitračných doštičiek, a životaschopnosť buniek bola vypočítaná podľa tohto vzorca:}}

prietoková cytometria

Apoptóza bola detekovaná s použitím súpravy annexin V-FITC Apoptosis Detection (eBioscience, USA). MKN-28 bunky boli vrúbľovať do 12-jamkových doštičiek a spracuje, ako je popísané vyššie. Po 24 hodinách boli bunky zhromaždené, premyté dvakrát PBS a suspendované v 500 ul pufru Binding Buffer. Ďalšie boli bunky dvojito zafarbené annexinu V-FITC a propidium jodidu (PI). Bunky v ranej fáze apoptózy zafarbené annexin V-FITC, ale nie zafarbené PI boli kvantifikované prietokovú cytometery.

xenoimplantátu myš modelovej

Päť až šesť týždňov staré mužskej Balb /c nahých myší bolo poskytnuté centra pre pokusoch na zvieratách z Tongji Medical College. Bolo každej myši Inokulované podkožne do pravého boku 5 x 10 ^{6 MKN-28 bunkách. Niekoľko týždňov po inokulácii nádoru, 36 myší nesúcich nádor boli náhodne rozdelené do šiestich skupín (n = 6). Myši boli injekčne cez chvostovej žily s ponukou DOX, TSMCL-DOX, TSMCL-shSATB1, TSCL-DOX-shSATB1, TSMCL-DOX-shSATB1 alebo fyziologickým roztokom ako kontrolou. Dávka DOX bola 2,5 mg /kg, a to pGFP-SATB1 zhrnieme bola 10 ug na myš. Liečba bola raz za 3 dni a tumor veľkosť sa meria pomocou calipering a potom by bolo možné vypočítať objem nádoru podľa nasledujúceho vzorca: Objem = (D _{Min) 2 x D max /2, kde D Max bol najdlhší priemer nádoru a D Min bola najkratšia. Pre TSMCL-DOX, TSMCL-shSATB1 a TSMCL-DOX-shSATB1, magnetické cielenie bolo dosiahnuté použitím pokračovanie vonkajšieho magnetického poľa 5000 Gauss za 30 min so zameraním na nádoru po podaní lieku. Všetky experimenty boli schválené etickou komisiou Tongji Medical College a všetky zvieratá boli ošetrené humánnym v súlade s pokynmi Institutional Animal Care and Use výboru.}}

Štatistická analýza

Údaje boli vyjadrené ako priemer ± smerodajná odchýlka (SD). Štatistická významnosť medzi skupinami bola hodnotená pomocou Studentovho t-testu a analýzou jedného faktora rozptylu (ANOVA). Za dobu prežitia zvierat, boli stanovené a log rank test Kaplan-Meierove krivky z každej skupiny bola vykonaná pre porovnanie prežitie. p menšie ako 0,05 bola považovaná za štatisticky významnú

Výsledky

Charakterizácia lipozómov

Ako je uvedené v tabuľke 1, je priemer TSCL bola 83,6 ± 5,7 nm, zatiaľ čo TSCL. -DOX sa zvýši na 118,5 ± 7,9 nm v dôsledku zapuzdrenie DOX. Medzitým priemery TSCL-shSATB1 a TSCL-DOX-shSATB1 významne zvýšil na 161,1 ± 11,8 nm a 238,1 ± 20,6 nm, v danom poradí, v dôsledku adhézie a fúzie plazmidovej DNA do lipozómov. Pre magnetické lipozómov, veľkosti častíc TSMCL, TSMCL-DOX, TSMCL-shSATB1 a TSMCL-DOX-shSATB1 boli 135,0 ± 11,6 nm, 157,2 ± 14,3 nm, 221,3 ± 15,7 nm a 319,4 ± 20,1 nm, v danom poradí, podstatne väčšie, než je TSCL, TSCL-DOX, TSCL-shSATB1 a TSCL-DOX-shSATB1 vzhľadom k zachyteniu magnetických nanočastíc. Okrem toho je veľkosť TSMCL-shSATB1 a TSMCL-DOX-shSATB1 bola výrazne väčšia, že z TSMCL a TSMCL-DOX, v danom poradí (p 0,05). Všetky lipozómy mal úzku distribúciu veľkosti, pretože ich disperzity boli nie viac ako 0,3.

Zeta potenciály TSCL, TSCL-DOX, TSCL-shSATB1 a TSCL-DOX-shSATB1 boli 52,0 ± 7,3 mV, 50,1 ± 7,7 mV, 31,3 ± 5,2 mV a 26,7 ± 4,5 mV, v danom poradí. Po inkubácii s pGFP-SATB1- zhrnieme, povrchové náboje výrazne znížil (p menšie ako 0,05), v dôsledku elektrostatické interakcie medzi katiónovými lipidmi a plazmidovej DNA. Avšak, zachytenie magnetických nanočastíc neviedlo k výraznému poklesu zeta potenciál v magnetických lipozómy.

DOX vloženého účinnosť, zapouzdřující rýchlosť DOX bola 89 ± 3% a 78 ± 8% (n = 3) pre TSCL-DOX a TSMCL-DOX, v tomto poradí, a bola 85 ± 7% a 73 ± 9% (n = 3) pre TSCL-DOX-shSATB1 a TSMCL-DOX-shSATB1, v danom poradí. Tieto údaje naznačujú, že interakcia medzi lipozómov a plazmidom nemala mať za následok únik DOX.

The thermosensitivity lipozómov

diferenčné skenovacej kalorimetria bola vykonaná pre určenie fázového prechodu teplotu TSCL. Ako je znázornené na Obr. 1, TsCl v zložení DPPC, DC-cholesterolu, Doab a cholesterolu v molárnom pomere 80: 5: 5: 10 mal Tm 40,8 ° C, s pomerne širšie prechodové špičky, ktoré môžu byť fúzny prechod vrchol DPPC a Doab .

In vitro termosenzitívny DOX uvoľnenie z lipozómy

Ako je znázornené na obr. 2, rýchlosť uvoľňovania DOX z TSCL-DOX a TSMCL-DOX bola iba 12% a 16% po inkubácii s PBS pri 37 ° C, a zvýšiť na 20% a 19% po inkubácii s 50% FBS, v danom poradí. Pre TSCL-DOX-shSATB1 a TSMCL-DOX-shSATB1, rýchlosť uvoľňovania DOX bola 12% a 15% po inkubácii s PBS pri 37 ° C, a to ako 16% po inkubácii s 50% FBS, čo ukazuje, že začlenenie plazmidu mal žiadny významný vplyv na stabilitu lipozómov (p 0,05).

DOX rýchlosť uvoľňovania z TSCL-DOX a TSMCL-DOX bola zvýšená na 37% po inkubácii s PBS pri 42 ° C, a sa zvýšil na 45% a 49% po inkubácii s 50% FBS, resp. Pre TSCL-DOX-shSATB1 a TSMCL-DOX-shSATB1, rýchlosť uvoľňovania DOX bola 35% a 43% po inkubácii s PBS a FBS pri 42 ° C, v danom poradí, a to ako výrazne vyššie ako pri teplote 37 ° C (p menšie ako 0,05). Tieto výsledky ukazujú, že TsCl-DOX, TSMCL-DOX, TsCl-DOX-shSATB1 a TSMCL-DOX-shSATB1 majú žiaduce thermosensitivity, a môže byť použitý pre hypertermiu spustená riadiace uvoľňovanie DOX.

Umlčanie SATB1 expresie v MKN-28 buniek transfekciou s lipozómy

Ďalej sme vyhodnotili účinnosť lipozómov dodať shSATB1 vektora do MNK-28 buniek. Typické fluorescenčné obrazy buniek transfektovaných TSCL-shSATB1 a TSMCL-shSATB1 bolo znázornené na obr. 3A. Analýza prietokovou cytometriou ukázalo, že účinnosť transfekcia TSCL-shSATB1 bolo len 15,4 ± 0,15%. Avšak, po aplikácii magnetického poľa vedenia, účinnosť transfekcia TSMCL-shSATB1 bola 34,3 ± 0,93%, výrazne vyššie ako TSCL-shSATB1 (obr. 3b).

Ak chcete zistiť, či dodaný shSATB1 vektora mohol sprostredkovať umlčanie SATB1 expresiu v MKN-28 bunkách, sme vykonali real-time kvantitatívnej PCR a blot analýza Western. Výsledky ukázali, že obe SATB1 mRNA a proteínové hladiny znížil v bunkách transfekciou TSCL-shSATB1 a TSMCL-shSATB1, v porovnaní s kontrolnými bunkami. Okrem toho, TSMCL-shSATB1 s pomocou magnetického poľa bola účinnejšia ako TSCL-shSATB1 inhibovať SATB1 expresie v MKN-28 bunkách (obr. 3C, D).

Magnetic cielené in vitro bunkový príjem

pre porovnanie prestupov do buniek medzi nemagnetických a magnetické lipozómov s aplikáciou magnetického cielené vedenie, ako aj intracelulárne umiestnenie dodávaného DOX a shSATB1, FAM značené siRNA bola použitá ako indikátor. Neprítomnosť zelenej fluorescencie v bunkách ošetrených s ponukou siRNA je uvedené, že to nemohlo preniknúť do buniek (dáta nie sú ukázaná). Pozorovali sme, že ďalšie bunky ošetrené TSMCL-siRNA vykazovali zelenej fluorescencie než buniek ošetrených TSCL-siRNA (Obr. 4A). Okrem toho, ďalšie bunky ošetrené TSMCL-DOX ukázal červenú fluorescenciu, než buniek ošetrených TSCL-DOX (obr. 4B). V bunkách ošetrených TSMCL-DOX-siRNA, vysoká intenzita fluorescencie bola pozorovaná, a bunky sa objavil ružový dôsledku zlúčenia modrej, červenej a zelenej farbe (obr. 4C). Tieto pozorovania naznačujú, že TSMCL je účinnejší pri poskytovaní siRNA a DOX do buniek ako TSCL, po aplikácii magnetického poľa.

Ďalej sme skúmali intracelulárnej umiestnenie dodaného DOX a siRNA. Červená fluorescencie bola pozorovaná v oboch jadier a cytoplazmy, čo znamená, že dodáva DOX bol umiestnený v oboch jadier a cytoplazmy. Naproti tomu, zelená fluorescencie sa objavil v prvom rade v cytoplazme, čo naznačuje, že siRNA boli dodané do cytoplazmy (obr. 4D). Zlúčenie červenej a zelenej objavil žltý v cytoplazme, a zlúčenie modrej a červenej objavil levandule v jadrách. Dohromady tieto údaje naznačujú, že ako TSCL a TSMCL môžu prenikať do buniek karcinómu žalúdka a dodať svoj obsah do cytoplazmy (DOX a siRNA) a jadra (DOX).

In vitro protinádorové účinky z nasledujúcich lipozómy

Vyhodnotili sme in vitro protinádorové účinky tohto ko-zavádzacieho systému podľa cytotoxicity a indukcie apoptózy činnosti. Cytotoxicita lipozómov bola hodnotená testom MTT. Na stanovenie účinkov koncentrácie DOX a plazmidu na cytotoxicitu lipozómov, sme sa zaoberali lipozómy naložené s rôznymi koncentráciami DOX a rôznymi množstvami SATB1 zhrnieme. S nárastom koncentrácie DOX, cytotoxicita lipozómov bola zvýšená (obr. 5A). Avšak pridávanie koncentrácia SATB1 zhrnieme neviedla k zvýšeniu cytotoxicity, a tam boli len mierne zvýšiť cytotoxicity, keď koncentrácia SATB1 zhrnieme bola asi 4 ug (Obr. 5B). Tak sme použili 25 mikrónov DOX a 4 mikrogramov SATB1 zhrnieme porovnať cytotoxicitu medzi ponukou DOX, Voľný zhrnieme, TSCL, TSMCL, TSCL-DOX, TSMCL-DOX, TSCL-shSATB1, TSMCL-shSATB1, TSCL-DOX-shSATB1 a TSMCL- DOX-shSATB1.

Ako je znázornené na obr. 5C, bez zhrnieme, TSCL a TSMCL mal malú toxicitu. Životaschopnosť buniek bola 40,3 ± 3,4%, 73,6 ± 3,5% a 51,3 ± 4,5% zadarmo DOX, TSCL-DOX a TSMCL-DOX, v uvedenom poradí, čo naznačuje, že cytotoxicitu TSMCL-DOX bola vyššia ako TSCL-DOX, ale nižšie ako voľného DOX , Životaschopnosť buniek bola 79,2 ± 6,9% a 71,6 ± 4,7% pre TSCL-shSATB1 a TSMCL-shSATB1, respektíve bez náznakov štatistickej významnosti (p > 0,05). U drog a génovej spolupráce dodávky životaschopnosť buniek bolo len 35,0 ± 3,2% a 22,3 ± 3,4% pre TSCL-DOX-zhrnie a TSMCL-DOX-zhrnieme, respektíve výrazne nižšia ako u voľného DOX, TSCL-DOX, TSMCL- DOX a SATB1shRNA naložené lipozómy (P 0,05). Okrem toho, životaschopnosť buniek z TSMCL-DOX-zhrnieme bola významne nižšia ako u TSCL-DOX-zhrnieme (p menšie ako 0,05). Tieto výsledky naznačujú, že synergický cytotoxicita efekt je dosiahnutý tým, čo-poskytuje DOX a SATB1 zhrnie. Okrem toho, s použitím magnetickej cielené, možno získať ďalšie zvýšené cytotoxicity.

Ak chcete určiť ďalšie protinádorový mechanizmus okrem cytotoxicity čo-dodávkového systému, sme skúmali mieru apoptózu MKN-28 bunky ošetrené voľného DOX, TsCl-DOX, TSMCL-DOX, TsCl-shSATB1, TSMCL-shSATB1, TsCl-DOX-shSATB1 a TSMCL-DOX-shSATB1 pomocou prietokovej cytometrie. Ako je vidieť na Obr. 5D, apoptóza predstavovala 22,3% u buniek ošetrených s ponukou DOX, bol 8,9% v bunkách ošetrených s TsCl-DOX, ale zvýšila na 13,4% v bunkách ošetrených TSMCL-DOX a magnetického poľa. Podobne, apoptóza rýchlosť bola 9,4% v bunkách ošetrených s TsCl-shSATB1, ale zvýšila na 17,4% v bunkách ošetrených TSMCL-shSATB1 a magnetického poľa. Naproti tomu, apoptóza predstavovala v bunkách ošetrených s TsCl-DOX-shSATB1 27,7%, vyššie ako v bunkách ošetrených TSCL zaťaženými DOX alebo shSATB1 samotného. Miera apoptóza bola v bunkách ošetrených TSMCL-DOX-shSATB1, najvyššiu zo všetkých skupín 32,4%. Tieto výsledky ukazujú, že spolupráca prináša DOX a SATB1 zhrnie vedie ku kombinovaným vplyvom indukcie apoptózy. Stručne povedané, tento ko-delivery systém vykazuje silné protinádorové účinky in vitro.

in vivo protinádorovú aktivitu lipozómov

Na stanovenie in vivo protinádorovú aktivitu o čo-dodávkového systému, sme založili MKN-28 myších modelov xenoštěpu a injekčne zadarmo DOX, TSMCL-DOX, TSCML-shSATB1, TSCL-DOX-shSATB1 alebo TSMCL-DOX-shSATB1 do myšou cez chvostovej žily. Liečba bola raz za 3 dni, a nádory boli vybraté (obr. 6A). 15. deň, objem nádoru bol 0,44 ± 0,05 cm ^{3 u myší ošetrených TSMCL-DOX-shSATB1, podstatne nižšia, než vo fyziologickom skupine (2,14 ± 0,23 cm 3), voľný DOX skupina (1,08 ± 0,13 cm 3), TSMCL-DOX skupina (0,68 ± 0,10 cm 3), TSCML-shSATB1 skupina (1,43 ± 0,21 cm 3), a TSCL-DOX-shSATB1 skupiny (0,77 ± 0,12 cm 3) (obr. 6B).}

Okrem toho, ako je znázornené na obr. 6 (C), stredná doba pre objem nádoru dosiahol hodnotu 2 cm ^{3 bol 30 dní v skupine TSMCL-DOX-shSATB1, dlhšie, než je v soľnom skupiny, Voľný DOX skupina, TSMCL-DOX skupina, skupina TSCML-shSATB1 a TSCL-DOX-shSATB1 skupina (obr. 6C). Dohromady tieto výsledky naznačujú, že spolupráca prináša DOX a shSATB1 podľa TSMCL vykazuje synergický protinádorový účinok in vivo.}

Diskusia

Napriek nedávnemu vývoju chirurgii, rádioterapii a zamerať terapia, chemoterapia stále jedným z dôležitých prístupov k liečbe rakoviny žalúdka. Avšak, terapeutické účinky chemoterapie sú často nespokojní a nemôže výrazne zlepšiť prognózu pacientov s rakovinou [19]. Jedným z hlavných dôvodov je tvorbe nádorov a progresie karcinómu žalúdka zahŕňa rad rôznych mechanizmov; unitárny proti tumor mechanizmus tradičné chemoterapiou má obmedzené ich terapeutické účinky, teda kombinácia chemoterapie s génovej terapie môže zlepšiť protinádorové účinky. Ďalšie prekážkou chemoterapia je, že systémové podávanie drog vedie k obmedzenej koncentrácie liečiva v nádorových miestach zároveň pôsobiť veľa nežiaducich účinkov [8]. Kľúčom k riešeniu týchto problémov sa opiera o nové spôsoby podávania liekov, teda rozvoja cielených multi-činidla dodávajúca systém, ktorý môže byť priamo vedené do miesta nádoru s riadeným uvoľňovaním môže prekonať tieto problémy a zlepšiť terapeutický účinok [20] - [25] .

Medzi rôznymi systémami podávania liekov, lipozómy sú najsľubnejšie pre dobré biocompatibilities, ktoré spôsobujú malú alebo žiadnu antigénne alergické a toxické reakcie a ľahko podstúpiť biodegradácii. Ako ako liečiv a génov nosiče, lipozómy môžu nielen chráni hostiteľa pred nežiaducimi účinkami zapuzdreného liečiva, ale tiež zabrániť tomu, aby zachytené obsah z predčasné inaktiváciu podľa fyziologickom prostredí [26]. Okrem toho, lipozóm je potenciálne cielený systém podávania lieku, či je dosiahnuté zvýšenie priepustnosti a zadržiavanie (EPR) účinku (Passive cielená), alebo pomocou magnetického poľa a vedením imunitný pripojenie (proaktívne) [27]. Okrem toho niektoré lipozómy posadne kontrolovanej spúšťa vlastnosti uvoľňovanie liečiv, ako sú tepelne citlivosť, citlivosť pH a mikrovlnnou citlivosťou.

V poslednej dobe sme vyvinuli nový magnetický cielené termosenzitívny systému ko-podanie liečiva, a gén (TSMCL). na elektroneutrální termocitlivý formuláciu (DPPC: Cholesterol = 80:20) súdime, pridal rôzne katiónové komponenty a optimalizovali thermosensitivity lipozómov testom uvoľňovania kalceínu. Výsledky uviedla, že by sme mohli získať žiaduce thermosensitivity tým, že nahradí 10 mol dielov cholesterolu o 5 mol dielov DC-cholesterolu a 5 mol dielov Doab (DPPC: DC-Cholesterol: DOAB: Cholesterol = 80: 5: 5: 10), a uvoľnenie kalceínu z lipozómov by bola nižšia pri teplote 37 ° C, ale významne vyššia pri teplote 42 ° C v tejto formulácii. Ďalšie, magnetické kvapaliny, Fe _{3O 4 bol použitý ako jadro a fungovala ako magnetická zacielenia a vykurovací zdroj TSMCL. Vibračné Sample Magnetometer (VSM) meranie uviedla, že magnetická kvapalina Fe 3O 4 bol superparamagnetické, tak by musel TSMCL dobré magnetické cielené účinky. Medzitým sa vykurovacia krivka časovo závislé tiež ukázali, že obe magnetické kvapaliny, Fe 3O 4 a TSMCL by mohol byť zahrievaný z 25 ° C na 42 ° C počas 20 minút. S pomocou magnetickej kvapaliny, Fe 3O 4, a to ako magnetické cielenie a teploty spúšťa uvoľňovanie liečiva z TSMCL by mohla byť realizovaná. A konečne, ako TSCL a TSMCL vystavovala typické lipozomálny morfológia a dobrej distribúcie pod TEM. na úspešnú konštrukciu TSMCL na báze, v tejto štúdii sme vložený DOX a SATB1 zhrnie vektora do TSMCL aby TSMCL-DOX-shSATB1 a vyhodnotené na protinádorové účinky proti buniek karcinómu žalúdka in vitro a in vivo.}

DOX je bežne používaný liek v chemoterapii s vysokou účinnosťou pre inhibíciu proliferácie nádorových buniek a indukovať apoptózu nádorových buniek, ale jeho terapeutické účinky sú obmedzené v dôsledku závažnej kardiotoxicity a myelosupresie pri podávaný systémovo [28]. Hoci DOX lipozómy majú čiastočne zlepšili situáciu, nedostatok cielený transport stále limites ich využitie [29]. SATB1 je globálna chromatínu organizátor, ktorý priamo reguluje expresiu ERRB2, MMP2, ABL1 a E-cadherinu pôsobiť ako kľúčový regulátor vývoja rakoviny [30]. Nadmerná expresia SATB1 v rôznych nádoroch bolo spojené s malígnymi biologické správanie, ako inváziu, proliferáciu a metastáz [10] - [13]. Umlčanie SATB1 expresiu malé interferujúce RNA (siRNA) alebo plazmidu kódujúceho krátky harpin RNA (zhrnieme) môže inhibovať, proliferácie, invázie a metastáz, a apoptózu rôznych nádorových buniek [16], [17]. Z tohto dôvodu, SATB1 stáva potenciálnym cieľom pre liečbu rakoviny [30]. Avšak, vhodné dodacie vektory pre siRNA alebo zhrnieme, sú dôležité pre SATB1 cielenú génovú terapiu rakoviny.

V tejto štúdii, za použitia systému TSMCL-DOX-shSATB1, ako DOX a SATB1 zhrnie vektor by mohol byť vedený do nádoru mieste za magnetického podanej vedenie, a DOX bol prepustený v hypertermiu spustil spôsobom. Hypertermia spúšťa uvoľňovanie závisí na termosenzitívnych lipozómov, ktoré sú prevažne zložené z Dipalmitoyphosphocholine (DPPC), ktorá prechádza gél na kvapalné kryštalická fáza prechodu (TM), ktorá sa stáva veľmi deravý na malé vo vode rozpustné molekuly pri 41 ° C [31]. Lipozómy zložené z odlišného DPPC a lipidov majú odlišné Tm a thermosensitivity [32]. DSC analýza ukázala, že Tm nášho zavádzacieho systému bola 40,8 ° C, a stanovenie obsahu DOX uvoľňovania uviedla, že je stabilná pri teplote 37 ° C, zatiaľ čo DOX sa uvoľní, keď sa teplota zvýši na 42 ° C.

• Ploche ONE: Vyjadrenie rodiny EGF v žalúdočnej rakovine znižujúce množstvo HER4 a jej Aktivácia Ligand NRG4
• Ploche ONE: Román Funkčné TagSNP Rs7560488 v DNMT3A1 usporiadateľa je spojená s náchylnosťou k rakovine žalúdka moduláciou Promoter Activity