PLOS ONE: Co-Entrega de Doxorrubicina e SATB1 shRNA por termossensível Magnetic catiônica lipossomas para câncer gástrico Therapy

Abstract

Em um estudo anterior, que havia desenvolvido um novo sistema de entrega magnética termossensível baseado em lipossomas. Este estudo teve como objetivo avaliar a eficiência deste sistema de co-entrega de drogas e genes à mesma célula e seus efeitos anti-tumorais em câncer gástrico. A doxorubicina (DOX) e SATB1 shRNA vector foram carregados no sistema de co-distribuição, e na actividade de libertação termossensível vitro de DOX, gene alvo silenciando a eficiência, a absorção celular específica, foram determinados da citotoxicidade in vitro, bem como actividade anti-tumoral in vivo. Os resultados mostraram que este sistema de co-entrega teve eficácia desejável alvejado entrega, DOX libertação termossensível e SATB1 silenciamento do gene. Além disso, a co-entrega de DOX e SATB1 shRNA exibiu actividade melhorada para inibir o crescimento de células de cancro gástrico in vitro e in vivo, em comparação com a entrega única. Em conclusão, o novo sistema de drogas magnética e co-entrega do gene termossensível tem aplicação promissora na quimioterapia combinada e terapia genética para câncer gástrico

Citation:. Peng Z, Wang C, Fang E, Lu X, Wang G, Tong Q (2014) Co-Entrega de doxorrubicina e SATB1 shRNA por termossensível Magnetic catiônica lipossomas de Terapia câncer gástrico. PLoS ONE 9 (3): e92924. doi: 10.1371 /journal.pone.0092924

editor: Elena A. Rozhkova, Argonne National Laboratory, Estados Unidos da América

Recebido: 04 de dezembro de 2013; Aceito: 26 de fevereiro de 2014; Publicação: 27 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Peng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (No. 81.172.186). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico é o quarto tipo de câncer comum e a segunda principal causa de morte por câncer em todo o mundo [1]. Em 2008, havia cerca de 989 mil novos casos de câncer gástrico e 738,000 mortes no mundo que ocorreu principalmente no Leste, Sul, e na Ásia Central; Europa Central e Oriental; e América do Sul [2], [3]. Na China, o câncer gástrico é o terceiro câncer comum com estimados 380.000 novos casos e uma taxa de mortalidade mais elevada cerca de 26,3 por população de 100.000 a cada ano [4], [5]. A ressecção cirúrgica é a opção curativa comum, mas não é adequado para a maioria de pacientes que estão em fase avançada de cancro gástrico. Outras terapias tais como quimioterapia e radioterapia mostra alguma eficácia, mas são muitas vezes insatisfatórios [4], [6]. Além disso, a administração sistémica de quimioterapia provoca efeitos adversos [7], [8].

Devido ao desenvolvimento de resistência ao fármaco da quimioterapia, quimioterapia tradicional também exibiram eficácia antitumoral limitada [9]. Portanto, multi-agente de sistema de co-entrega ganhou mais atenção recentemente, porque poderia fornecer diferentes tipos de agentes para as mesmas células tumorais, que, em seguida, exibem efeitos antitumorais sinérgicos. Por exemplo, dois agentes químicos diferentes podem ser combinados ou um agente químico pode ser combinado com pequeno ARN interferente (siRNA) contra um oncogene. Além disso, a administração direccionada e libertação controlada de fármaco, pode aumentar ainda mais os efeitos anti-tumorais e reduzir efeitos adversos.

especial rica em AT proteína de ligação (SATB1) é um organizador de cromatina global que regula a expressão de genes e está envolvido na modulação de comportamentos biológicos malignos de câncer [10]. expressão aberrante de SATB1 foi mostrado para o cancro promovido da mama, cancro do pulmão e linfomas [11] - [13]. Os nossos estudos anteriores mostraram que SATB1 desempenha um papel importante no cancro gástrico, e pode ser um marcador prognóstico para cancro gástrico independente [14], [15]. Suprimindo a expressão da SATB1 entregando siRNA ou plasmídeo que codifica específica interferente curto ARN harpina (shRNA) contra SATB1 poderia inibir a proliferação e invasão, e promovem a apoptose de células de tumor [16], [17]. Estes resultados sugerem que SATB1 é um potencial alvo terapêutico para o cancro gástrico.

Especula-se que a combinação de quimioterapia e terapia de gene pode melhorar significativamente a eficácia terapêutica contra o cancro gástrico. Em nosso estudo anterior, foi desenvolvido um sistema de co-delivery termossensível alvejado baseado em lipossomas catiônicos magnéticos termossensíveis (TSMCL). Por calceína ensaio de libertação, que tinha otimizado a formulação lipossomal termossensível, e então mediram as propriedades magnéticas e entrega do gene eficiência do TSMCL. Neste estudo, foram carregados doxorrubicina e SATB1-shRNA vector no presente sistema para a combinação da terapia genética e quimioterapia, e avaliado o seu efeito anti-tumoral sinérgico contra o cancro gástrico, in vitro e in vivo.

Materiais e Métodos

Materiais

colesterol, 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), e 3β- [N- (N ', N'-dimetilaminoetano) -carbamoil] colesterol (DC-Chol) foram adquiridos a Avanti Polar Lipids (USA). brometo de dimetildioctadecilamónio (Doab) foram obtidos a partir de Sigma-Aldrich (EUA). Magnetic Fluid Fe _{3O 4 foi sintetizado pelo Galaxy Nanotech (China). FAM marcado siRNA e plasmídeo pGFP-SATB1 shRNA foram fornecidos pela GenePharma (Xangai, China). A doxorrubicina foi comprado de Hisun Pharmaceutical (Zhejiang China). soro fetal de bovino (FBS), meios de cultura, penicilina /estreptomicina (PEST) e tripsina foram fornecidos por Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA). anticorpo monoclonal de coelho foi de SATB1 Epitomics (Abcam, Reino Unido). Todos os outros produtos químicos eram de grau analítico comerciais e utilizados sem purificação adicional.}

Preparação do sistema de co-entrega

Este sistema de co-entrega foi baseada em lipossomas catiónicos termossensíveis, os quais foram preparados com uma termossensível formulação catiónica de DPPC, DC-colesterol, Doab e colesterol numa proporção molar de 80:5:5:10 optimizada nas nossas experiências preliminares. Os lipossomas (TsCl) foram preparados pelo método de hidratação de película fina, seguido por extrusão [18]. O método de gradiente de sulfato de amónio foi usado para carregar DOX em TsCl (TsCl-DOX). Para preparar lipossomas magnéticos (TSMCL), fluido magnético Fe _{3O 4 foi utilizado como o núcleo e co-encapsulados com tampão de sulfato de amónio para os lipossomas. Após a formação da película fina no balão de fundo redondo, foi adicionado um mililitro de suspensão de ferro e sulfato de amónio para hidratar o filme, e em seguida extrudida através dos filtros de policarbonato e carregado com DOX (TSMCL-DOX) pelo método de gradiente de sulfato de amónio . Finalmente, os produtos a partir da filtração em gel foram centrifugados a 1000 g durante 15 min para remover não encapsulado Fe 3O 4.}

pGFP-SATB1-shRNA (shSATB1) vector foi incubado com diferentes em lipossomas meio isento de soro à temperatura ambiente durante 30 minutos, para preparar-TsCl shSATB1, TsCl-DOX-shSATB1, TSMCL-shSATB1 e TSMCL-DOX-shSATB1, respectivamente.

Determinação do potencial zeta, tamanho de partícula, e polidispersividade

o tamanho médio das partículas e a polidispersibilidade da distribuição de tamanho de partículas dos lipossomas foram determinados a 25 ° C por dispersão dinâmica da luz utilizando um ZetaPALS tornando dimensionamento de partículas (Brookhaven Instruments Corporation, EUA). O potencial zeta das dispersões lipossomais foi medida usando o mesmo instrumento a 25 ° C através da mobilidade electroforética.

Determinação da doxorrubicina carregado eficiência

concentração de DOX nos lipossomas foi medida por um fluorímetro ( Perkin Elmer, EUA) com 485 nm de excitação e 590 nm de emissão filtros com uma série de diluições de DOX livre como padrão. DOX carregado eficiência foi calculada com base na concentração de DOX.

Calorimetria de Varrimento Diferencial (DSC)

DSC foi realizada para avaliar a termossensibilidade de lipossomas através da determinação da temperatura de transição de fase (Tm). Tm foi avaliada utilizando uma DSC nano (TA Instruments, EUA) a uma taxa de aquecimento de 20 ° C /h com 20 mg /ml fosfolipídios.

in vitro termossensíveis ensaio de libertação de DOX

20 l DOX lipossomas carregados foram incubadas em 1 ml de PBS e PBS com soro a 50% de bovino fetal (FBS) que imita o ambiente in vivo separadamente em tubos Eppendorf. As amostras foram aquecidas em banho de água a 37 ° C e 42 ° C durante 1 h, respectivamente. Em seguida, a intensidade de fluorescência de DOX foi medida num fluorímetro (Perkin Elmer, EUA), utilizando 485 nm de excitação e 590 nm de emissão filtros. Para libertação de 100%, as amostras foram incubadas em 1 ml de PBS com 1% de Triton X-100 durante 1 min. As percentagens de libertação DOX foram calculados como se segue: em que F _{s foi a fluorescência das amostras após o aquecimento, F 0 foi a fluorescência inicial de amostras antes do aquecimento, e F 100 foi a fluorescência das amostras tratadas com Triton X-100.}

cultura celular

linha de células de adenocarcinoma gástrico humano MKN-28 foi adquirido a kEYGEN Biotech (Nanjing, China) e cultivadas em DMEM-elevado teor de glucose suplementado com FBS a 10%, 100 U /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina, em atmosfera humidificada de 5% de CO _{2 a 37 ° C.}

in vitro de células de transfecção

MKN-28 as células foram semeadas em placas de 12 poços a uma densidade de 4 x 10 ^{5 células /poço e cultivadas durante a noite a aproximadamente 80% de confluência. No dia seguinte, as células foram lavadas duas vezes com PBS pré-aquecido, em seguida, TsCl-shSATB1 e TSMCL-shSATB1 foram adicionados a cada poço e incubou-se durante 6 h. As células incubadas com TSMCL-shSATB1 foram posicionados em 12 poços da placa magnética durante os primeiros 30 min para oferecer um campo magnético. Em seguida, o meio de incubação foi substituído com DMEM suplementado com FBS a 10% e as células foram incubadas durante 24 h. nível de expressão da GFP foi avaliada ao microscópio de fluorescência Nikon (80i) e de fluxo FACSCalibur (BD FACS Canto II).}

em tempo real da reacção em cadeia da polimerase quantitativa (RT-qPCR)

O ARN total foi extraído a partir de células MKN-28 usando TRIzol regente (Invitrogen, Carlsbad, CA) seguindo as instruções do fabricante, e cDNA foi sintetizado usando PrimeScript RT Mestre MIX (Takara, Dalian). A PCR foi realizada utilizando SYBR Premix Ex Taq II (Takara, Dalian) em um Real-Time PCR System StepOne Plus (Applied Biosystems, EUA). As sequências dos iniciadores eram as seguintes: 5'-sentido SATB1 ACAGAACCCTGTGGGAGAAC-3 ', e anti-sentido 5'-GCGTTGCTCTCCTGTTCATA-3' 5'-GADPH sentido ACAGAACCCTGTGGGAGAAC-3 ', e anti-sentido 5'-GCGTTGCTCTCCTGTTCATA-3'. nível de ARNm SATB1 foi normalizada para a da GAPDH.

análise Western blot

MKN-28 as células foram colhidas e lisadas em tampão RIPA. Os sobrenadantes foram recolhidos após centrifugação a 10000 g durante 10 min. A concentração de proteína do sobrenadante foi determinada utilizando um Kit BCA Protein Assay. Em seguida, 40 ug de amostras foram corridos em 15% SDS-PAGE e as proteínas foram transferidas para membranas de PVDF. Em seguida, as membranas foram incubadas em leite magro a 5% durante 1 h para bloquear a ligação inespecífica e depois incubadas durante a noite a 4 ° C com anticorpo ou SATB1 β-actina (diluição 1:500). As membranas foram então sondadas com anticorpo secundário de cabra anti-coelho conjugado com HRP durante 30 min. Finalmente, as membranas foram visualizadas com um sistema de quimioluminescência amplificada (ECL, Pierce) e exposto a filme de raios-X.

Avaliação in vitro da absorção celular

Para avaliar a localização intracelular de DOX entregue e pGFP-SATB1 shRNA e a penetração aumentada de lipossomas para as células de cancro gástrico por magnética alvo, um FAM marcado com ARNsi (fluorescência verde) foi utilizado para imitar pGFP-SATB1 shRNA, e de DOX, por si só possui uma fluorescência vermelha instinto para monitorar a absorção celular . MKN-28 células foram semeadas em placa de 12 poços a 4 x 10 ^{5 células /poço e cultivadas durante a noite. Em seguida, as células foram incubadas com ARNsi livre, TsCl siRNA, TSMCL siRNA, TsCl-DOX, TSMCL-DOX, TsCl-DOX-siRNA ou TSMCL-DOX-ARNsi durante 6 h. Para lipossomas magnéticas, as placas foram posicionadas numa placa magnética de 12 poços durante a primeira hora de incubação. As células foram visualizadas com um microscópio de fluorescência para localizar os marcadores fluorescentes de DOX e siRNA. Os núcleos foram coradas com DAPI (azul de fluorescência).}

Ensaio MTT

células MKN-28 foram semeadas a uma densidade de 2 × 10 ^{4 células /poço em placas de 96 poços e crescidas durante a noite. As células foram então incubadas com diferentes lipossomas a 37 ° C durante 2 h em CO _{2 incubadora. Para lipossomas magnéticas, as placas foram colocadas sob uma placa magnica de 96 poços, durante os primeiros 1 h de incubação. Em seguida, as células foram lavadas duas vezes com PBS e incubadas durante 46 h em meio fresco. Subsequentemente, a viabilidade celular foi medida pelo ensaio de MTT. O meio em cada poço foi substituído por solução de MTT de 20 ul (Sigma-Aldrich, EUA) e incubou-se durante 4 h a 37 ° C, em seguida, os sobrenadantes foram descartados e os cristais de formazan foram dissolvidos com 200 ul de DMSO. As placas foi medida a 490 nm num leitor de microplacas, e a viabilidade celular foi calculada de acordo com a seguinte fórmula:}}

A citometria de fluxo

A apoptose foi detectada utilizando um Kit de anexina V-FITC Apoptosis Detection (eBioscience, EUA). células MKN-28 foram semeadas em placas de 12 poços e tratadas como acima descrito. Após 24 h, as células foram recolhidas, lavadas duas vezes com PBS e suspensas em 500 ul de tampão de ligação. Em seguida, as células foram duplamente coradas com anexina V-FITC e iodeto de propídio (PI). As células em estágio inicial de apoptose coradas com anexina V-FITC mas não coradas com PI foram quantificados por cytometery fluxo.

modelo de xenoenxerto de rato

machos Cinco a seis semanas de idade camundongos Balb /c nus eram fornecida pelo Centro de Experimentação animal da Tongji Medical College. Cada rato foi inoculada por via subcutânea no flanco direito com 5 × 10 6 células MKN-28 ^{. Várias semanas após a inoculação do tumor, 36 ratinhos portadores de tumor foram divididos aleatoriamente em seis grupos (n = 6). Os ratinhos foram injectados através da veia da cauda com DOX livre, TSMCL-DOX, TSMCL-shSATB1, TsCl-DOX-shSATB1, TSMCL-DOX-shSATB1 ou solução salina normal como controlo. A dose de DOX foi de 2,5 mg /kg e o de pGFP-SATB1 shRNA foi de 10 ug por ratinho. O tratamento foi administrado uma vez a cada 3 dias e o tamanho do tumor foi medido através de um calipering e, em seguida, podia ser calculado o volume do tumor pela fórmula: volume = (D _{min) 2 × D Max /2, onde D Max foi o maior diâmetro do tumor e D Min foi a mais curta. Para TSMCL-DOX, TSMCL-shSATB1 e TSMCL-DOX-shSATB1, a orientação magnética foi conseguida utilizando um campo magnético externo permanente de 5000 Gauss, durante 30 min com foco no tumor após a administração do fármaco. Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética da Tongji Medical College e todos os animais foram tratados com humanidade de acordo com as orientações Animal Care Institucional e Comitê Use.}}

A análise estatística

Os dados foram expressos como a média ± desvio padrão (SD). A significância estatística entre os diferentes grupos foi avaliada com o teste t de Student e análise de um factor de variância (ANOVA). Para o tempo de sobrevivência dos animais, as curvas de Kaplan-Meier de cada grupo foram estabelecidos e teste logarítmico foi realizada para comparar a taxa de sobrevivência. p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

Caracterização dos lipossomas

Como mostrado na Tabela 1, o diâmetro do TsCl foi de 83,6 ± 5,7 nm, enquanto que a de TsCl. -DOX foi aumentada para 118,5 ± 7,9 nm devido à encapsulação de DOX. Enquanto isso, os diâmetros de TsCl-shSATB1 e TsCl-DOX-shSATB1 foram aumentadas significativamente para 161,1 ± 11,8 nm e 238,1 ± 20,6 nm, respectivamente, devido à aderência e de fusão de ADN de plasmídeo de lipossomas. Para lipossomas magnéticos, os tamanhos de partícula de TSMCL, TSMCL-DOX, TSMCL-shSATB1 e TSMCL-DOX-shSATB1 foram 135,0 ± 11,6 nm, 157,2 ± 14,3 nm, 221,3 ± 15,7 nm e 319,4 ± 20,1 nm, respectivamente, significativamente maior do que a de TsCl, TsCl-DOX, TsCl-shSATB1 e TsCl-DOX-shSATB1 devido ao aprisionamento das nanopartículas magnéticas. Além disso, o tamanho de TSMCL-shSATB1 e TSMCL-DOX-shSATB1 foi significativamente maior do que de TSMCL e TSMCL-DOX, respectivamente (p < 0,05). Todos os lipossomas tinham distribuição de tamanho estreita, porque os seus polidispersividades não eram mais do que 0,3.

potenciais zeta de TsCl, TsCl-DOX, TsCl-shSATB1 e TsCl-DOX-shSATB1 foram 52,0 ± 7,3 mV, 50,1 ± 7,7 mV, 31,3 ± 5,2 mV e 26,7 ± 4,5 mV, respectivamente. Após a incubação com o pGFP-SATB1- shRNA, as cargas superficiais diminuiu significativamente (P < 0,05), devido à interacção electrostática entre os lípidos catiónicos e de ADN de plasmídeo. No entanto, o aprisionamento de nanopartículas magnéticas não resultou numa diminuição significativa do potencial Zeta em lipossomas magnéticos.

Para DOX eficiência carregado, a taxa de encapsulação de DOX foi de 89 ± 3% e 78 ± 8% (n = 3) para TsCl-DOX e TSMCL-DOX, respectivamente, e foi de 85 ± 7% e 73 ± 9% (n = 3) para TsCl-DOX-shSATB1 e TSMCL-DOX-shSATB1, respectivamente. Estes dados indicam que a interacção entre lipossomas e plasmídeo não resultou em fugas DOX.

A termossensibilidade do lipossomas

calorimetria de varrimento diferencial foi realizada para determinar a temperatura de transição de fase de TsCl. Como mostrado na Fig. 1, TsCl composto de DPPC, DC-colesterol, Doab e colesterol numa proporção molar de 80:5:5:10 tinha uma Tm de 40,8 ° C, com um pico de transição relativamente amplo que pode ser o pico de transição de fusão de DPPC e Doab .

in vitro de DOX termossensível libertação a partir dos lipossomas

Como se mostra na Fig. 2, DOX taxa de libertação a partir de TsCl-DOX e TSMCL-DOX foi de apenas 12% e 16% após incubação com PBS a 37 ° C, e aumentou para 20% e 19% após incubação com 50% de FBS, respectivamente. Para TsCl-DOX-shSATB1 e TSMCL-DOX-shSATB1, taxa de libertação de DOX foi de 12% e 15% após incubação com PBS a 37 ° C, e era ambos os 16% após incubação com 50% de FBS, indicando que a incorporação do plasmídeo tinha nenhum efeito significativo sobre a estabilidade dos lipossomas (p > 0,05).

DOX taxa de libertação a partir de TsCl-DOX e TSMCL-DOX foi aumentada para 37% após incubação com PBS a 42 ° C, e aumentou para 45% e 49% após incubação com 50% de FBS, respectivamente. Para TsCl-DOX-shSATB1 e TSMCL-DOX-shSATB1, taxa de libertação de DOX foi de 35% e 43% após incubação com PBS e de FBS a 42 ° C, respectivamente, ambos significativamente mais elevada do que a 37 ° C (p < 0,05). Estes resultados indicam que TsCl-DOX, TSMCL-DOX, TsCl-DOX-shSATB1 e TSMCL-DOX-shSATB1 têm termossensibilidade desejável, e pode ser utilizado para hipertermia desencadeada libertação de DOX controlo.

silenciamento de expressão em SATB1 MKN-28 células transfectadas com lipossomas

em seguida avaliou-se a eficácia dos lipossomas para entregar shSATB1 vector em células MNK-28. imagens de fluorescência típica de células transfectadas com TsCl-shSATB1 e TSMCL-shSATB1 foram mostrados na Fig. 3A. Análise de citometria de fluxo mostrou que a eficiência de transfecção de TsCl-shSATB1 foi apenas 15,4 ± 0,15%. No entanto, após a aplicação da orientação do campo magnético, a eficiência de transfecção de TSMCL-shSATB1 foi de 34,3 ± 0,93%, significativamente maior do que a de TsCl-shSATB1 (Fig. 3B).

Para determinar se o vector entregue shSATB1 poderia mediar silenciamento de expressão em células SATB1 MKN-28, foi realizada a PCR em tempo real quantitativa e análise de Western blot. Os resultados mostraram que ambos os níveis de mRNA e proteína SATB1 diminuiu em células transfectadas com TsCl-shSATB1 e TSMCL-shSATB1, em comparação com células de controlo. Além disso, TSMCL-shSATB1 com a ajuda de campo magnético era mais potente do que TsCl-shSATB1 para inibir a expressão em células SATB1 MKN-28 (Fig. 3C e D).

Magnética alvo in vitro a captação celular

Para comparar as penetrações nas células entre lipossomas não-magnéticos e magnéticos, com o pedido de orientação magnética alvo, bem como a localização intracelular de DOX e entregue shSATB1, um siARN FAM-marcado foi utilizado como indicador. A ausência de fluorescência verde em células tratadas com siRNA gratuito indicado que não pode penetrar nas células (dados não apresentados). Observou-se que mais células tratadas com siRNA TSMCL exibiu fluorescência verde do que as células tratadas com siRNA-TsCl (Fig. 4A). Além disso, as células tratadas com mais TSMCL-DOX mostrou fluorescência vermelha do que as células tratadas com TsCl-DOX (Fig. 4B). Em células tratadas com TSMCL-DOX-siRNA, foi observada elevada intensidade de fluorescência, e as células apareceram rosa devido à fusão de cor azul, verde e vermelha (Fig. 4C). Estas observações sugerem que TSMCL é mais potente na entrega de siRNA e DOX para as células do que TsCl, após a aplicação do campo magnético.

Além disso, foi examinada a localização intracelular de DOX entregue e siRNA. fluorescência vermelha foi observada em ambos os núcleos e do citoplasma, indicando que entregue DOX foi localizado em ambos os núcleos e do citoplasma. Em contraste, a fluorescência verde apareceu principalmente no citoplasma, sugerindo que os siRNAs foram entregues no citoplasma (Fig. 4D). A fusão de vermelho e verde apareceu amarelo no citoplasma, ea fusão de azul e vermelho apareceu lavanda nos núcleos. Tomados em conjunto, estes dados indicam que tanto TsCl e TSMCL pode penetrar em células de cancro gástrico e entregar o seu conteúdo para o citoplasma (DOX e siARN) e os núcleos (DOX).

In vitro os efeitos anti-tumorais do lipossomas

Foram avaliados os efeitos in vitro anti-tumorais deste sistema de co-entrega por actividade de indução de citotoxicidade e apoptose. A citotoxicidade dos lipossomas foi avaliada pelo ensaio de MTT. Para determinar os efeitos de concentrações de DOX e o plasmídeo sobre a citotoxicidade dos lipossomas, foram examinados os lipossomas carregados com várias concentrações de DOX e diferentes quantidades de SATB1 shRNA. Com o aumento da concentração de DOX, a citotoxicidade dos lipossomas foi aumentada (Fig. 5A). No entanto, a adição de concentração SATB1 shRNA não resultou num aumento da citotoxicidade, e não foram apenas ligeiramente aumentar de citotoxicidade quando a concentração SATB1 shRNA foi de cerca de 4 ug (fig. 5B). Assim, usamos 25 DOX? M e 4 mg SATB1 shRNA para comparar a citotoxicidade dentre gratuito DOX, gratuito shRNA, TsCl, TSMCL, TsCl-DOX, TSMCL-DOX, TsCl-shSATB1, TSMCL-shSATB1, TsCl-DOX-shSATB1 e TSMCL- DOX-shSATB1.

Como se mostra na Fig. 5C, livre shRNA, TsCl e TSMCL teve pouco citotoxicidade. A viabilidade celular foi de 40,3 ± 3,4%, 73,6 ± 3,5% e 51,3 ± 4,5% para livre DOX, TsCl-DOX e TSMCL-DOX, respectivamente, sugerindo que a citotoxicidade de TSMCL-DOX foi maior do que TsCl-DOX, mas inferior livre DOX . A viabilidade celular foi de 79,2 ± 6,9% e 71,6 ± 4,7% para TsCl-shSATB1 e TSMCL-shSATB1, respectivamente, não apresentando significância estatística (p > 0,05). Para a co-administração de fármaco e gene, a viabilidade celular foi de apenas 35,0 ± 3,2% e 22,3 ± 3,4% para TsCl-DOX-shRNA e TSMCL-DOX-shRNA, respectivamente, significativamente menor do que a DOX livre, TsCl-DOX, TSMCL- e DOX SATB1shRNA lipossomas carregados (p < 0,05). Além disso, a viabilidade celular de TSMCL-DOX-shRNA foi significativamente menor do que a de TsCl-DOX-shRNA (p < 0,05). Estes resultados sugerem que a citotoxicidade um efeito sinérgico é atingido por DOX co-entrega e SATB1 shRNA. Além disso, com a aplicação de alvo magnético, uma citotoxicidade ainda mais reforçada pode ser obtido.

Para determinar o mecanismo anti-tumoral adicional, além de a citotoxicidade do sistema de co-entrega, foi examinada a taxa de apoptose MKN-28 células tratadas com gratuito DOX, TsCl-DOX, TSMCL-DOX, TsCl-shSATB1, TSMCL-shSATB1, TsCl-DOX-shSATB1 e TSMCL-DOX-shSATB1 por citometria de fluxo. Como mostrado na Fig. 5D, a taxa de apoptose foi de 22,3% em células tratadas com DOX livre, era de 8,9% em células tratadas com TsCl-DOX, mas aumentou para 13,4% em células tratadas com TSMCL-DOX e um campo magnético. Da mesma forma, a taxa de apoptose foi de 9,4% em células tratadas com TsCl-shSATB1, mas aumentou para 17,4% em células tratadas com TSMCL-shSATB1 e do campo magnético. Em contraste, a taxa de apoptose foi de 27,7% em células tratadas com TsCl-DOX-shSATB1, mais elevada do que nas células tratadas com TsCl carregados com DOX ou shSATB1 sozinho. A taxa de apoptose foi de 32,4% nas células tratadas com TSMCL-DOX-shSATB1, a maior entre todos os grupos. Estes resultados demonstram que a DOX co-entrega e SATB1 shRNA conduz a efeitos combinados de indução de apoptose. Em resumo, este sistema de co-entrega exibe efeitos anti-tumorais in vitro fortes.

A actividade in vivo antitumoral dos lipossomas

A fim de determinar a actividade anti-tumoral in vivo do sistema de co-entrega, estabelecemos MKN-28 modelos de xenoenxerto de murinos e injectado livre DOX, TSMCL-DOX, TSCML-shSATB1, TsCl-DOX-shSATB1 ou TSMCL-DOX-shSATB1 nos murganhos através da veia da cauda. O tratamento foi administrado uma vez a cada 3 dias, e os tumores foram dissecados (Fig. 6A). No dia 15, o volume do tumor foi de 0,44 ± 0,05 cm ^{3 em ratinhos tratados com TSMCL-DOX-shSATB1, significativamente menor do que no grupo salina (2,14 ± 0,23 cm 3), Grupo livre DOX (1,08 ± 0,13 cm 3), grupo TSMCL-DOX (0,68 ± 0,10 cm 3), grupo TSCML-shSATB1 (1,43 ± 0,21 cm 3), e do grupo TsCl-DOX-shSATB1 (0,77 ± 0,12 cm 3) (Fig. 6B).}

Além disso, como mostrado na Fig. 6 (C), o tempo mediano para o volume do tumor para alcançar 2 cm ^{3 foi de 30 dias no grupo TSMCL-DOX-shSATB1, mais longo do que no grupo de solução salina, grupo livre de DOX, grupo TSMCL-DOX, grupo TSCML-shSATB1 e grupo TsCl-DOX-shSATB1 (Fig. 6C). Tomados em conjunto, estes resultados indicam que a co-entrega de DOX e shSATB1 por TSMCL apresenta efeito anti-tumoral sinérgico in vivo.}

Discussão

Apesar do recente desenvolvimento na cirurgia, radioterapia e terapia-alvo, a quimioterapia é ainda uma das abordagens importantes para a terapia do cancro gástrico. No entanto, os efeitos terapêuticos da quimioterapia são muitas vezes insatisfeitos e não conseguiu melhorar significativamente o prognóstico de pacientes com câncer [19]. Uma das principais razões é a tumorigênese e progressão do cancro gástrico envolve uma variedade de diferentes mecanismos; o mecanismo anti tumor unitária de quimioterapia tradicional tem limitado os seus efeitos terapêuticos, assim, a combinação de quimioterapia com a terapia de gene pode melhorar os efeitos anti-tumorais. Outro obstáculo é a quimioterapia de que a administração sistémica da droga leva a concentração de droga limitada em locais de tumores, enquanto causando efeitos adversos muitas [8]. A chave para resolver estes problemas se baseia em novos modos de entrega de drogas, por conseguinte, o desenvolvimento de alvo multi-agentes sistema de entrega que pode ser guiado directamente ao local do tumor com libertação controlada pode superar estes problemas e melhorar os efeitos terapêuticos [20] - [25] .

Entre os vários sistemas de distribuição de drogas, os lipossomas são mais promissores para boas biocompatibilities que causam pouco ou nenhum antigênica, alérgica e reacções tóxicas, e facilmente se submetem a biodegradação. Como ambos os suportes de medicamentos e genes, lipossomas pode não apenas proteger o hospedeiro contra os efeitos indesejáveis ​​do fármaco encapsulado, mas também evitam que o conteúdo retido a partir de inactivação prematura do meio fisiológico [26]. Além disso, lipossomas é um sistema de entrega de drogas potencialmente alvo, se ela é conseguido por aumento da permeabilidade e efeito de retenção (EPR) (passiva segmentada), ou por orientação do campo magnético e ligação imunológica (activa dirigida) [27]. Além disso, alguns lipossomas possuem controladas desencadeada características de libertação de drogas, tais como termo sensibilidade, sensibilidade pH e sensibilidade de microondas.

Recentemente, tinha desenvolvido um novo sistema magnético alvo termossensível de drogas e gene co-entrega (TSMCL). Com base em uma formulação termossensível eletroneutro (DPPC:Cholesterol = 80:20), nós tinha adicionado diferentes componentes catiônicos e otimizado a termossensibilidade de lipossomas por ensaio de libertação de calceina. Os resultados indicaram que poderíamos obter um termossensibilidade desejável, substituindo 10 partes moles colesterol de 5 partes moles DC-colesterol e 5 partes moles Doab (DPPC:DC-Cholesterol:DOAB:Cholesterol = 80:5:5:10) e libertação de calceina dos lipossomas seria inferior a 37 ° C, mas significativamente maior a 42 ° C nesta formulação. Em seguida, o fluido magnético Fe _{3O 4 tinha sido usado como o núcleo e funcionou como segmentação magnética e fonte de aquecimento de TSMCL. Vibrando magnetômetro de amostra (VSM) Medição tinha indicado que o fluido magnético Fe 3O 4 tinha sido superparamagnético, assim TSMCL teria bons efeitos direcionados magnéticos. Enquanto isso, a curva de aquecimento dependente do tempo também demonstraram que tanto fluido magnético Fe 3O 4 e TSMCL pode ser aquecida desde 25 ° C a 42 ° C dentro de 20 min. Com a ajuda de fluido magnético Fe 3O 4, a segmentação magnético e da temperatura desencadeada liberação do fármaco de TSMCL poderia ser realizado. Finalmente, tanto TsCl e TSMCL tinha exibido morfologias de lipossomas típicas e boas distribuições sob TEM. Com base no sucesso de construção TSMCL, neste estudo nós carregado DOX e SATB1 shRNA vector no TSMCL para fazer TSMCL-DOX-shSATB1 e avaliados os efeitos anti-tumor contra as células de cancro gástrico in vitro e in vivo.}

DOX é uma droga vulgarmente utilizado em quimioterapia com eficiência elevada para inibir a proliferação de células tumorais e induzir a apoptose de células de tumor, mas os seus efeitos terapêuticos são limitados devido a cardiotoxicidade grave e mielossupressão, quando administrada sistemicamente [28]. Embora os lipossomas DOX foram parcialmente melhorou a situação, a falta de entrega direccionada ainda Limites sua utilização [29]. SATB1 é um organizador de cromatina global que regula directamente a expressão do ERRB2, MMP2, ABL1 e E-caderina para actuar como um regulador chave do desenvolvimento de cancro [30]. A sobre-expressão de SATB1 em vários tumores tem sido associada com comportamentos malignos biológicos, tais como invasão, proliferação e metástase [10] - [13]. Silenciamento expressão SATB1 por pequeno ARN interferente (siRNA) ou plasmídeo que codifica harpina curto de ARN (ARNsh) poderia inibir a proliferação, invasão e metástase, e induzir a apoptose de várias células de tumor [16], [17]. Portanto, torna-se SATB1 um alvo potencial para a terapia do cancro [30]. No entanto, vetores de entrega apropriadas para siRNA ou shRNA são importantes para SATB1 alvo terapia genética do cancro.

Neste estudo, usando o sistema de TSMCL-DOX-shSATB1, tanto DOX e SATB1 shRNA vector poderia ser guiado para o local do tumor sob magnética arquivada orientação e DOX foi lançado em uma hipertermia desencadeada maneira. A hipertermia desencadeada libertação é dependente de lipossomas termossensíveis que são compostos principalmente de Dipalmitoyphosphocholine (DPPC), que sofre uma transição de gel para fase de líquido cristalino (Tm), que se torna altamente permeável a moléculas pequenas solúveis em água a 41 ° C [31]. Os lipossomas compostos por lípidos DPPC diferente e têm Tm distinta e termossensibilidade [32]. análise de DSC mostrou que a Tm do nosso sistema de entrega foi de 40,8 ° C, e ensaio de libertação de DOX indicou que era estável a 37 ° C enquanto foi DOX libertado quando a temperatura subiu para 42 ° C.

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