Абстрактный
Фон
<р> Опухоль считается гетерогенный комплекс в трехмерной среде, на одном уровне с патофизиологических и биомеханических сигналов. Cell-стромы взаимодействия направлять развитие и формирование опухолей. Здесь мы оцениваем вклад нормальных фибробластов к раку желудка.
Финансирование:. Это исследование при поддержке грантов от Национального специального фонда здравоохранения Key (http://program.most.gov.cn; No.200802112), Национального комитета по науке фонда (http://www.nsfc.gov.cn; общий проект № .81372302 No.81272120), Департамент здравоохранения фонд (http://program.most.gov.cn; No.2007A093), ключевой проект провинции Чжэцзян (http://www.zjkjt.gov.cn; No. 2013C030445 2009C030125). Фонд науки Природные провинции Чжэцзян (http://www.zjnsf.gov.cn; No.Y2080001, Y12H160121 и Z2080514) и Фонда Бюро Medicine Традиционный китайский (http://wst.zj.gov.cn; No.2007ZA019). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов
Введение
<р> Метастазы ответственны за до 90% от рака-ассоциированной смертности. Многие пациенты, которые не демонстрируют никаких признаков метастазирования в начальный диагноз будет в конечном итоге развитие метастаз. Хотя метастазы являются причиной большинства случаев смерти от рака, этот процесс остается одним из самых загадочных аспектов заболевания.
<Р> метастатических опухолевых клеток ввести ткани через кровоподтек. Ткань, однако, претерпевает нечеткие процессы, с помощью которых клетки, уложенных в матрице ткани и вступает в непосредственный контакт с клетками стромы, большинство из которых являются обычными фибробластами. Опухолевые клетки имеют все шансы вступить в контакт с клетками стромы, включая опухолевые и метастатических клеток [1]. Это приводит к взаимному перекрестных помех с нормальными фибробластами в ткани.
Фибробласты являются наиболее распространенными стромальные клетки, и они стимулируют микросреды и служат богатым источником для паракринной пути во время онкогенеза и прогрессии. Влияние нормальных фибробластов на опухолевые клетки являются спорными. Сообщалось, что нормальные фибробласты подавляют злокачественное превращение иммортализованных эпителиальных клеток простаты [2], в то время как в опухолях молочной железы, фибробласты трансформации протоковой карциномы в инвазивную карциному [3].
<Р> Это расхождение указывает на то, что влияние фибробластов на опухолевых клетках отличается от всех CAFS (рак, связанные фибробласты). Для этого исследования мы культивировали совместно опухолевые клетки с нормальными фибробластами в чашках Петри, чтобы имитировать, как опухолевые клетки связаться с фибробластами. Мы сосредоточили свое внимание на вкладе нормальных фибробластов к раку желудка. Мы культивировали нормальные фибробласты, чтобы сформировать плотные монослои, которые затем были распространены с опухолевыми клетками для имитации метастатических опухолевых клеток. Мы предположили, что высокое отношение фибробластов к опухолевым клеткам может имитировать ткани, где Метастазирующие опухолевые клетки проживают. Таким образом, были использованы фибробласты кожи от здоровых людей, чтобы производить клеточную среду. Желудочный линия клеток рака, КУП-823, здесь был использован, потому что морфологически отличие от фибробластов.
Этические Заявление
Первичные ткани дермы человека от детей, подвергшихся обрезанию после получения письменного информированного согласия их опекунов, которые были включены в их медицинской документации. Этот эксперимент был рассмотрен и одобрен этическими комитетами Второго филиал больницы Чжэцзян школы медицины университета (этического кодекса обзора: Research 2013-047). Пациенты, включенные в данном исследовании, были предоставлены с копией письменного информированного согласия и дал разрешение на публикацию.
<Р> Все эксперименты проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных Совета по науке и технике Китая. Протокол исследования был одобрен животных по уходу и использованию Комитетом по Zhejiang University.
Анализ пролиферации
<р> Экспоненциально растущие клетки высевали в 96-луночные планшеты в течение еще 6 дней инкубации при 37 ° C в увлажненной 5% CO <суб> 2 атмосферы. пролиферации клеток измеряли в пяти экземплярах каждый день с помощью пипетки 20 мкл Celltiter 96 водного раствора реагента (Promega, США) в каждую лунку, которая содержала 100 мкл высокого глюкозы DMEM, затем клетки инкубировали в течение еще 2 часов, прежде чем определить относительную плотность при 490 нм с помощью ридере.
Drug Анализ ингибирования
<р> Пять дублированием экспоненциально растущих клеток высевали в 96-луночные планшеты и инкубировали в течение 24 часов. Через 24 часа среду замен ли различными концентрациями препаратов (0-80 мкМ) и культивировали в течение еще 24 часов. токсичности препарата оценивали путем измерения количества жизнеспособных клеток с использованием анализа пролиферации, описанной выше.
Царапины Анализ апоптотических клеток измеряли с использованием V-FITC набора определения апоптоза аннексина (Keygen, Китай) в соответствии с инструкциями изготовителя. Клетки либо не обрабатывали или обрабатывали препаратами в течение 24 ч, а затем собирают, промывают дважды PBS, ресуспендировали в буфере для связывания, содержащего 5 мкл ФИТЦ-аннексина V и 5 мкл PE, и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. Анализ проводили с использованием проточной цитометрии (FACSCalibur, Becton Dickinson, США). Результаты фибробласты (FBS) и клетки BGC-823 были сокультивировали в соотношении 10:1 еще в течение 10 дней после того, как культивируемые клетки достижения слияния. Клетка смесь затем пассируют путем обработки трипсином со свежими фибробласты (1 × 10 6 клеток /мл) (рисунок 1.1). Формирование купола в клетках BGC-823 наблюдалась после первого прохода. Во второй и последующих проходах, подвешенный круглой формы клетки появились в культивируемой системе: некоторые объединяются в кластеры или комков и были слабо связаны с поверхностью фибробластов. Параллельные культивированные клетки BGC-823 продемонстрировали лишь несколько округлой формы клеток у основания, когда культура стала переполнена. Смешанному приостановлено клетки выставлены различные морфологические признаки и длительное вложение после прохождения. Эти клетки продемонстрировали либо булыжник, как внешний вид, похожий на клетки BGC-823 или короткий шпиндель-подобные функции. Равномерное, короткие, шпиндель-подобные клетки были получены путем прохождения смешанных взвешенных клеток и плотных нормальных фибробластов. В отличие от этого, прохождение супернатанта клеток КУП-823 только продемонстрировал мусор после 24 часов культивирования, в котором небольшое количество клеток, уцелевших с образованием булыжником, как клоны, подобные родительских клеток КУП-823 (рис 1.3A-H). В предыдущем исследовании сообщалось, что фибробласты подавляют рост других клеток при сокультивировали в пробирке Ру по механизму контактного торможения [4]. В наших экспериментах, однако, нормальные фибробласты не контактировали-ингибируют пролиферацию клеток КУП-823. Вместо этого, FB-ОПП постепенно погибали с распространением КУП-GFP при культивировании был продлен до 10 дней. Таким образом, последовательное добавление FB требовалось прохождение и поддерживать стабильное производство TBGCs. Мы также отметили, что, когда небольшое количество TBGCs было добавлено к фибробластами листа сливающийся, опухолевые клетки, выросшие за пределами отталкивали фибробластами. В центре колонии опухоли, клетки круглой формы, с только рыхлых присоединений к основанию (рис 1.3A-H). 3. Пролиферация, Invasion, и подвижность TBGCs TBGC анализировали с помощью анализа MTS. TBGCs продемонстрировал ускоренную скорость пролиферации ( р 6. TBGCs Продемонстрированный низкий опухолевидное образование, но высокий лимфоузла метастазирования потенциала в нашей модели подкожного туморогенез
<р> Клетки высевали на 24-луночные планшеты (5 × 10 4 клеток /лунку) и культивируют до слияния. Наконечники пипеток были использованы для создания царапин. ФБР, используют для удаления остатков клеток, затем заменяли бессывороточной средой. Изображения были получены в течение 3-х дней подряд. Ширина нуля была измерена с помощью ImageJ 1.47 программного обеспечения для ОС Windows (http://rsb.info.nih.gov/ij/) и наносили на график как нуля на расстоянии в день.
Миграция и Invasion Анализ <бр> <р> подвижность клеток опробование проводилось с использованием Transwell вставки (8 мкм размер пор) (Corning, США). Клетки-GFP (зеленый флуоресцентный белок) (1 × 10 5/500 мкл) суспендировали в бессывороточной среде, и помещают над вставками в трех экземплярах, с 800 мкл культуральной среды, загруженной под ним. После инкубации в течение ночи, вкладыши промывали 3 х ПБС, а затем протирают увлажненным тампоном выше, где фиксировали 4% PFA ниже и наблюдали с использованием флуоресцентного микроскопа (Olympus, Япония). Та же процедура была использована для выполнения анализа инвазии, но были использованы вставки, которые были предварительно покрытые матригелем (BD, США). Оба анализа были определены количественно, как количество клеток, подсчитанных в 5 случайных полей (200-кратном увеличении).
Апоптоз анализа
Количественная ПЦР в реальном времени
<р> Ядерные экстракты были подготовлены с использованием мини-набора RNeasy в соответствии с инструкциями изготовителя. Образцы Очищенная РНК (1 мкг) в DEPC воды обратной транскрипции с использованием набора PrimeScript II 1-й цепи синтеза кДНК (Takara, Китай). ОТ-ПЦР и амплификации проводили с использованием набора SYBR Премикс Ex Taq (Takara II).
<Р> Реакционная система 20 мкл, содержащую 1 мкл разведенного кДНК пробы 10 мкл SYBR Премикс Ex Taq II (2 ×), 0,4 мкл ROX Reference Dye (50 ×), 7 мкл стерильной бидистиллированной H <суб> 2O, и 1 мкл прямого и обратного праймеров (см материалы и методы S1) были подготовлены и оценены с помощью анализа кривых плавления и сравнительного порогового цикла (Ct) метод. Были использованы следующие условия езда на велосипеде: 95 ° C в течение 10 минут, затем 40 циклов при 95 ° С в течение 15 секунд и 58 ° С в течение 1 минуты. GAPDH, использовали в качестве контрольного гена.
Вестерн-блот-анализ
<р> Белки были извлечены из экспоненциально растущих клеток и первичных тканей. Экстракты варят в загрузочном буфере, разделяли на 10% Трис-HCl в SDS-полиакриламидном геле и переносили на нитроцеллюлозные мембраны (Millipore, США) с использованием стандартных методов. Мембраны были блокированы с использованием 5% обезжиренного молока в Трис-буферном солевом растворе с Tween-20 (TBST) в течение 30 минут при комнатной температуре. Мембраны промывали TBST и инкубировали в течение ночи при 4 ° C с первичными антителами против E-кадгерина (1:5000), виментину (1:5000), β-катенина (1:5000), N-кадгерин (1:1000), и β-актина (1:1000). После промывки 3 × с помощью TBST, добавляли вторичное антитело козы против кролика (1:1000) и инкубировали в течение 2-х часов при комнатной температуре. И, наконец, иммунные комплексы были визуализированы с помощью хемилюминесценции с использованием ECL (electro хемилюминесценции) (Millipore). Концентрация белка была нормализована к бета-актина.
гистологическое и иммуногистохимическое анализ
<р> Образцы быстро замораживали в жидком азоте, хранят при -80 ° C, фиксировали в 4% PFA, и разрезали на толщиной 10 мкм (Leica, Германия).
<р> для гематоксилином и эозином (HE) окрашивания красящий депарафинировали срезы окрашивают гематоксилином в течение 15 мин, промывали 3 × с PBS, кислотный алкоголь в течение 5 секунд, а затем эозин в течение 5 минут (Boster, Китай).
<р> для иммуногистохимического окрашивания, слайды регидратации и термически индуцированная извлечения эпитоп проводили в цитратном буфере с использованием скороварки (20 мин при 80 рКА), блокировали 3 % Н <суб> 2O <суб> 2 в течение 15 минут, а затем нормальной козьей сыворотки применялась (30 мин при комнатной температуре). Срезы инкубировали в следующих первичных антител: анти-Е-кадгерин (1:250), анти-виментин (1:250), анти-β-катенин (1:250), и анти-пан-CK (1:250 ). Образцы инкубировали в течение ночи при 4 ° С, дважды промывали PBS и инкубировали с вторичным антителом в течение 2-х часов при температуре 37 ° C. ДАБ Плюс хромоген комплект (Boster) был использован для обнаружения всех антигенов. Срезы контрастировали гематоксилином, обезвоженной, и монтируется с покровные использованием нейтральной Балата. Оба анализа были отдельно в исполнении патологоанатомов и клиницистов, которые были слепы к группам образцов. Споры были урегулированы на основе консенсуса.
Иммунофлуоресценции и конфокальной микроскопией
<р> Клетки высевают камеры горками, и замороженные срезы фиксировали 4% PFA и проницаемыми с 0,5% тритона Х-100. Срезы с нормальной козьей сывороткой в течение 1 часа при 37 ° C, промывали и инкубировали в течение ночи с первичными антителами при 4 ° С, а затем переносили и инкубировали с козьим антителом против мышиного и анти-кроличий-TIRTC антител в течение 1 часа при 37 ° C во тьме. Слайды были промыты с использованием глицерина и смонтированы с покровных стеклах. Ядра контрастно DAPI. Флуоресцентный был обнаружен с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (Olympus). В депарафинировали криосрезы окрашивали DAPI и анализировали с помощью иммунофлуоресцентного микроскопа.
Животная модель
<р> Восемьдесят четыре-недельных самок мышей BALB /с были приобретены у научно-исследовательского центра животных Шанхая и поддерживается на экспериментальном животном центре Чжэцзян Академии медицинских наук. В соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных Совета по науке и технике Китая, все животные содержались в асептических стерильных условиях и вводили автоклавного пищу и воду в соответствии с принципами лабораторных животных Уход Чжэцзян университета. Сорок четыре мышей использовали в модели подкожного, и были равномерно распределены в контрольной и экспериментальной группах. КУП-GFPs были использованы в качестве контроля, где TBGC-GFPs были использует в качестве эксперимента. Опухолевые клетки собирали в течение фазы роста, и суспендировали в бессывороточной среде (1 × 10 6 клеток /мл). Клетки пипеткой в одноклеточных суспензий, и каждый из 500 мкл раствора подкожно инокулировали в обе стороны грудной клетки. Мыши были умерщвлены через каждые 2 недели до 10 недель, и патологические исследования были проведены. Все мышей взвешивали через каждые 3 дня. Все операции проводились под 1% пентобарбитала натрия, и все усилия были сделаны, чтобы свести к минимуму страдания
. <Р> Тридцать шесть мышей использовали в вену инъекции группы для оценки распространения рака (18 мышей в КУП-GFP контрольной группе и 18 мышей в эксперименте группы TBGC-GFP). 500 мкл суспензии клеток (5 × 10 5 клеток) вводили в хвостовую вену безволосых мышей. Мыши были умерщвлены в 2 й, 5 й, 8 е и 10 й недели для гистологического исследования.
Статистический анализ
<р> были собраны экспериментальные данные и вошел в электронные таблицы. Нормальности тесты проводились перед операцией сравнения данных. Сравнения между группами проводили с использованием Стьюдента т
тест. Односторонний дисперсионный анализ был использован для сравнения > 3 группы, и метод Тьюки был использован для постфактум
сравнений групп. В этом исследовании, р
&л; 0,05 считается статистически значимым. SPSS 20.0 для Windows (в IBM SPSS Statistics, http://www-01.ibm.com/support/docview.wss?uid=swg24029274) использовали для проведения всех статистических анализов. R (ggplot2) (http://www.r-project.org/; http://www.r-project.org/) был использован для создания всех графических презентаций
<. h3> 1. Морфологические изменения в КУП-823 клеток Митника Стромальные клетки
<р> Последующие эксперименты проводились с целью определения источника взвешенных клеток в сокультивировали системе. КУП-823 клетки и фибробласты, трансфицированные GFP-Puro кассетой и ЗП-Puro кассеты, соответственно, и названный BGC-GFP и FB-RFP, соответственно. После того, как сокультивировани, КУП-GFP переросла в мультислоях и образовали куполообразную структуру. Между тем, круглой формы или шаровидные клетки, которые были приостановлены в средствах массовой информации были переданы в культуральные планшеты и метили зеленой флуоресценции, демонстрируя, что длительное сокультивировани фибробласты индуцирует трансформацию BGC. Круглые и шаровидные клетки, которые суспендировали в среде также наблюдали с использованием зеленую флуоресценцию и может быть пассировать без добавления фибробластов (рис 1.2A-D). После нескольких последовательных раундов сокультивировани, трансформированные клетки BGC-823 (TBGCs) были получены, что оказалось более равномерным, короткие, и шпиндель типа. Затем эти клетки пассируют без добавления фибробластов. Интересно, что эти клетки были более склонны образовывать сфероидами структуры, чем клетки, которые росли до слияния и не демонстрирующих морфологическое реверсии к КУП-823 клетки, пока ≫. 10-15 пассажей
2. Эпителиальные-мезенхимальных Переход от КУП-823 Ячейки для TBGC
<р> ПЦР в реальном времени использовали для анализа экспрессии мРНК. Результаты показывают, что экспрессия Е-кадгерин был удивительно подавлена вместе с повышающей регуляции виментину в TBGCs. В то же время, выражения твист, улитка, слизняк, и N-кадгерина были все (повышающей регуляции рисунок 1.5). Иммунофлуоресценции окрашивание и Вестерн-блот подтвердить потерю E-кадгерина и повышенная экспрессия виментину, N-кадгерина, и бета-катенина (Рисунок 1.4), тем самым подтверждая, что долгосрочное эпителиально-мезенхимальных перехода (EMT) происходит в TBGCs. Е-кадгерин является проверенным признаком EMT и поддерживает прикрепление клеток-клеток в эпителии. Потеря Е-кадгерин может привести к опухоли пролития больше клеток от от массы опухоли.
пролиферации
&л; 0,01) (Рисунок 2.1). Проточная цитометрия (см Материалы и методы S1) показывает, что 13% TBGCs были сохранены в фазе S, в отличие от всего 7% BGC-823 клеток (рис S1.3). Царапать анализ указывает на то, что TBGC моторики увеличился по сравнению с отцовскими клетками BGC-823 (рис 2.2-2.3A-H). TBGC анастомоза требуется 3 дня после начала царапин, в то время как > необходимы 4 дня для клеток BGC-823 ( р
&л; 0,05) (Рисунок 2.2)
<р> Результаты. вторжении анализы Матригель показывают, что TBGCs являются более агрессивными, чем клетки BGC-823. В общей сложности 683.67 ± 170,83 TBGCs пропитывал Матригель по сравнению с 188.33 ± 58.62 BGC-823 клеток в контрольной группе ( р
&л; 0,01) (Рисунок 2.4, Рисунок 2.5A, B). Тем не менее, TBGCs продемонстрировали значительное снижение мигрировавших клеток: в 2 раза меньше, чем клетки КУП-823 в соответствии с Transwell анализа миграции ( р
≪ 0,01) (рис 2.4, рис 2,5С, D). Подвесной характер TBGCs может объяснить это снижение, уровень приверженности был лишь 68,33 ± 10,41 в TBGCs на Матригель%, а 99,77% ± 6,25% в BGC-823 клеток, продемонстрировали медленное присоединение к поверхности Матригель в TBGCs (таблица S1) .
<р> чтобы лучше имитируют в естественных условиях
поведение опухоли, я гель коллаген типа используется для установления взаимосвязи между фибробластами и инвазионных потенциала клеток и TBGCs BGC-823. гель коллагена типа я был готов на Transwell вставок с фибробластами (см Материалы и методы S1). Фибробластоподобных загружены гели культивировали в течение 7 дней, а затем раковые клетки GFP-меченых высевали на гель и культивировали в течение следующих 7 дней. Осмотр заготовленных гелей показал, что опухолевые клетки проникли в коллагеновых гелях. Когда гели были загружены с фибробластами, TBGCs выставлены более усиленную инвазивный потенциал, чем клетки, КУП-823, как указано количество клеток, которые пропитывал гели (рисунок S1.2).
4. TBGCs Выставлены Цисплатин Сопротивление
<р> Далее, мы оценивали чувствительность TBGCs к стандартным желудочных химиотерапевтических рака. Жизнеспособные клетки и TBGCs КУП-823 определяли через 24 часа после контакта с цисплатином (0, 20, 40, 60, 80 мкМ) путем измерения включения МТС. Результаты показывают, что TBGCs выставлены замечательную устойчивость к цисплатин, в то время как несколько клеток BGC-823 выжили, когда концентрация цисплатин был повышен до 40 мкМ ( р
&л; 0,001) (Рисунок 3.1). Жизнеспособные TBGCs может даже быть обнаружен, когда концентрация цисплатина была повышена до 200 мкМ (данные не показаны). Мы провели анализ клеточного апоптоза с помощью проточной цитометрии для проверки сопротивления цисплатин. Результаты показывают, что уровень выживаемости TBGCs составлял около 42,40% по сравнению с 13.80% для КУП-823 клеток с последующей обработкой 40 мкМ цисплатина в течение 24 часов (рис 3,3-3,4). Тем не менее, при лечении 5-ФУ, не было никаких существенных различий в ингибировании опухоли между TBGCs и клетками КУП-823 в соответствии с анализом MTS (рис.3.2). Обе опухолевые клетки продемонстрировали химическую устойчивость к 5-ФУ (Рисунок 3.2).
5. TBGCs Приложение В естественных условиях
лимфоузла Склонность
<р> Для определения в естественных условиях
распределение TBGCs, 5 × 10 5 BGC-823 клетки или TBGCs были впрыскивается в хвостовую вену мышей BALB /с. Через две недели после инъекции, дисперсии вспомогательного и шейных лимфатических узлов метастаз наблюдалось в обеих группах, как показано оценкой флуоресцентного индикатора (рис 4.3а-F). GFP-положительных клеток были обнаружены во вспомогательном и паховых лимфатических узлах в обеих группах (рис 4.3а, В, D, Е). Тем не менее, GFP-положительных клеток появились только в легких мышей в группе BGC (рис 4.3c, F).
<Р> На неделе 5, в дополнение к обширной инвазии в лимфатические узлы, орган инфильтрации также наблюдаемый. Больше лимфатических узлов вторжения наблюдалось в TBGC группе по сравнению с контрольной группой КУП в каждый момент времени (Рисунок 4.1, Video S1). Эти лимфатические узлы были определены как пан-CK положительный (рис S2.1). Мы также наблюдали различный TBGC и распределение BGC в органах. TBGCs были ограничены тканей желудочно-кишечных, в то время как BGCs обосновались в легкие и кишечник (рис 4.2A-H). На 5 неделе, кишечная метастаз был впервые обнаружен в 3/4 мышей, которым вводили TBGCs, в то время как только 25% мышей показали, видимые кишечные метастаз после инъекции BGC (Рисунок S2.3).
<Р> По мере развития опухоли, среднее число кишечных TBGC метастазов увеличилась (5,6 ± 3,911 против
3,5 ± 1,914 BGCs на 8-й неделе; 6,33 ± 1,52 против
5,6 ± 1,342 на 10 неделе) (рис S4.2) , Интересно отметить, что 3 из 5 мышей в группе TBGC продемонстрировали видимый невооруженным глазом новообразования в gastrum после 10 недель, что не наблюдалось в группе BGC. Увеличены метастазы в легких были обнаружены в 3-х из 4 BGC мышей в неделю 8. Тем не менее, не было обнаружено никаких видимых TBGC метастазов в легких на 10 неделе (рис 4.2A-H). Микроскопический осмотр показал инфильтрация TBGCs в шейных и подмышечных лимфатических узлов уже в 1 неделю после инъекции в хвостовую вену, в то время как BGCs требуется дополнительное время (3 недели), чтобы войти в эти лимфатические узлы (Рисунок 4.1). Через пять недель после инъекции клеток, инфильтрацию легких наблюдалось в группе BGC. Тем не менее, никакие TBGCs не были обнаружены в органах до 10 недель после инъекции (рис 4.2b, F, рис S2.3)
. <Р> Иммуногистохимическое окрашивание указывает на постепенное увеличение Е-кадгерина в лимфатических узлах группы TBGC , тогда как экспрессия Е-кадгерин несколько уменьшилась в группе BGC ( р
&л; 0,01) (рис 4.4A-P). Различия были значительными через 8 и 10 недель, когда экспрессия Е-кадгерин был значительно выше в группе TBGC по сравнению с КУП группой (рис 4,5). Выражение -катенина также увеличивается со временем в TBGC группе, которая достигла своего пика в 8 недель, а затем несколько снизились (Рисунок 4.5). Результаты также показывают повышенную экспрессию β-катенина в группе TBGC на 5, 8 и 10 недель ( р
&л; 0,01). (Рисунок 4.5)
<р> Поскольку опухолевые клетки более склонны образовывать новообразованиями, когда имплантировали подкожно (GFP +) TBGCs и BGCs были имплантированы путем введения 5 × 10 5 жизнеспособных опухолевых клеток в подкожной ткани с обеих сторон грудной клетки. Нарождающиеся опухоли в группе BGC были обнаружены еще в 3-х дней после имплантации, и у всех мышей в группе BGC развились опухоли в местах имплантации после 1 недели инкубации (рис 5.1A). Поразительно, что имплантированные TBGCs не дали неопределяемый опухоли до 8 недель (рисунок 5.1, видео S2). Эскалация дозы TBGC до 5-10 × 10 6 имплантированные клетки только привели к образованию небольших опухолей комков и вялой увеличения объема опухоли вместе со временем инкубации. Кроме того, у мышей в группе BGC стали умирающий, по-видимому, из-за повышенной распространенностью опухоли (данные не показаны)
. <Р> вскрытий всего тела на каждом интервале времени, показывают, что TBGCs, вместо видимых первичных опухолей, пропитывал смежный и дистальных лимфатических узлов, в то время как КУП сгенерированных масс опухоли были ограничены интактными фиброзных капсул в месте инъекции сайтов (Video S2). Региональный глобальный лимфатических узлов метастазы в группе TBGC были найдены уже через 2 недели после имплантации, в то время как региональные лимфатические узлы были обнаружены метастазы в 4-х недель в группе BGC (Рисунок 5.2). Анализ Каплана-Мейера показал, что TBGCs продемонстрировали более высокий риск развития в метастазов в лимфатических узлах, чем BGCs (рисунок 5.2).
<р> Обширные кишечные метастазы были также очевидны у всех мышей в группе TBGC через 8 недель, а затем (рис S4.1 Рисунок S4.4). Среднее количество кишечных узелков было 5,50 ± 1,73 на 8-й неделе и 7,33 ± 1,79 на 10 неделе В противоположность этому, только 1 мышь в группе BGC продемонстрировали 3 кишечных заражений на неделю 9 (Рисунок S4.1).
<Р> трассировка GFP, указывает на образование локальной опухоли в группе BGC в месте инъекции без региональной инфильтрацией лимфатического узла. В противоположность этому, TBGCs появились в подмышечных лимфатических узлах, но зеленая флуоресценция не была обнаружена в тканях в месте инъекции (Рисунок 5.3). На 6-й неделе, TBGCs-GFP накапливается в ректальных и брыжеечных лимфатических узлов. Тем не менее, только 1 мышь с положительной брыжеечной метастазировании в лимфатические узлы был обнаружен в группе BGC. пан-CK иммуногистохимическое окрашивание указывает на то, что TBGCs метастазами в региональные (в начале) и дистальных лимфатических узлов (в конце), в то время как BGCs только метастазы в регионарных лимфатических узлах (в конце) в течение периода эксперимента (рис S4.5). TBGCs также метастазы в кишечник в неделю, когда он не был найден в группе BGC.
<Р> HE окрашивание показывает, что аномальные клетки появились в регионарных лимфатических узлах на ранних этапах в группе TBGC и поздних стадиях в группа BGC (рис S4.6). Иммуногистохимическое анализ экспрессии белка через 2 недели показывает понижающей регуляции E-кадгерина и бета-катенина и усилению экспрессии виментина в TGBC-LNs по сравнению с BGC-неоплазии. Эти результаты были дополнительно подтверждены с помощью Вестерн-блот-анализа образцов ткани, которые не обнаружили E-кадгерина в TGBC-LNs; В то же время, N-кадгерин также резко подавляются в TGBC-LNs (Рисунок S3.3-3.4).
<р> Иммуногистохимическое окрашивание указывает на постепенное увеличение Е-кадгерина в лимфатических узлах группы TBGC как время шло, тогда как экспрессия Е-кадгерина несколько уменьшилась в группе BGC ( р
&л; 0,01) (рис 5.4).
COVID-19:как выглядит болезнь
Ультрафиолетовый свет B полезен для кишечного микробиома
Слизь в лейке для душа может содержать опасные легочные бактерии - исследование
Микробиом легких предсказывает тяжесть заболевания COVID-19
Верхняя эндоскопия
Потеря микробиома в результате использования антибиотиков влияет на реакцию на вакцину против гриппа
Нездоровый микробиом кишечника снижает синаптическую обрезку мозга,
ухудшает обучение Новое исследование Weill Cornell Medicine и Корнельского университета дало больше объяснений того, как кишечные микробы взаимодействуют с нейронами мозга. Изучение, опубликовано в жу
Аллергии, связанные с повышенным потреблением нездоровой пищи,
предлагает новое исследование Многие детские аллергии на продукты питания могут быть вызваны нездоровой пищей, согласно новому исследованию. Дети с пищевой аллергией, и дети, которые едят много нездор
Микробиом легких предсказывает тяжесть заболевания COVID-19
Новый препринт исследовательской работы размещен в medRxiv * сервер обнаружил, что изменения в микробиоме легких во время тяжелого острого респираторного синдрома, вызванного коронавирусом 2 (SARS-C