PLOS ONE: Normale Fibroblastes induire une perte E-cadhérine et l'augmentation des ganglions lymphatiques métastatiques gastrique Cancer

Résumé

Contexte

Une tumeur est considérée comme un complexe hétérogène dans un environnement en trois dimensions qui est rincer avec des signaux physiopathologiques et biomécaniques. interactions Cell-stroma guider le développement et la production de tumeurs. Ici, nous évaluons les contributions des fibroblastes normaux à un cancer gastrique.

Par coculture des fibroblastes normaux dans des monocouches de BGC-823 cellules de cancer gastrique, les cellules tumorales de façon sporadique développé courte, broche
Méthodologie /Principaux résultats -comme caractéristiques morphologiques et démontré une prolifération accrue et potentiel invasif. En outre, les cellules tumorales transformées démontrées diminution de la formation de la tumeur et ont augmenté le potentiel métastatique lymphomatic et l'intestin. Non transformées BGC-823 cellules, en revanche, ont montré la formation de tumeur primaire et de l'invasion des ganglions lymphatiques intestinaux et retardée. Nous avons également observé une perte E-cadhérine et la régulation positive de l'expression de la vimentine dans les cellules tumorales transformées, ce qui suggère que l'augmentation des métastases a été induite par épithéliale-mésenchymateuse transition.

Conclusion

Ensemble , nos données indiquent que les fibroblastes normaux induisent suffisamment transition épithéliale-mésenchymateuse dans les cellules cancéreuses, ce qui conduit à des métastases

Citation:. Xu W, Hu X, Chen Z, Zheng X, Zhang C, Wang G, et al. (2014) normal Fibroblastes induire une perte E-cadhérine et augmentent la métastase ganglionnaire dans le cancer gastrique. PLoS ONE 9 (5): e97306. doi: 10.1371 /journal.pone.0097306

Editeur: Elad Katz, AMS Biotechnology, Royaume-Uni

reçues: 10 Décembre 2013; Accepté le 16 Avril 2014; Publié: 20 mai 2014

Droit d'auteur: © 2014 Xu et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Cette recherche a été soutenu par des subventions du Fonds national Key Santé spécial (http://program.most.gov.cn; No.200802112), le Comité national science Fund (http://www.nsfc.gov.cn; projet général Non .81372302 No.81272120), le Fonds Département de la santé (http://program.most.gov.cn; No.2007A093), le projet clé de la province du Zhejiang (http://www.zjkjt.gov.cn; No. 2013C030445 2009C030125). Le Fonds des sciences naturelles de la province du Zhejiang (http://www.zjnsf.gov.cn; No.Y2080001, Y12H160121 et Z2080514), et le Fonds Bureau médecine traditionnelle chinoise (http://wst.zj.gov.cn; No.2007ZA019). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

métastases sont responsables de jusqu'à 90% de la mortalité associée au cancer. De nombreux patients qui manifestent aucun signe de métastases au moment du diagnostic initial seront éventuellement développer des métastases. Bien que les métastases provoquent la plupart des décès par cancer, ce processus reste l'un des aspects les plus énigmatiques de la maladie.

cellules tumorales métastatiques pénètrent le tissu via extravasation. Le tissu, cependant, est soumis à des procédés peu clairs par lesquels les cellules sont ancrées dans la matrice du tissu et en contact direct avec les cellules stromales, dont la plupart sont des fibroblastes normaux. Les cellules tumorales ont toutes les chances d'entrer en contact avec les cellules stromales, y compris les cellules néoplasiques métastatiques [1]. Cela conduit à la diaphonie réciproque avec des fibroblastes normaux dans le tissu.

Les fibroblastes sont les cellules stromales les plus abondants, et ils stimulent le microenvironnement et servent comme une source riche pour la voie paracrine durant la tumorigenèse et la progression. Les effets des fibroblastes normaux sur les cellules tumorales sont contestées. Il a été rapporté que des fibroblastes normaux suppriment la conversion maligne de immortalisés épithélium de la prostate [2], alors que dans les tumeurs du sein, les fibroblastes transforment le carcinome canalaire en carcinome invasif [3].

Ce désaccord indique que l'influence des fibroblastes sur les cellules tumorales est différente de celle des CAFs (fibroblastes associés cancéreuses). Pour cette étude, nous coculture des cellules tumorales avec des fibroblastes normaux dans des boîtes de Pétri afin d'imiter la façon dont les cellules tumorales contact avec des fibroblastes. Nous nous sommes concentrés sur la contribution des fibroblastes normaux de cancer gastrique. On a cultivé les fibroblastes normaux pour former des monocouches denses, qui ont ensuite été diffusées avec des cellules tumorales dans le but de mimer les cellules tumorales métastatiques. Nous avons émis l'hypothèse que le taux élevé de fibroblastes à des cellules tumorales peut mimer les tissus dans lesquels les cellules tumorales métastasées résident. Ainsi, les fibroblastes dermiques d'individus sains ont été utilisés pour produire l'environnement cellulaire. La ligne gastrique des cellules cancéreuses, BGC-823, a été utilisé ici parce qu'il est morphologiquement distinct de fibroblastes.

Déclaration éthique de matériaux et méthodes

tissus primaires dermiques humains ont été obtenus des enfants qui ont subi la circoncision après avoir obtenu le consentement éclairé de leurs gardiens, qui a été inclus dans leurs dossiers médicaux. Cette expérience a été examiné et approuvé par le comité d'examen institutionnel du second hôpital affilié de l'école Zhejiang University of Medicine (code d'éthique: Research 2013-047). Les patients inclus dans cette étude ont été fournis avec une copie du consentement éclairé et a donné l'autorisation de publier.

Toutes les expériences ont été menées conformément aux lignes directrices pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire du Conseil de la science et de la technologie de la Chine. Le protocole d'étude a été approuvé par le soin et l'utilisation des animaux Comité de l'Université de Zhejiang.

Réactifs et anticorps

Pénicilline G /streptomycine, un tampon phosphate salin (PBS), Triton X-100, bovine l'albumine sérique, la collagénase de type I, et la trypsine ont été achetés à Jinuo (Chine). Glucose à haute DMEM a été obtenu auprès de Gibco (Chine), et du sérum bovin fœtal (FBS) a été acheté auprès de Gibco (SA). Cisplatine, 5-fluorouracile, la puromycine et du collagène de type I ont été achetés auprès de Sigma (USA). Cisplatin a été dissous dans du diméthylformamide (DMF), le 5-fluorouracile dans le DMSO et la puromycine dans du PBS afin de rendre les solutions mères qui ont ensuite été stockés à -20 ° C. Le collagène de type I (5 mg /ml) a été dilué à 1 mg /ml. DAPI (4,6-diamidino-2-phénylindole .HCl) dans du PBS a été obtenu auprès de Roche et de chèvre anti-souris et l'IgG de lapin, l'anticorps secondaire-TIRTC et des anticorps secondaires ont été obtenus auprès ZSGB-Bio (Chine). Antihumain-E-cadhérine lapin (ab40772), un lapin antihumaine-vimentine (ab92547) et des anticorps de lapin anti-humain-β-caténine (ab9274) ont été obtenus à partir Abcam (RU). anticorps de souris anti-humaine-pan-CK (C11) et un anticorps de lapin N-cadhérine (C4061) ont été obtenus auprès de Cell Signaling Technology (Chine), et anti-β-actine humain et des anticorps anti-lapin de chèvre secondaire ont été obtenus à partir Boster (Chine) . Les anticorps ont été dilués avec 5% de FBS à des concentrations de travail, sauf mention contraire.

Culture cellulaire

La lignée cellulaire établie, le cancer gastrique humaine BGC-823 cellules utilisées dans notre expérience ont été achetés à partir de la banque de cellules de Guangzhou Institut de la biomédecine et la santé. Les cellules ont été décongelées et soumises à des passages pendant 4-5 heures, puis ont été utilisés dans les expériences de co-culture. fibroblastes dermiques primaires ont été obtenues à partir des échantillons chirurgicaux d'enfants qui avaient subi la circoncision et a fourni un consentement éclairé. Fibroblastes ont été utilisés après le troisième passage (à moins de 50 passages), cultivées dans du DMEM à haute glucose contenant 10% de FBS, et maintenus dans un incubateur humidifié (5% de CO _{2) à 37 ° C. Le milieu cellulaire a été remplacé tous les autres jours.}

Pour la génération des TBGCs, les fibroblastes (FBS) et BGC-823 cellules ont été co-cultivées dans un rapport de 10:01 pour une période supplémentaire de 10 jours après que les cellules cultivées atteint la confluence. On a observé la formation de dôme dans le système de co-culture. Le mélange cellulaire a ensuite été soumise à un passage par trypsinisation des fibroblastes frais (1 x 10 ^{6 cellules /ml). Au cours de la deuxième et les suivantes passages, formation doom apparente et les cellules de forme ronde en suspension apparus qui présentaient diverses caractéristiques morphologiques et la fixation prolongée après passage. Après le cinquième passage des cellules mixtes en suspension et des fibroblastes normaux denses, uniformes, courtes cellules de broche-like, appelées "TBGCs" ont été produits et ne démontraient pas la réversion morphologique BGC-823 cellules jusqu'à >. 10-15 passages}

Essai de prolifération

Exponentially cellules en croissance ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits pour un supplément de 6 jours d'incubation à 37 ° C dans un humidifié à 5% de CO _{2 atmosphère. La prolifération cellulaire a été mesurée en cinq exemplaires chaque jour par pipetage 20 ul CellTiter 96 AQueous One Solution réactif (Promega, USA) dans chaque puits contenant 100 pi-DMEM riche en glucose, puis les cellules ont été incubées pendant 2 heures avant de déterminer l'absorbance relative à 490 nm en utilisant un lecteur de plaque de microtitrage.}

Drug test d'inhibition

Cinq duplications de cellules en croissance exponentielle ont été ensemencées dans une des plaques à 96 puits et incubées pendant 24 heures. Au bout de 24 heures, le milieu a été remplacé par différentes concentrations de médicaments (0-80 pm) et cultivées pendant 24 heures supplémentaires. La toxicité du médicament a été évaluée en mesurant le nombre de cellules viables en utilisant l'essai de prolifération décrits ci-dessus.

Dosage de grattage

Les cellules ont été ensemencées sur des plaques à 24 puits (5 x 10 ^{4 cellules /puits) et cultivées jusqu'à la confluence. Les pointes de pipette ont été utilisés pour générer des rayures. PBS a été utilisé pour éliminer les débris cellulaires, puis remplacé par du milieu FBS libre. Les images ont été obtenues pendant 3 jours consécutifs. La largeur de la rayure a été mesurée en utilisant le logiciel ImageJ 1.47 pour Windows (http://rsb.info.nih.gov/ij/) et tracé comme la distance de zéro par jour.}

Migration et Invasion Assay

motilité cellulaire dosage a été réalisée en utilisant transwell inserts (8 pm de taille des pores) (Corning, États-Unis). Cellules-GFP (Green Fluorescent Protein) (1 × 10 ^{5/500 ul) ont été suspendues dans un milieu FBS-libre et placé au-dessus des inserts en triple exemplaire, avec un milieu de culture de 800 pi chargé en dessous. Après incubation jusqu'au lendemain, les inserts ont été lavées 3 fois avec du PBS et essuyées avec un tampon humidifié au-dessus de laquelle fixé avec 4% de PFA ci-dessous et observé en utilisant un microscope à fluorescence (Olympus, Japon). La même procédure a été utilisée pour effectuer l'essai d'invasion, mais des inserts qui ont été pré-revêtues avec du Matrigel (BD, USA) ont été utilisés. Les deux essais ont été quantifiés comme le nombre de cellules comptées dans 5 champs aléatoires (200 × grossissement).}

Apoptose Assay
cellules

apoptotiques ont été mesurées en utilisant le V-FITC kit de détection de l'apoptose Annexin (Keygen, Chine) selon les instructions du fabricant. Les cellules ont été soit non traitées ou traitées avec les médicaments pendant 24 heures, puis récoltées, lavées deux fois avec du PBS, remises en suspension dans un tampon contenant 5 ul de FITC-annexine V et 5 ul de PE de liaison, et on fait incuber à température ambiante pendant 30 minutes. L'analyse a été réalisée en utilisant la cytométrie de flux (FACSCalibur, Becton Dickinson, USA).

quantitative en temps réel
PCR

Des extraits nucléaires ont été préparés en utilisant la mini-kit RNeasy selon les instructions du fabricant. Des échantillons d'ARN purifié (1 pg) dans de l'eau DEPC ont une transcription inverse en utilisant le kit II PrimeScript premier brin d'ADNc Synthèse (Takara, Chine). RT-PCR et l'amplification ont été réalisées en utilisant la trousse SYBR Prémélange Ex Taq II (Takara)

Un système réactionnel de 20 pi contenant 1 pi dilué des échantillons d'ADNc, 10 ul de SYBR Prémélange Ex Taq II (2 x), 0,4. uL ROX Référence Dye (50 ×), 7 ul stérile doublement distillée H _{2O, et 1 pi avant et arrière amorces (voir Matériaux et méthodes S1) ont été préparés et évalués en utilisant une analyse de la courbe de fusion et le cycle de seuil comparative (Ct) méthode. Les conditions de cyclage suivantes ont été utilisées: 95 ° C pendant 10 minutes, suivie de 40 cycles de 95 ° C pendant 15 secondes et 58 ° C pendant 1 minute. GAPDH a été utilisé comme gène de contrôle.}

Western Blot L'analyse

Les protéines ont été extraites à partir de cellules en croissance exponentielle et les tissus primaires. Les extraits ont été bouillis dans un tampon de chargement, réglé sur 10% de Tris-HCl gels de SDS-polyacrylamide et transférées sur des membranes de nitrocellulose (Millipore, USA) en utilisant des procédés standard. Les membranes ont été bloquées en utilisant 5% de lait dégraissé dans une solution salée tamponnée au Tris avec du Tween-20 (TBST) pendant 30 minutes à température ambiante. Les membranes ont été lavées avec du TBST et on fait incuber pendant une nuit à 4 ° C avec des anticorps primaires contre la E-cadhérine (1:5000), la vimentine (1:5000), β-caténine (1:5000), de N-cadhérine (1:1000), et β-actine (1:1000). Après lavage 3 fois avec du TBST secondaire de chèvre anti-lapin (1:1000) a été ajouté et mis à incuber pendant 2 heures à la température ambiante. Enfin, les complexes immuns ont été visualisés par chimioluminescence en utilisant ECL (Electro Chemical Luminescence) (Millipore). La concentration en protéine a été normalisée à la ß-actine.

Analyses histologiques et immunohistochimiques

Les échantillons ont été rapidement congelés dans l'azote liquide, stocké à -80 ° C, fixées dans 4% PFA, et en coupe de une épaisseur de 10 um (LEICA, Allemagne).

pour hématoxyline et l'éosine (HE) coloration, les lames déparaffinées ont été colorées avec de l'hématoxyline pendant 15 minutes, lavé 3 x avec du PBS, l'alcool acide pendant 5 secondes, puis éosine pendant 5 minutes (Boster, Chine).

pour la coloration immunohistochimique, les lames ont été réhydratées et la récupération de l'épitope induite par la chaleur a été réalisée dans un tampon citrate en utilisant un autocuiseur (20 minutes à 80 pKA), bloqué avec 3 % H _{2O 2 pendant 15 minutes, puis le sérum de chèvre normal a été appliqué (30 minutes à la température ambiante). Les lames ont été incubées dans les anticorps primaires suivants: anti-E-cadhérine (1:250), anti-vimentine (1:250), anti-β-caténine (1:250), et anti-pan-CK (1:250 ). Les échantillons ont été mis en incubation pendant une nuit à 4 ° C, on rince deux fois avec du PBS et incubées avec l'anticorps secondaire pendant 2 heures à 37 ° C. kit DAB plus chromogène (Boster) a été utilisé pour détecter tous les antigènes. Les lames ont été contre l'hématoxyline, déshydratées et montées avec des lamelles à l'aide de balata neutre. Les deux analyses ont été effectuées séparément par les pathologistes et les cliniciens qui étaient aveugles aux groupes d'échantillons. Les différends ont été résolus par consensus.}

immunofluorescence et

Cellules de microscopie confocale ont été étalées sur des lames de chambre, et les coupes congelées ont été fixées avec 4% PFA et perméabilisées avec 0,5% de Triton X-100. Les lames ont été bloquées avec du sérum de chèvre normal pendant 1 heure à 37 ° C, on rince et on fait incuber pendant une nuit avec des anticorps primaires à 4 ° C, puis on a transféré et mis en incubation avec des anticorps de chèvre anti-souris et anti-lapin-TIRTC pendant 1 heure à 37 ° C, dans le noir. Les lames ont été lavées à l'aide de la glycérine et monté avec des lamelles. Les noyaux ont été DAPI. La fluorescence a été détectée à l'aide d'un microscope à balayage laser confocal (Olympus). Les cryosections déparaffinées ont été colorées avec du DAPI et analysées à l'aide d'un microscope à immunofluorescence.

Modèle
animaux

Quatre-vingt-quatre semaines vieille souris femelles BALB /c ont été achetés à partir du Centre de recherche animale de Shanghai et maintenu au centre animal expérimental de l'Académie des sciences médicales Zhejiang. Selon les lignes directrices pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire du Conseil de la science et de la technologie de la Chine, tous les animaux ont été maintenus dans des conditions stériles aseptiques et administrés alimentaire autoclavé et de l'eau en conformité avec les principes de protection des animaux de laboratoire de l'Université de Zhejiang. Quarante-quatre souris ont été utilisées dans le modèle sous-cutanée et ont été divisés de manière égale dans les groupes témoins et expérimentaux. Les BGC-GFP ont été utilisées comme contrôle où les TBGC-GFP étaient les utilisations que l'expérience. Les cellules tumorales ont été récoltées au cours de la phase de croissance, et mises en suspension dans un milieu exempt de FBS (1 x 10 ^{6 cellules /ml). Les cellules ont été pipetés à des suspensions monocellulaires et chaque solution à 500 ul ont été inoculées par voie sous- cutanée au niveau des deux côtés de la poitrine. Les souris ont été euthanasiées toutes les 2 semaines jusqu'à 10 semaines, et les examens pathologiques ont été effectuées. Toutes les souris ont été pesées tous les 3 jours. Toutes les interventions chirurgicales ont été réalisées sous pentobarbital de sodium à 1%, et tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance.}

Trente-six souris ont été utilisées dans le groupe d'injection de la veine pour l'évaluation de la distribution du cancer (18 souris dans le groupe témoin BGC-GFP et 18 souris dans le groupe expérimental TBGC-GFP). 500 ul de suspension cellulaire (5 x 10 ^{5 cellules) a été injecté dans la veine de la queue de souris nues. Les souris ont été euthanasiés à 2 e, 5 e, 8 e et 10 e semaines pour un examen pathologique}

Analyse statistique

Les données expérimentales ont été recueillies. et est entré dans des tableurs. Tests de normalité ont été réalisées avant de comparer les données. Les comparaisons entre les groupes ont été effectuées en utilisant t
test de Student. Une analyse de variance a été utilisée pour comparer > 3 groupes, et la méthode de Tukey a été utilisé pour post hoc
comparaisons de groupes. Dans cette étude, p
< 0,05 est considérée comme statistiquement significative. SPSS 20.0 pour Windows (IBM SPSS Statistics, http://www-01.ibm.com/support/docview.wss?uid=swg24029274) a été utilisé pour effectuer toutes les analyses statistiques. R (ggplot2) (http://www.r-project.org/; http://www.r-project.org/) a été utilisé pour générer toutes les présentations graphiques

Résultats
<. h3> 1. Les changements morphologiques dans BGC-823 Cells Mimick stromales

Fibroblastes (FB) et BGC-823 cellules ont été co-cultivées dans un rapport de 10:01 pendant 10 jours supplémentaires après les cellules cultivées ont atteint la confluence. Le mélange cellulaire a ensuite été soumise à un passage par trypsinisation des fibroblastes frais (1 x 10 ^{6 cellules /ml) (figure 1.1). formation Dome dans les cellules BGC-823 a été observée après le premier passage. Au cours de la deuxième et les suivantes passages, suspendus cellules en forme ronde sont apparus dans le système de culture: certaines regroupées en grappes ou des touffes et ont été vaguement reliés à la surface des fibroblastes. Les cellules BGC-823 parallèles cultivées ont montré que quelques cellules de forme ronde à la base lorsque la culture est devenue surpeuplée. Les cellules mixtes en suspension présentent diverses caractéristiques morphologiques et l'attachement prolongé après le passage. Ces cellules ont démontré soit un aspect pavé comme similaire à BGC-823 cellules ou courtes caractéristiques de broche-like. Uniforme, cellules courtes, broche-like ont été produites par le passage des cellules en suspension mixtes et des fibroblastes normaux denses. En revanche, le passage du surnageant des cellules BGC-823 seulement démontré les débris après 24 heures de culture, dans laquelle de petites quantités de cellules ont survécu pour former pavées comme des clones semblables à parentaux BGC-823 cellules (Figure 1.3A-H).}

des expériences ultérieures ont été réalisées pour déterminer la source des cellules en suspension dans le système cocultivés. BGC-823 cellules et les fibroblastes ont été transfectées avec cassette GFP-puro et la cassette DP-puro, respectivement, et nommé BGC-GFP et FB-DP, respectivement. Après coculture, BGC-GFP a grandi dans des empilements et a formé une structure en forme de dôme. Pendant ce temps, les cellules rondes ou en forme de sphéroïde qui ont été mises en suspension dans les milieux ont été transférés sur des plaques de culture et marquées par fluorescence verte, ce qui démontre que la co-culture à long terme avec des fibroblastes induit une transformation BGC. cellules rondes et sphéroïde qui ont été suspendus dans le milieu ont également été observées en utilisant la fluorescence verte et pourraient être repiquées sans addition de fibroblastes (Figure 1.2A-D). Après plusieurs cycles successifs de coculture, transformées BGC-823 cellules (TBGCs) ont été obtenus qui est apparu plus uniforme, courte, et la broche-like. Ces cellules ont ensuite été repiquées sans addition de fibroblastes. Fait intéressant, ces cellules étaient plus enclins à former des structures sphéroïdes que les cellules qui se sont développées jusqu'à la confluence et n'a pas démontré la réversion morphologique BGC-823 cellules jusqu'à ce que >. 10-15 passages

Une étude précédente a rapporté que les fibroblastes inhibent la croissance d'autres cellules lorsqu'elles sont co-cultivées in vitro
par le mécanisme d'inhibition de contact [4]. Dans nos expériences, cependant, des fibroblastes normaux ne pas contacter inhibent la prolifération des BGC-823 cellules. Au lieu de cela, FB-RFP progressivement périt avec BGC-GFP prolifération lorsque la culture a été étendue à 10 jours. Par conséquent, la supplémentation FB consécutive a été nécessaire pour le passage et de maintenir la production stable de TBGCs. Nous avons également observé que, lorsqu'une petite quantité de TBGCs a été ajouté à la feuille de fibroblastes confluentes, les cellules tumorales qui se sont développées ont été repoussés à l'extérieur par les fibroblastes. Dans le centre de la colonie de la tumeur, les cellules ont été de forme ronde, avec des pièces jointes tout en vrac à la base (Figure 1.3A-H).

2. Transition épithéliale-mésenchymateuse du BGC-823 Cellule à TBGC

PCR en temps réel a été utilisé pour analyser l'expression de l'ARNm. Les résultats montrent que l'expression de la E-cadhérine a été remarquablement régulée à la baisse en même temps que la régulation positive de la vimentine dans TBGCs. Pendant ce temps, les expressions de torsion, escargot, limace, et la N-cadhérine ont tous été surexprimés (Figure 1.5). Immunofluorescence et Western blot confirment la perte E-cadhérine et de l'augmentation de l'expression de la vimentine, la N-cadhérine, et la β-caténine (figure 1.4), ce qui confirme que la transition épithélio-mésenchymateuse à long terme (EMT) est présent dans TBGCs. E-cadhérine est une caractéristique éprouvée de EMT et maintient l'attachement cellule-cellule dans l'épithélium. perte E-cadhérine pourrait conduire à la tumeur verser plus de cellules hors de la masse tumorale.

3. Prolifération, Invasion, et la mobilité de

TBGC la prolifération des TBGCs a été analysée en utilisant le test MTS. TBGCs a démontré un taux de prolifération accélérée ( p
< 0,01) (Figure 2.1). Cytométrie de flux (voir Matériaux et méthodes S1) montre que 13% des TBGCs ont été retenus dans la phase S, contre seulement 7% des BGC-823 cellules (Figure S1.3). L'essai indique que le grattage TBGC motilité accrue en comparaison avec paternels BGC-823 cellules (figure 2.2-2.3A-H). TBGC anastomose requis 3 jours après le début des rayures, tandis que > 4 jours ont été nécessaires pour BGC-823 cellules ( p
< 0,05) (Figure 2.2)

Les résultats de. les essais d'invasion de Matrigel montrent que TBGCs sont plus agressifs que BGC-823 cellules. Au total, 683.67 ± 170,83 TBGCs infiltré le Matrigel par rapport à 188.33 ± 58.62 BGC-823 cellules dans le groupe témoin ( p
< 0,01) (Figure 2.4, Figure 2.5A, B). Cependant, TBGCs a démontré une réduction significative dans les cellules migrées: 2 fois moins de BGC-823 cellules selon l'essai de migration Transwell ( p
< 0,01) (Figure 2.4, Figure 2.5C, D). La nature suspendue des TBGCs pourrait expliquer cette réduction, le taux d'adhésion est seulement 68,33 ± 10,41% en TBGCs sur Matrigel tandis que 99,77% ± 6,25% BGC-823 cellules, a démontré lente attachement à la surface Matrigel dans TBGCs (tableau S1) .

pour mieux imiter in vivo
comportement de la tumeur, le gel de collagène de type I a été utilisé pour déterminer la relation entre les fibroblastes et les capacités invasives de BGC-823 cellules et TBGCs. gel de collagène de type I a été préparé sur les inserts Transwell avec des fibroblastes (voir Matériaux et méthodes S1). les gels chargés fibroblaste ont été cultivées pendant 7 jours, puis les cellules cancéreuses GFP marquées ont été semées sur le gel et on les cultive pendant les 7 jours suivants. L'inspection des gels récoltés ont révélé que les cellules tumorales ont pénétré dans les gels de collagène. Lorsque les gels ont été chargés avec des fibroblastes, TBGCs présentait plus renforcée la capacité invasive que BGC-823 cellules, comme indiqué par le nombre de cellules qui a infiltré les gels (Figure S1.2).

4. TBGCs Exposée Résistance Cisplatin

Ensuite, nous avons évalué la sensibilité des TBGCs à chimiothérapeutiques de cancer gastrique standard. BGC-823 viables des cellules et TBGCs ont été déterminées après 24 heures d'exposition au cisplatine (0, 20, 40, 60, 80 uM) en mesurant l'incorporation de MTS. Les résultats démontrent que TBGCs présentait une remarquable résistance à la cisplatine, alors que quelques cellules BGC-823 ont survécu lorsque la concentration en cisplatine a été élevée à 40 uM ( p
< 0,001) (figure 3.1). TBGCs viables pourraient même être détectées lorsque la concentration en cisplatine a été élevée jusqu'à 200 uM (données non présentées). Nous avons effectué une analyse cellulaire apoptose par cytométrie en flux pour valider la résistance au cisplatine. Les résultats montrent que le taux de survie TBGCs était d'environ 42,40% par rapport à 13,80% pour les cellules BGC-823 après un traitement avec 40 uM de cisplatine pendant 24 heures (figure 3.3 à 3.4). Cependant, lorsqu'ils sont traités avec 5-FU, il n'y avait aucune différence significative dans l'inhibition de la tumeur entre TBGCs et BGC-823 cellules selon le test au MTS (figure 3.2). Les deux cellules tumorales ont démontré chimiorésistance au 5-FU (Figure 3.2).

5. TBGCs exposition In vivo
ganglionnaire Propensity

Pour déterminer le in vivo
distribution de TBGCs, 5 x 10 ^{5 BGC-823 cellules ou TBGCs ont été injectées dans la veine de la queue de souris BALB /c. Deux semaines après l'injection, la variance dans le col de l'utérus auxiliaire et les métastases des ganglions lymphatiques ont été observées dans les deux groupes, comme indiqué par l'évaluation d'un traceur fluorescent (figure 4.3A-F). les cellules positives pour la GFP ont été trouvées dans le ganglion lymphatique inguinal auxiliaire et dans les deux groupes (figure 4.3A, B, D, E). Cependant, les cellules positives pour la GFP ne sont apparus dans les poumons des souris dans le groupe BGC (figure 4.3C, F).}

À la semaine 5, en complément d'une invasion dans les ganglions lymphatiques, l'infiltration d'organes a été également observé. Plus invasion des ganglions lymphatiques a été observée dans le groupe TBGC que le groupe de contrôle de la BGC à chaque point de temps (Figure 4.1, vidéo S1). Ces ganglions lymphatiques ont été déterminés à être pan-CK positive (Figure S2.1). Nous avons également observé TBGC différents et la distribution dans les organes BGC. TBGCs étaient limitées aux tissus gastro-entériques, alors BGCS installés dans les poumons et les intestins (Figure 4.2A-H). À la semaine 5, la métastase intestinale a été observée d'abord dans 3/4 des souris qui ont été injectés avec TBGCs, alors que seulement 25% des souris ont montré des métastases intestinales visibles après l'injection de BGC (Figure S2.3).

Comme les tumeurs développées, le nombre moyen de métastases TBGC intestinale a augmenté (5,6 ± 3.911 vs
3,5 ± 1.914 BGCS à la semaine 8; 6,33 ± 1,52 vs
5,6 ± 1.342 à la semaine 10) (Figure S4.2) . Fait intéressant, 3 5 souris dans le groupe TBGC démontré néoplasmes mégascopique dans le gastrum après 10 semaines, ce qui n'a pas été observé dans le groupe BGC. mégascopique métastases pulmonaires ont été trouvés dans 3 sur 4 souris BGC à la semaine 8. Toutefois, l'absence de métastases pulmonaires visibles TBGC ont été observées à 10 semaines (figure 4.2A-H). inspection microscopique a révélé l'infiltration de TBGCs dans la lymphe cervicale et axillaires dès 1 semaine après l'injection veine de la queue, tandis que BGCS requis plus de temps (3 semaines) pour entrer ces ganglions lymphatiques (figure 4.1). Cinq semaines après l'injection des cellules, l'infiltration pulmonaire a été observée dans le groupe BGC. Cependant, aucun TBGCs ont été détectés dans les organes jusqu'à 10 semaines après l'injection (Figure 4.2b, F, Figure S2.3)
.

La coloration immunohistochimique a indiqué l'augmentation progressive de la E-cadhérine dans les ganglions lymphatiques du groupe TBGC , alors que l'expression E-cadhérine a légèrement diminué dans le groupe BGC ( p
< 0,01) (Figure 4.4A-P). Les différences étaient significatives à 8 et 10 semaines, quand l'expression de la E-cadhérine était beaucoup plus élevé dans le groupe TBGC par rapport au groupe BGC (figure 4.5). L'expression de la β-caténine a également augmenté avec le temps dans le groupe TBGC, qui a culminé à 8 semaines, puis a légèrement diminué (Figure 4.5). Les résultats montrent également l'expression β-caténine ont augmenté dans le groupe TBGC à 5, 8 et 10 semaines ( p
< 0,01). (Figure 4.5)

6. TBGCs démontrée Formation tumorale faible mais élevé métastase ganglionnaire Capacité dans notre sous-cutanée Tumorigenesis Modèle

Parce que les cellules tumorales sont plus susceptibles de former des néoplasmes quand implantation sous-cutanée, (GFP +) TBGCs et les BGCS ont été implantés en injectant 5 x 10 ^{5 cellules tumorales viables dans les tissus sous-cutanés des deux côtés de la poitrine. tumeurs naissantes dans le groupe BGC ont été détectés dès 3 jours après l'implantation, et toutes les souris du groupe BGC ont développé des tumeurs au niveau des sites d'implantation après 1 semaine d'incubation (Figure 5.1A). Il est frappant que les TBGCs implantés ont donné aucune tumeur indétectables jusqu'à 8 semaines (Figure 5.1, vidéo S2). L'escalade de la dose de TBGC à 5-10 × 10 6 cellules implantées seulement conduit à la formation d'amas de petites tumeurs et l'augmentation lente du volume de la tumeur ainsi que le temps d'incubation. En outre, les souris du groupe BGC est devenu moribond, apparemment en raison de la charge tumorale accrue (données non présentées).}

autopsies du corps entier à chaque spectacle intervalle de temps qui TBGCs, au lieu de tumeurs primaires visibles, infiltré adjacent et les ganglions lymphatiques distales, alors que les masses tumorales BGC générés ont été confinés à des capsules fibrotiques intactes au niveau des sites d'injection (vidéo S2). La lymphe globale régionale nœuds métastases dans le groupe TBGC ont été trouvés aussi tôt que 2 semaines après l'implantation, alors que les ganglions lymphatiques régionaux métastases ont été détectées à 4 semaines dans le groupe BGC (figure 5.2). L'analyse de Kaplan-Meier montre que les TBGCs ont démontré un plus grand risque de se développer en métastase ganglionnaire que BGCS (Figure 5.2).

métastases intestinales étendues étaient également évidentes dans toutes les souris du groupe TBGC à 8 semaines et par la suite (Figure S4.1 Figure S4.4). Le nombre moyen de nodules intestinaux était de 5,50 ± 1,73 à la semaine 8 et 7,33 ± 1,79 à la semaine 10. En revanche, seulement 1 souris dans le groupe BGC a démontré 3 infiltrations intestinales à la semaine 9 (Figure S4.1).

traçage GFP indique la formation locale de la tumeur dans le groupe BGC au niveau du site d'injection sans infiltration régionale des ganglions lymphatiques. En revanche, TBGCs est apparu dans les ganglions lymphatiques axillaires, mais une fluorescence verte n'a pas été détectée dans les tissus au niveau du site d'injection (figure 5.3). A la semaine 6, TBGCs-GFP accumulée dans les ganglions lymphatiques mésentériques et du rectum. Cependant, seule une souris avec mésentérique métastases des ganglions lymphatiques positifs a été détecté dans le groupe BGC. pan-CK immunohistochimique coloration indique que TBGCs métastasé aux ganglions régionaux (début) et distales lymphatiques (fin), alors que seulement BGCS métastasé aux ganglions lymphatiques régionaux (fin) dans la période d'expérimentation (Figure S4.5). TBGCs également métastasé aux intestins à une semaine quand il n'a pas été trouvé dans le groupe BGC.

HE coloration démontre que les cellules anormales sont apparues dans les ganglions lymphatiques régionaux au cours des premières étapes du groupe TBGC et les stades tardifs de la groupe BGC (Figure S4.6). Analyse immunohistochimique de l'expression de la protéine à partir de 2 semaines montre la régulation négative de la E-cadhérine et de β-caténine et une expression accrue de la vimentine dans TGBC LNS en comparaison avec BGC-néoplasique. Ces résultats ont ensuite été confirmés par analyse Western blot des échantillons de tissus, qui ne détectent E-cadhérine dans TGBC-MILD; Pendant ce temps, la N-cadhérine a également été fortement downregulated dans TGBC-MILD (Figure S3.3-3.4).

La coloration immunohistochimique indique l'augmentation progressive de la E-cadhérine dans les ganglions lymphatiques du groupe TBGC avec le temps, alors que l'expression de la E-cadhérine a légèrement diminué dans le groupe BGC ( p
< 0,01) (Figure 5.4).

• PLOS ONE: Prohibitin Déréglementation d'expression dans le cancer gastrique est associée à l'extrémité 3 'Untranslated Région 1630 C > T Polymorphisme et Copy Number Variation
• PLOS ONE: Activation des Cellules souches mésenchymateuses par Macrophages Invites gastrique de croissance humaine cancer par NF-kB Pathway