Доступность данных: Все сырые данные данных и нормированные были показаны в http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE69342 (GSE69342)
<р> Финансирование:. Эта работа была выполнена при поддержке Национального Программа Key Basic Research Project ( "973" Программа, No. 2010CB529302, No. 2010CB529305, № 2010CB529306); Национальный фонд естественных наук Китая (№ 81301763); Хэнань провинциальных ключевых научно-технических проектов (№ 142102310473); Ключевые программы, Национальный фонд естественных наук Китая (№ 81030044)
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов
Введение Дифференциально выразил lncRNAs GO анализ Тропинка анализ в реальном масштабе времени количественной проверки ПЦР Для того, чтобы изучить данные микрочипов, шесть до регулируемых lncRNAs и десять нерегулируемых lncRNAs были выбраны случайным образом из последовательно дифференциально выраженных lncRNAs с использованием SGC7901 /ADR, SGC7901 /VCR и SGC7901 cellines и QRT-PCR результаты и данные микрочипов согласуются (рис 6A); для дальнейшего изучения уровней экспрессии этих lncRNAs в тканях с лекарственной устойчивостью желудка, двадцать резистентных к лекарственным средствам образцы желудка и в паре, не являющиеся множественной лекарственной устойчивостью ткани были исследованы на уровень экспрессии этих lncRNAs с помощью количественной ПЦР в реальном времени (QRT-PCR) (рис 6В) .The результаты показали, что желудочные образцы рака, обработанные ADR в течение 5 дней экспонируемых существенное различие уровней экспрессии этих шестнадцати lncRNAs afformentioned по сравнению с контрольными группами (рис 6в). Кроме того, корреляционный анализ показал, что уровни экспрессии lncRNA NR_015379 отрицательно коррелировали со скоростями ингибирования этих двадцати образцов лекарственной устойчивостью желудка (рис 6D и 6Е, р &л; 0,01). Заявление по этике <бр> <р> Все экспериментальные процедуры были одобрены Институциональным наблюдательным советом Четвертого военного медицинского университета. Письменное информированное согласие было получено для всех образцов пациентов. Клеточные линии и условия культивирования человеческой линии клеток GC SGC7901 был полученный из Академии военных медицинских наук (Пекин, Китай). Полирезистентный сублиний SGC7901 /VCR и SGC7901 /ADR были разработаны в нашей лаборатории. SGC7901 /видеомагнитофон, SGC7901 /АДР, и SGC7901 культивировали в среде RPMI 1640 (Thermo Scientific, США) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS) (ThermoScientific) в 5% CO2 увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С. Винкристина (VCR; Sigma, Inc., Сент-Луис, штат Миссури; 1,0 мкг /мл) и АДР (Sigma, Inc., Сент-Луис, штат Миссури; 0,5 мкг /мл) добавляли в среду культивирования клеток соответствующих сублиниях к поддерживать фенотипа лекарственной устойчивостью Строительство пкДНК3.1 (+) -. ARNT плазмида Генерация стабильной клеточной линии ARNT Малые РНК-интерференции (миРНК) трансфекцию вестерн-блоттинга Тарелка колонии Анализ образования В этом изучение, анализ Информатик данные были выполнены KangChen Biotech (Шанхай, Китай) PR .Все слайдов были отсканированных при 5 лм /разрешение пиксела с использованием сканера Axon GenePix 4000B (Molecular Devices Corporation) Рунический от Genepix Pro 6.0 программного обеспечения (Axon). Отсканированные изображения (формат JPEG), затем выполняется выравнивание по сетке и данных анализа экспрессии с помощью NimbleScan программного обеспечения (версия 2.5). Данные экспрессии были нормализованы через Robust многокристальные Average (РМА) алгоритма, включенного в программное обеспечение NimbleScan. Кроме того, файлы уровня зонда и файлы уровня мРНК были получены после нормализации. Все файлы на генном уровне были импортированы в программное обеспечение Agilent GeneSpring GX (версия 11.5.1) и нормированная квантиль методом; Затем, программное обеспечение боевой используется для регулировки нормированной интенсивности для удаления пакетных эффектов. Значительно дифференцированно выраженные lncRNAs и мРНК были идентифицированы с помощью фильтрации Вулкан участка. Иерархическая кластеризация проводили с использованием Agilent GeneSpring GX программного обеспечения (версия 11.5.1) [56]. Данные выражали в виде средних значений ± стандартное отклонение (SD). Линейный корреляционный анализ проводили с использованием метода Пирсона в SPSS, версия 17.0 (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс). Различия считались достоверными при P значении < 0.05.
<р> множественная лекарственная устойчивость ( МЛУ) остается одним из основных препятствий для отказа химиотерапии при лечении рака желудка, который является основной причиной рака, связанных смерти во всем мире. Множественные множественная лекарственная устойчивость белков, связанных с (МСП) [1] или микроРНК [2], которые опосредуют MDR через различные механизмы были ранее идентифицированы. Однако механизмы, лежащие в основе МЛУ ГК остается далеко от полной ясности.
<Р> геномы Секвенирование показало, что геномы эукариот кодируют удивительно большое количество некодирующих транскриптов по сравнению с прокариот геномов. Среди этих некодирующих транскриптов, многие из них длинные некодирующие РНК (lncRNAs), которые играют важную роль в регуляции транскрипции мРНК или трансляции на транскрипционных или посттранскрипционных уровнях. lncRNAs являются РНК, которые испытывают недостаток кодирования потенциал, которые являются &GТ; 200 пар оснований и счета в течение по крайней мере 80% транскриптов всего генома [3]. Накопленные данные указывают на то, что lncRNA играет важную роль в регуляции мРНК [4], органеллы Биогенез [5], субклеточная оборот молекул [6], и развитие клеток [7] [8].
<Р> LncRNA дизрегуляции принимал участие в нескольких видах заболеваний, включая рак [ 4 , 9 , 10 ]. А именно, lncRNAs могут играть важную роль в канцерогенеза, метастазирование и инвазивность множественных злокачественных опухолей через воздействие экспрессии онкогенов. Например, ингибитор СОХ-2-lncRNA, PACER, может действовать в качестве новой потенциальной мишенью для COX-2-модуляции в воспалении и раке [11]; RNAi-опосредованной нокдауна из LINC01081 в нормальных эмбриональных фибробластов легких показали, что этот lncRNA позитивно регулирует FOXF1 уровень транскриптов, что говорит о том, что снижение экспрессии LINC01081 может способствовать развитию альвеолярного капиллярного дисплазии с перекосе легочных вен [12]; lncRNA HOTAIR также может быть ценным прогностическим для лечения рака толстой кишки [13] и MALAT1 можно было бы рассматривать в качестве потенциального прогностическим признаком и может быть мишенью для диагностики и генной терапии для протока поджелудочной железы аденокарциномы [14]; избыточная экспрессия lncRNA H19 усиливает канцерогенез и метастазирование рака желудка и эффект H19 в GC опосредуется прямым повышающей регуляции ISM1 и косвенного подавления экспрессии CALN1 с помощью микроРНК-675 [15]. Поэтому, чтобы получить предварительное представление о молекулярных механизмах MDR ГХ, мы изучили профиль экспрессии lncRNA ГК MDR сублиниях.
<Р> Здесь мы изучали дифференцированно профили экспрессии lncRNAs и мРНК между GC cellline SGC7901 и МЛУ сублиний SGC7901 /ADR и SGC7901 /VCR с использованием анализа микрочипов lncRNA. Сравнение дифференцированно выраженных транскриптов между сублиниях и родительской cellline выявлено 15 путей, которые соответствовали понижающей регуляции транскриптов и 20 путей, которые соответствовали вверх-регулируемых транскриптов (р значение отсечки составляло 0,05). Джин Онтология (ГО) анализ показал, что наиболее сильно обогащены термины GO для повышающей регуляции транскриптов были "Развитие системы", "нуклеосома", и "связывание" и наиболее обогащенные термины GO для понижающей регуляции транскриптов были "стерин биосинтетических процесс "," клетка-периферия ", и" стероид дегидрогеназы ". Наши результаты показали, что профили экспрессии мРНК lncRNA и достоверно отличались между МЛУ сублиниях и родительским CELLine. Эти данные свидетельствуют о том, что отклоняющиеся уровни экспрессии lncRNAs могли бы внести свой вклад в развитие МЛУ ГК. Дальнейшее изучение различий в профилях экспрессии lncRNA могут предоставить новые потенциальные методы для реверсирования MDR фенотип GC.
Результаты
<р> Данные микрочипов highthroghput lncRNA показал в общей сложности 27,883 lncRNAs выраженных в желудочном cellline рака, SGC7901 и два сублиний множественной лекарственной резистентности, SGC7901 /ADR и SGC7901 /VCR (S1 Таблица). Для того, чтобы вывести отношения между образцами, иерархический кластерный анализ был использован для организации celllines на группы в соответствии с их уровнями экспрессии, представляя отношения режимов экспрессии lncRNA между celllines (рис 1А и 1В). Дальнейшее изучение этих данных выставляют в среднем за 1637 дифференцированно выражены lncRNA. Среди них 638 были последовательно повышающей регуляции и 999 последовательно вниз регулируется (сложите change≥2.0) (S2 Table). ASHG19A3A028863 (сложите изменение: 146.0139) был самым (изменение раза: 58,7105) до регулируемых lncRNA и ASHG19A3A007184 был самым вниз регулируется lncRNA. Кроме того, вниз регулируемые lncRNAs были более распространены, чем до регулируемых lncRNAs в наших данных микрочипов (S2 таблицу).
Дифференциально выразил
мРНК <р> Были 19,644 мРНК, идентифицированные в сублиниях GC MDR проанализированных экспрессия мРНК профилирование данных с использованием микрочипов анализа и иерархического кластерного анализа представлены взаимосвязи между режимами экспрессии мРНК, которые присутствовали в сублиниях GC с множественной лекарственной устойчивостью и их родительских CELLine (рис 2А и 2В) (S3 таблица). Среди дифференциально выраженной мРНК между SGC7901 /ADR, SGC7901 /VCR и SGC7901, 730 был последовательно вверх регулируется и 650 был последовательно вниз регулируется в SGC7901 /ADR и SGC7901 /VCR celllines по сравнению с SGC7901 (рис 2В). (S4 Таблица). NM_000735 (символ гена: CGA, складка изменение: 106,19) был самым повышающей регуляции мРНК, и NM_001136574 (символ гена: LANCL1, сложите изменение: 25,43) был самым понижающей регуляции мРНК (рис 2В)
<р> Чтобы определить ген и ген атрибуты продукта в биологических процессах, клеточных компонентов и молекулярных функций, Джин Онтология (ГО) анализ проводился таким образом. точный критерий Фишера делается, чтобы проверить, если есть больше перекрытие между списком DE и список аннотаций GO, чем можно было бы ожидать случайно. Р-величина означает значение GO терминов обогащения в генах DE. Чем ниже значение р, тем большее значение GO Term (величина р &л; = 0,05 рекомендуется). Он показал, что самый высокий обогащенные мишенью ГО повышающей регуляции транскриптов были гомеостаз ткани (GO: 0048731; онтология: биологический процесс; р = 6.84E-08) (рис 3А), нуклеосома (GO: 0000786; онтология: клеточный компонент; р = 2.10E-07) (рис 3B) и связывание (GO: 0005488; онтология: молекулярная функция; р = 0,001) (рис 3C), и что самый высокий, обогащенные ГО охваченными понижающей регуляции транскриптов процесс биосинтетическая стеринов (GO: 0016126; онтология: биологический процесс; р = 0,000) (рис 3D), периферии клетки (GO: 0071944; онтология: клеточный компонент; р = 3.80E-06) (рис 3E) стероид дегидрогеназы (GO: 0016229; онтология: молекулярный функция; р = 0,001) (рис 3F) (S5 Table)
<р> в этом исследовании анализ пути выставлялись, что 20 путей последовательно соответствовали вверх-регулируемых транскриптов и что больше всего. обогащенный сеть была "Алкоголизм-гомо сапиенс (человек)" (Fisher-P значение = 3.66E-08), состоящий из 24 целевых генов (рис 4а); Кроме того, анализ пути также показал, что 15 путей последовательно соответствовали понижающей регуляции транскриптов и, что наиболее обогащены сеть была "Стероидные биосинтез гомо сапиенс (человека)" (Fisher-P значение = 0,00044), состоящий из 5 целевых генов (рис 4B ) (Таблица S6, рекомендуемое значение р отсечки составляет 0,05). Среди этих путей, категория гена нарушение "циркадного ритма", как сообщается, связаны с различных видов рака, включая рак желудка [16], хронический миелоидный лейкоз [17], головы и шеи плоскоклеточный рак [18], печеночно-клеточной карциномы [19 ], рака эндометрия [20], а также рак молочной железы [21]. Категория ген "NOD-подобный сигнальный рецептор путь", который состоит из Nod1, было показано, что Nod1 /CARD4 и NOD2 /CARD15 полиморфизм гена, может быть связано с изменением риска желудка [22], ободочной и прямой кишки [23], легких [24 ], гортани [25], желчного пузыря [26], поджелудочной железы [27], тонкой кишки, почек [28], рак мочевого пузыря [29], рак кожи, лимфома [30] и лейкоза [31]. Здесь мы также исследовали экспрессию и функцию АРНТ (арилуглеводородному рецептора ядерного транслокатора) опосредованного MDR1 (множественная лекарственная устойчивость 1) до регуляции пути. Было установлено, что ARNT и MDR1, были значительно повышающей регуляции в SGC7901 /ADR и линий /VCR клеток SGC7901 по сравнению с SGC7901, эффект значительного повышающем регулирования MDR1, опосредованного ARNT вектором экспрессии, трансфекции была нарушена с помощью Sp1 миРНК трансфекции. Тарелка колонии Анализ образования показал, что SGC7901 /ADR скорости образования клеток колонии были remarably выше в pARNT + /siSp1- группа по сравнению с pARNT + /siSp1 + группе с адриамицина (ADR) дополнения в культуре Meida (р &л; 0,0001) (рис 5).
Обсуждение
<р> Наши предыдущие исследования уже обнаружили, что микроРНК-21 может способствовать устойчивости к лекарственным средствам различных видов рака [32]; LncRNA-MRUL способствует экспрессии ABCB1 в множественной лекарственной устойчивостью желудка сублиниях раковых клеток [33]; CUTL1 активность обратно пропорционально связан с лекарственной устойчивостью и, таким образом, является привлекательным терапевтической мишенью для модуляции множественной лекарственной устойчивости при раке желудка [34]; желудочные ОКК были идентифицированы с VCR-выдержано SGC7901 клеточной линии, характеризуется высокой туморогенности и способностью к самообновлению и дифференцировке [35]; MAD2 может играть важную роль в развитии рака желудка человека и заставить замолчать ген MAD2 может помочь справиться с множественной лекарственной устойчивостью желудка раковых клеток [36] и экспрессию MGr1-Ag /37LRP гипоксией вызвал активированных HIF-1 зависит при активации ERK. Эти события зависят от реактивных промежуточных кислорода [37] .Однако, механизмы множественной лекарственной устойчивости ГК гораздо более изучены и lncRNAs дисрегуляция GC MDR сублиниях до сих пор не изучены.
<Р> В этом исследовании GC клеточная линия , SGC7901, и два MDR сублиний, SGC7901 /VCR и SGC7901 /ADR были подвергнуты анализу lncRNA микрочипов. Биоинформатики и проверочные эксперименты были проведены с целью изучения потенциального lncRNAs, участвующих в развитии МЛУ. Анализ показал, что Тропинка 15 путей соответствовали понижающей регуляции транскриптов и 20 путей соответствовали повышающей регуляции транскриптов (р-величина отсечки составляет 0,05). GO анализ показал, что самый высокий обогащенные мишенью ГО повышающей регуляции транскриптов были "Развитие системы" и самые высокие esenriched мишенью ГО понижающих регулируемых транскриптов были "процесс биосинтетическая стерин".
<Р> Растущие доказательства показали, что lncRNA ( длинные РНК некодирующих) могут сыграть важную роль в процессе канцерогенеза и опухолевой инвазии и метастазированию [38]. Например, Джон [39] и т.д. показал, что lncRNA PCGEM1
ассоциируется с раком простаты; был найден трансформирующий фактор роста-β-индуцированной lncRNA-Smad7 ингибировать апоптоз молочной железы мыши рака JygMC (А) клеток и, таким образом, предлагают эд сложный механизм для регулирования Антиапоптозный и опухолеподобных прогрессивные аспекты TGF-бета сигнализации [40]; lncRNA, рак простаты-ассоциированный транскрипт 29 (PCAT29), характеризовался наряду с его связь с рецептором андрогена, функционировал как андроген-регулируемого супрессоров опухоли при раке предстательной железы [41]; Юань и т.д. обнаружил новый TGF-β-индуцированной lncRNA, lncRNA-ATB, который стимулируется EMT через улавливание MIR-200s и облегченный колонизацию за счет стабилизации IL-11
мРНК, тем самым способствуя как ранние и поздние стадии раковых метастаз [42].
<р> было обнаружено, что lncRNAs играют центральную роль в изменении экспрессии кодирующих белок генов через цис- или транс-механизмов. Здесь мы обнаружили, что lncRNAs повышающей регуляции в SGC7901 /ADR и SGC7901 /VCR по сравнению с SGC7901lncRNA таких как AF119893, который был интронных антисмысловой по отношению к Nrp2 (Neuropilin-2). Было высказано предположение, что ось NRP2 /VEGF-C играет роль в развитии рака мочевого пузыря сопротивления терапии и пути VEGF-паксиллина-Nrp2 может представлять новую терапевтическую мишень для рака и других заболеваний, связанных с ангиогенезом. lncRNA AF461897 был интрон чувственное перекрытие ABCB9. Dong т.д. показал, что микроРНК-31 оказали антиапоптозную эффект, скорее всего, через ингибирование ABCB9 и, таким образом, обеспечивают новую стратегию, предусматривающую использование MIR-31 в качестве потенциальной цели в NSCLC химиотерапии. lncRNA BC065904 был интрон чувственное перекрывание CTBP2, один из транскрипционных корепрессоров семейства С-концевой связывающий белок (CtBP), который функционировал как корепрессора из E2F7 и в качестве регулятора ответ на повреждения ДНК. lncRNA NR_026900 был экзон чувственное перекрытие QSOX1, что было показано, чтобы уменьшить пролиферацию, миграцию и инвазию клеток рака молочной железы в пробирке и уменьшает рост опухоли в естественных условиях.
<р> С другой стороны, lncRNAs вниз регулируется в SGC7901 /ADR и SGC7901 /VCR по сравнению с SGC7901lncRNA, таких как AF113689 была естественной антисмысловой по отношению к RRM1. Кхатри и т.д. сообщили, что предварительное облучение RRM1 миРНК снижало значение IC50 гемцитабина гидрохлорида 5 сгибов в А-549 клеток в сравнении с только гемцитабин гидрохлорид, указывая, что RRM1 был потенциальным онкоген рака легких. lncRNA uc010iyh был интронного антисмысловой НПВП (Нейрональная Апоптоз Ингибирующее белка), который является одним из ИПФ-семьи. Было показано, что ИПД могут быть вовлечены в расстройства предстательной железы (ДГПЖ, ПИН и ПК) развития, так как может быть спровоцировать ингибирование апоптоза и пролиферации клеток впоследствии. LncRNA uc003jsd был экзон чувственное перекрытие PDE4D, т.е. что цАМФ-специфические 3 ', 5'-циклический фосфодиэстеразы 4D. Лин и т.д. показал, что PDE4D функции, как фактор опухолевого промотирующее и представляет собой уникальный нацеливаемых фермент раковых клеток. LncRNA NR_002332 был экзон чувственное перекрытие ST7, подавитель туморогенности 7, которое было предложено, чтобы быть ген-супрессор в хромосому области 7q31.1-q31.2.
<Р> анализ показал Тропинка потенциальных путей, вовлеченных в развитие резистентности ко многим лекарственным (MDR) рака желудка. ARNT был одним из 20 путей последовательно соответствовавших до регулируемых транскриптов и, как сообщается, участвует в развитии множественной лекарственной устойчивости множественных злокачественных опухолей [43], в том числе множественной миеломы [44], и AML (острый миелобластный лейкоз) [45] , MDR1 кодирует P-гликопротеин, который является энергетически зависимой Отток насос, который может экспортировать плоские гидрофобные молекулы, в том числе некоторых химиотерапевтических препаратов, таких как адриамицин, цисплатин, таксол и так далее из клетки [46, 47]. Здесь мы обнаружили, что ARNT и MDR1 были значительно выше регулируемых в SGC7901 /ADR и SGC7901 линий /VCR клеток compacared к SGC7901, эффект значительного повышающего регулирования MDR1, опосредованного ARNT вектором экспрессии, трансфекции была взломана с помощью Sp1 миРНК трансфекции, который указал на роль ARNT-MDR1pathway в MDR фенотипа рака желудка.
<р> Дальнейшие исследования показали, что некоторые белок-кодирующих генов, участвующих в лекарственной устойчивости фенотипа и развитие злокачественных опухолей, возможно, были цис-регулируемые коррелированных lncRNAs , Например, ABCB1 (АТФ-связывающего кассетного, подсемейство B (MDR /TAP), член 1, P-гликопротеин (P-зм) ген, кодирующий), расположенный выше по течению от 400Kb lncRNA MRUL (NR_024549: MDR-связанные и вверх регулируется lncRNA), была значительно повышающей регуляции посредством потенциальной роли аксессуара, как играет MRUL и способствовал лекарственной устойчивости фенотип SGC7901 /ADR и SGC7901 /VCR клеток [33]; ADAM22, ген кандидата для злокачественной трансформации яичников эндометриозом [48], коррелировала с lncRNA AL133090 в экзона смысле перекрывающихся способом; PLCG1 коррелировала с lncRNA AK021471 в интрона смысле перекрывающихся образом и возвратные мутации в PLCG1 была выявлена в angiosarcomas [49]; FYN коррелировала с lncRNA АК AK090692 в интрон смысле перекрывающихся путь и antagomir-1290 подавляет CD133 (+) клеток в немелкоклеточного рака легкого путем охвата Фюн, связанных с Src тирозинкиназы семейства [50], и т.д.
<р> Это исследование показало, что дерегулирование lncRNAs был связан с развитием множественной лекарственной устойчивости к phynotype рака желудка. Дальнейший анализ этих lncRNAs и связанных с ними путей могли бы дать представление о механизмах химиотерапевтического лекарственной устойчивости рака желудка и предложить новые направления для обратного множественной лекарственной устойчивости phynotype.
Материалы и методы
Клеточные линии и клеточная культура
<р> человеческой линии клеток GC SGC7901 была получена из Академии военно-медицинских наук (Пекин, Китай). Два с множественной лекарственной устойчивостью сублиний, SGC7901 /VCR и SGC7901 /ADR, были разработаны в нашей лаборатории [51]. SGC7901 /видеомагнитофон, SGC7901 /ADR и SGC7901 выращивали в среде RPMI 1640 (Thermo Scientific Co., США), которая была дополнена 10% телячьей эмбриональной сыворотки (FCS) (Thermo Scientific Co., США) в увлажненном инкубаторе с 5% CO 2 при 37 ° С. Видеомагнитофоны (1,0 мкг /мл) или АДР (0,5 мкг /мл) добавляли в питательную среду соответствующих клеток для поддержания фенотипа лекарственной устойчивостью.
Выделение РНК, мечение и массив гибридизация
<р> Общую РНК собирали из SGC7901, SGC7901 /ADR и SGC7901 /VCR с использованием TRIzol реагента (Invitrogen, CA, USA) и комплект RNeasy (Qiagen Co., Германия) в соответствии с инструкциями изготовителя, в том числе на стадии ДНКазы пищеварения. Суммарную РНК из каждого cellline количественно оценивали с использованием NanoDrop ND-1000 (OD 260 нм, NanoDrop, Уилмингтон, Делавэр), целостность РНК оценивали с использованием стандартных денатурирующих электрофореза в агарозном геле, а чистота была оценена отношением оптической плотности при длине волны 260 нм для 280 нм (А260 /А280). Двухцепочечной кДНК (DS-кДНК) синтезируют с использованием 5 мкг суммарной РНК с помощью DS-набора для синтеза кДНК Invitrogen SuperScript в присутствии 100 пмоль олиго дТ праймеров. Затем, DS-кДНК была помечена и проводили гибридизацию, как описано ранее [52]. Разметка РНК и микрочипов гибридизации проводили KangChen Bio-Tech, Шанхай, PR China.
Highthroughput lncRNA анализ экспрессии профиля
<р> Квалифицированный РНК использовали для синтеза двухцепочечной кДНК с использованием Superscript Double- Многожильный Синтез кДНК Kit (Invitrogen Co., США). Двухцепочечные кДНК метили и гибридизовали с человеческим LncRNA микрочипов V2.0 (Arraystar Co. США). Микрочип V2.0 содержит около 33000 lncRNAs, собранных из авторитетных источников данных, включая NCBI RefSeq, УСК, RNAdb, LncRNAs из литератур и UCRs. Последовательности были выбраны с фирменными стратегиями. Повторите последовательности и нкРНК короче, чем 200 пар оснований были удалены. Для повышения статистической достоверности, каждый человек массив lncRNA состоит из 60,302 различных зондов (60) Мерс и каждая стенограмма была представлена 1-5 зондов. Каждый транскрипт был представлен определенной экзона или сплайсинговых соединений зонда точно идентифицировать отдельные транскрипты. Микрочипов и биоинформатики гибридизации анализ проводили с помощью KangChen Bio-Tech, Шанхай, КНР. Необработанные данные интенсивности и нормированные данные были представлены в Gene Expression Omnibus (GSE69342: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE69342).
Количественные ПЦР в реальном времени (QRT-PCR)
<р> общая РНК SGC7901, SGC7901 /ADR и SGC7901 /VCR был выделен с использованием TRIzol реагента (Invitrogen, CA, USA) и затем обратной транскрипции с использованием набора реагентов PrimeScript RT с GDNA Eraser (Perfect Real Time) (Takara, Далянь Китай) в соответствии с струкцией изготовителя. Выражение восьми до регулируемых lncRNAs и шестью понижающей регуляции lncRNAs измеряли с помощью QRT-PCR с использованием SYBRGreen анализов (Takara, Dalian, China), и GAPDH, был использован в качестве внутреннего контроля. Праймеры представлены в таблице 1. Уровень экспрессии каждого lncRNA был представлен в виде кратного изменения с использованием 2- △△ методов Ct. Уровень экспрессии lncRNAs дифференцированно выражены между SGC7901 и MDR сублиниях SGC7901 /ADR и SGC7901 /VCR анализировали с использованием Т-теста Стьюдента с SPSS (версия 17.0 SPSS ЛНК). Значение р < 0,05 считалось существенным.
<Р> Histoculture Drug Ответ Анализ (HDRA) опухолевая ткань Свежее ГХ собирали из каждого образца хирургически удаленных и помещали в 24-луночный планшет. Кубики коллагеновый гель губки (1 см 3), были погружены в 1 мл среды RPMI 1640, дополняющих с 20% эмбриональной телячьей сыворотки. Опухолевые ткани помещают на коллагеновой губки следующей АДР были добавлены до конечной концентрации 6 мкг /мл и инкубировали их при 37 ° С с 5% СО2. Опухолевые ткани, обработанные физиологическим раствором (N.S) без ADR были использованы в качестве контроля. Критерии оценки и методы расчета являются такими, как описано ранее [53]. Степень ингибирования (ИК) роста опухоли = (1-среднее поглощение обработанных скважин на грамм опухоли /среднее поглощение контрольных лунок на грамм опухоли) × 100. В этом исследовании ИК значение отсечки равна или больше, чем 30% (IR30) был определен как химиочувствительность в соответствии с предварительным результатом исследования [54]. Так же, как указано, клиника патологическая информация источника опухолевой ткани использовали для HDRA следует соответственно были представлены в таблице 2.
<р> Для того, чтобы более-экспресс АРНТ, (+) pcDNA3.1 - ARNT конструировали плазмиду. Человеческое выражение вектор ARNT кДНК (pcDNA3.1 (+) - ARNT) был построен CW Biotech Co. Ltd, Пекин, Китай. Вкратце, плазмиду pcDNA3.1 (+) - ARNT был сформирован в соответствии с последовательностью кДНК из GenBank. Ген ARNT был сгенерирован с помощью ПЦР-амплификации. Плазмиду pcDNA3.1 (+) экстрагировали с помощью набора Maxi подготовки (Omega, штат Джорджия, США). ПЦР-продукт субклонировали в BamHI (Takara, Mountain View, США) и HindIII (Takara) участков pcDNA3.1 плазмиды лигазы Т4 (Takara, Mountain View, США). PcDNA3.1 (+) -. ARNT конструкция была подтверждена с помощью секвенирования ДНК (Invitrogen, Grand Island, США) (данные не показаны)
<р> SGC7901 /АДР клеток культивировали в 12-луночных планшетов с 1,0 · 10 5 клеток в каждую лунку, в инкубаторе с постоянной подачи 5% сО 2 при 37 ° с. Среду мен ли через 24 часа с различными концентрациями G418 G418 антибиотика (600 мкг /мл) и каждые 3 дня в течение 14 дней после культивирования клеток. Родительские клетки трансфицировали с пкДНК3.1 (+) - ARNT плазмид с использованием Липофектамина 2000 в соответствии с инструкциями изготовителя. Плотность клеток была 2 × 10 5 клеток на лунку в шести-луночные планшеты. Моноклональные клеток колонии с сопротивлением G418 была сгенерирована с использованием методом серийных разведений путем культивирования одну ячейку в 100 мкл среды в 96-луночных планшетах в течение 24 часов. Моноклональные колонии клеток перевариваются через 15 дней для дальнейшего усиления к культуре клеток со стабильной ARNT экспрессии в 24-луночных планшетах. Клетки переносили в колбу для культивирования клеток, пока не было примерно 90% сплошности. В ARNT более выраженные клеточные линии, трансфицированные с помощью пкДНК3.1 (+) - ARNT были названы SGC7901 /ADR АРНТ
<р> Для нокдаун выражение ARNT мРНК. , миРНК трансфекцию проводили. Для трансфекциях, Липофектамин 2000 (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США) и 50 нМ миРНК (Gene Pharma Co., Шанхай, Китай) были использованы в соответствии с рекомендациями завода-изготовителя, как описано ранее [55]. КиРНК последовательности, используемые являются: 5'-AGUUUAUCCACAUCAUCUGGG-3 ', 5'-CAGAUGAUGUGGAUAAACUUC-3'
<р> общего клеточного белка подвергали лизису с помощью лизирующего буфера с добавлением фторофенилметилсульфонил (1 мМ. ) на льду. Затем белок подвергали электрофорезу на 12% SDS полиакриламидном геле и переносили на PVDF мембрану (Millipore, штат Массачусетс, США). 5% обезжиренное сухое молоко используют для блокирования мембран при комнатной температуре в течение 1 ч, а первичные антитела инкубировали в течение ночи. Затем мембраны инкубировали с вторичными антителами, меченными пероксидазой хрена в течение 1 ч при комнатной температуре, после того, как три 10-минутных промывок в триэтаноламина солевом буферном растворе с Tween (TBS-T). И, наконец, сигналы были обнаружены с использованием набора ECL (Pierce Biotech., Rockford, IL, USA) и мембраны были отсканированы и проанализированы с использованием ChemiDoc XRS + (Bio-Rad, Калифорния, США) система формирования изображений с помощью программного обеспечения визуализации (Version 1.0) , Тубулин используют в качестве внутреннего контроля. Spectra многоцветной широкого диапазона белков лестницы (Beyotime, провинция Цзянсу, Китай) был использован в качестве молекулярного маркера. Антитела, используемые в анализе Вестерн-блоттинга можно увидеть в таблице 3.
<р> лог-фазы клетки собирали, помещали в шесть-луночные планшеты (1 × 10 4 клеток /лунку), и химиотерапевтических препаратов были добавлены в культуральную среду, на второй день. Полученные колонии окрашивали кумасси бриллиантовым синим (Sigma, Inc., Сент-Луис, штат Миссури, США), а также видимые колонии подсчитывали через 2 недели.
Анализ данных
Поддержка Информация
S1 Таблица. В lncRNA выражение профилирование данных
DOI: 10.1371. /Journal.pone.0135461.s001
(XLS)
S2 таблицы. Последовательно вверх и вниз регулируется регулируемым lncRNAs между SGC7901 /ADR, SGC7901 /VCR и SGC7901
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0135461.s002
(XLS)
S3 Таблица. Экспрессия мРНК профилирование данных
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0135461.s003
(XLS)
S4 Таблица. Последовательно вверх и вниз регулируется регулируемым между SGC7901 мРНК /ADR, SGC7901 /VCR и SGC7901
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0135461.s004
(XLS)
S5 Таблица. Джин Онтология (ГО) анализ
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0135461.s005
(XLSX)
S6 Таблица.
Кофе способствует развитию здоровых кишечных микробов и способствует опорожнению кишечника.
Микробиом человека сокращает гликаны слизистых оболочек,
Потеря кишечного эпителиального барьера, ответственного за MIS-C, связанный с COVID-19, у детей,
Общий генетический вариант объясняет, почему иммунотерапия часто не помогает при болезни Крона.
Исследователи используют фаговую терапию для успешного лечения алкогольной болезни печени.
Замена красного мяса заменителями мяса на растительной основе снижает риск сердечно-сосудистых заболеваний
Устойчивость к антибиотикам удвоится всего за два десятилетия
Устойчивость к антибиотикам представляет собой серьезную проблему для многих ранее излечимых инфекционных заболеваний. В настоящий момент, Доказано, что устойчивость к антибиотикам растет гораздо быст
Что древние фекалии могут рассказать нам об эволюции микробиома кишечника человека?
Информация о древней микробиоте представляет собой жизненно важный ресурс для изучения эволюции бактерий и изучения биологического распространения хронических заболеваний на протяжении всей истории че
Создание физической и генетической карты Cannabis sativa
В Каннабис сатива растение обычно используется в различных лекарственных, сельскохозяйственный в промышленных и рекреационных целях по всему миру. Несмотря на широкое распространение, остается мало