PLoS One: Multidrog Resistance Kapcsolatban Hosszú nem-kódoló RNS expressziós profiljának elemzése Gyomor Cancer

absztrakt katalógusa

Az effekt kemoterápia gyomorrák (GC) továbbra is nagyon gyenge, mert a multidrog rezisztencia (MDR). Azonban azok a mechanizmusok mögöttes MDR GC még távolról sem teljesen tisztázott. A vizsgálat célja az, hogy bemutassa a lehetséges mechanizmus a MDR GC meg főleg hosszú, nem kódoló RNS (lncRNA) szintet. Ebben a vizsgálatban, a GC-sejtvonal, SGC7901, és két MDR alvonalainál, SGC7901 /VCR és SGC7901 /ADR vetettük alá egy lncRNA microarray. Bioinformatikai és ellenőrzés kísérleteket végeztünk, hogy vizsgálja meg a lehetséges lncRNAs részt vesz a fejlesztés az MDR. Pathway analízis azt jelezte, hogy 15 utak megfelelt alulszabályozott transzkriptumai és hogy a 20 utak megfelelt felülszabályozott átiratok (p-érték cut-off 0,05). GO elemzés azt mutatta, hogy a legmagasabb dúsított GO-k által megcélzott felülszabályozott átiratok "rendszer fejlesztése", és a legmagasabb esenriched garanciák által megcélzott alulszabályozott átiratok "szterin bioszintetikus folyamat". A tanulmány az első, hogy kihallgassák differenciáltan expresszálódó lncRNAs humán GC sejtvonal és MDR alvonalainál és azt jelzi, hogy lncRNAs értékesek a további vizsgálatot, hogy az új jelölt biomarkerek klinikai diagnózisa MDR és a potenciális célpontokat további kezelésre. Katalógusa

bevezető hivatkozás: Wang Y, Wu K, Yang Z, Zhao Q, ventilátor d, Xu P, et al. (2015) Multidrog Resistance Kapcsolatban Hosszú nem-kódoló RNS expressziós Profil Elemzés a gyomorrák. PLoS ONE 10 (8): e0135461. doi: 10,1371 /journal.pone.0135461 katalógusa

Szerkesztő: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, Egyesült Államok katalógusa

Beérkezett: december 24, 2014; Elfogadva: július 22, 2015; Megjelent: augusztus 20, 2015 katalógusa

Copyright: © 2015 Wang et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra katalógusa

Az adatok elérhetősége: minden nyers adatok és normalizált adatokat mutatja http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE69342 (GSE69342). katalógusa

Forrás: Ezt a munkát támogatott Országos Program Key Basic Research Project ( "973" Program, No. 2010CB529302, No. 2010CB529305, No. 2010CB529306); Nemzeti Természettudományi Alapítvány Kína (No. 81301763); Henan tartományi legfontosabb tudományos és technológiai projektek (No. 142102310473); Kulcs Program, a Nemzeti Természettudományi Alapítvány Kína (No. 81030044). Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető katalógusa

A több szerrel szembeni ellenállás ( MDR) továbbra is komoly akadálya a kemoterápia hiba kezelésében gyomorrák, amely egy vezető oka a rákkal kapcsolatos halál világszerte. Többszörös multidrog rezisztencia-asszociált proteinek (MRPs) [1] vagy miRNS [2], amelyek közvetítik az MDR különböző mechanizmusok révén már korábban azonosítottak. Azonban azok a mechanizmusok mögöttes MDR GC még távolról sem teljesen egyértelmű. Katalógusa

genomok szekvenálása azt mutatta, hogy az eukarióta genomok kódolnak meglepően nagyszámú kódoló mRNS képest prokarióta genomok. Ezek közül a nem kódoló transzkriptumok, sok hosszú nem-kódoló RNS-ek (lncRNAs), amelyek fontos szerepet játszanak a szabályozásában mRNS transzkripciójának vagy transzlációjának a transzkripciós vagy poszt-transzkripciós szinten. lncRNAs vannak RNS-ek, amelyekből hiányzik kódoló potenciál, melyek > 200 bp és a számla legalább 80% -át a transzkriptumok a teljes genom [3]. Gyűjtött adatok azt mutatják, hogy lncRNA fontos szerepet játszik a szabályozás mRNS [4], organelle biogenézis [5], a sejten belüli kereskedelem molekulák [6], és a sejtek fejlődését [7] [8]. Katalógusa

LncRNA diszreguláció részt vett különböző típusú betegségek, beleértve a rákot ^{[ 4 9 10 ]. Nevezetesen, lncRNAs lehet fontos szerepet játszanak a karcinogenezisben, metasztázis és invazivitását többszörös malignus tumorok keresztül befolyásoló onkogén expresszió. Például a COX-2-lncRNA, PACER, működhet új potenciális célpontja a COX-2-moduláció gyulladás és rák [11]; RNSi által közvetített knock-down a LINC01081 normál magzati tüdő fibroblasztok azt mutatta, hogy ez a lncRNA pozitívan szabályozza FOXF1 transzkriptum szintjét, továbbá azt jelzi, hogy csökkent a LINC01081 expresszió hozzájárulhat a fejlődéséhez alveoláris kapilláris dysplasia azzal eltolódása tüdővéna [12]; lncRNA Hotair is lehet egy értékes prediktor a vastagbélrák kezelése [13], és MALAT1 úgy lehet tekinteni, mint egy potenciális prognosztikai indikátor, és lehet a cél a diagnózis és a génterápia a hasnyálmirigy-vezeték adenokarcinóma [14]; túltermelése lncRNA H19 fokozza karcinogenezis és metasztázis a gyomorrák és a hatás a H19 GC által médiáit közvetlen túlszabályzását ISM1 és a közvetett elnyomása CALN1 expresszió keresztül miR-675 [15]. Ezért, hogy előzetes betekintést a molekuláris mechanizmusainak MDR GC tanulmányoztuk a lncRNA expressziós profilját GC MDR altermékvonal. Katalógusa}

Itt azt vizsgáltuk, hogy differenciáltan expressziós profilok lncRNAs és mRNS között GC cellline SGC7901 és MDR altermékvonal SGC7901 /ADR és SGC7901 /videomagnó lncRNA microarray. Összehasonlítása eltérő expressziót átiratok között altermékvonal és a szülői cellline kiderült 15 utakat, amelyek megfeleltek a leszabályozott átiratok és 20 utakat, amelyek megfeleltek fel szabályozott átiratok (p-érték cut-off 0,05). Gene ontológia (GO) elemzés azt mutatta, hogy a legtöbb magasan dúsított GO kifejezések a felfelé szabályozott átiratok "rendszer fejlesztése", "nukleoszóma", és a "kötelező" és a legtöbb magasan dúsított GO feltételek a leszabályozott átiratok "szterin bioszintetikus folyamat "," sejt perifériáján ", és a" szteroid-dehidrogenáz-aktivitással ". Eredményeink azt mutatták, hogy a lncRNA és mRNS expressziós profil jelentősen különbözött MDR altermékvonal és a szülői CELLine. Ez arra utal, hogy a rendellenes expressziós szintjének lncRNAs hozzájárulhat a fejlesztési MDR GC. További tanulmányok szükségesek a különbségek lncRNA expressziós profilok nyújthat új potenciális módszereket megfordítására MDR fenotípus GC. Katalógusa

Eredmények katalógusa

A különböző módon kifejezett lncRNAs katalógusa

A highthroghput lncRNA microarray adatok azt mutatták, összesen 27.883 lncRNAs kifejezett gyomorrák cellline, SGC7901 és két multidrog rezisztencia alvonalainál, SGC7901 /ADR és SGC7901 /VCR (S1 táblázat). Következtetni a kapcsolatok között példányok, hierarchikus klaszterezést analízis segítségével gondoskodjon celllines csoportokba aszerint, hogy azok expressziós szintet jelentő kapcsolatok a lncRNA kifejezés módok között celllines (ábra az 1A és 1B). További tanulmányok szükségesek az ilyen adatok mutatott átlagosan 1637 differenciáltan expresszálódó lncRNA. Ezek közül 638 volt következetesen up-szabályozott és 999 következetesen alulszabályozott (széthúzható change≥2.0) (S2 táblázat). ASHG19A3A028863 (széthúzható változás: 146,0139) volt a leginkább up-szabályozott lncRNA és ASHG19A3A007184 (szétnyitható változás: 58,7105) volt a leginkább leszabályozott lncRNA. Továbbá, leszabályozott lncRNAs gyakoribbak voltak, mint akár szabályozott lncRNAs mi microarray adatok (S2 táblázat). Katalógusa

differenciáltan expresszálódó mRNS katalógusa

Voltak 19644 mRNS azonosított GC MDR altermékvonal elemezzük mRNS expressziós profil adatokat microarray analízis és a hierarchikus klaszterezést elemzés közötti kapcsolatok az mRNS-mód, hogy jelen voltak a GC MDR altermékvonal és a szülői CELLine (2A és 2B) (S3 táblázat). Között differenciáltan expresszálódó mRNS között SGC7901 /ADR, SGC7901 /VCR és SGC7901, 730 következetesen fel szabályozott és 650 következetesen lefelé szabályozni SGC7901 /ADR és SGC7901 /VCR celllines képest SGC7901 (2B). (S4 táblázat). NM_000735 (gén szimbólum: CGA, szeres változást: 106,19) volt a leginkább up-szabályozott mRNS és NM_001136574 (gén szimbólum: LANCL1 hajtsa változás: 25.43) volt a leginkább leszabályozott mRNS (2B). Katalógusa

GO elemzés katalógusa

az egyes gén és gén termékjellemzők biológiai folyamatokban, sejtalkotó és molekuláris funkciók, Gene Ontology (GO) analízist végeztünk a következőképpen. Fisher-féle egzakt tesztet végezni annak ellenőrzésére, hogy több van átfedés a DE listát, és a GO kommentár lista, mint várható lenne véletlenül. A p-érték jelöli a jelentőségét GO kifejezések dúsítás a DE géneket. Minél alacsonyabb a p-érték, annál jelentősebb a GO Term (p-érték < = 0,05 ajánlott). Ez azt mutatta, hogy a legmagasabb dúsított garanciák célzott akár szabályozott átiratok szöveti homeosztázis (GO: 0048731; ontológia: biológiai folyamat; p = 6.84E-08) (3A), nukleoszóma (GO: 0000786; ontológia: celluláris komponenst; p = 2.10E-07) (3B ábra) és kötési (GO: 0005488; ontológia: molekuláris funkció; p = 0,001) (3C), és hogy a legmagasabb dúsított garanciák által megcélzott leszabályozott átiratok szterol bioszintetikus folyamat (GO: 0016126; ontológia: biológiai folyamat; p = 0,000) (ábra 3D), sejtperifériára (GO: 0071944; ontológia: sejtes komponens; p = 3.80E-06) (ábra 3E) dehidrogenáz aktivitás (GO: 0016229; ontológia molekuláris funkció; p = 0,001) (ábra 3F) (S5 táblázat). katalógusa

útvonal elemzés katalógusa

Ebben a vizsgálatban útvonal elemzés mutatott, hogy 20 utakat következetesen megfelelt fel szabályozott átiratok és hogy a legtöbb dúsított hálózat volt "az alkoholizmus-Homo sapiens (humán)" (Fisher-P-érték = 3.66E-08) tagjai 24 célzott gén (ábra 4A); továbbá az útvonal elemzés azt is kimutatta, hogy a 15-utak következetesen megfelelt leszabályozott átiratok és hogy a legtöbb dúsított hálózat volt "Steroid bioszintézis-Homo sapiens (humán)" (Fisher-P-érték = 0,00044), tagjai: 5 célzott gén (4.b ábra ) (S6 táblázat, az ajánlott p-érték cut-off 0,05). Ezek között utak, a gén kategória "cirkadián ritmus" zavar leírták, hogy társítható különféle rákok, köztük gyomorrák [16], a krónikus mieloid leukémia [17], a fej és a nyak pikkelyes sejtes karcinóma [18], hepatocelluláris karcinóma [19 ], endometriális karcinóma [20], és az emlőrák [21]. A gén kategória "NOD-like receptor jelátviteli útvonalat", amely a NOD1, már azt mutatta, hogy NOD1 /CARD4 és NOD2 /CARD15 gén polimorfizmusok összefüggésben állhat megváltozott kockázata gyomor [22], a kolorektális [23], a tüdő [24 ], gége [25], az epehólyag [26], a hasnyálmirigy [27], a vékonybél, a vese [28], húgyhólyag rák [29], a bőrrák, lymphoma [30] és a leukémia [31]. Itt azt vizsgálták tovább, a véleménynyilvánítás és funkciója ARNT (aril szénhidrogén receptor nukleáris translocator) által közvetített MDR1 (multidrog 1) up-reguláció útvonal. Azt találtuk, hogy ARNT és MDR1 szignifikánsan up-szabályozott SGC7901 /ADR és SGC7901 /VCR sejtvonalak képest SGC7901, a hatás jelentős up-regulációja MDR1 által közvetített ARNT expressziós vektor transzfekcióbó fért Sp1 siRNS transzfekció. Plate telepképző assay azt mutatták, hogy SGC7901 /ADR sejt telepek kialakulása aránya remarably magasabb pARNT + /siSp1- csoportban, mint pARNT + /siSp1 + csoportban a adriamicinnel (ADR) kiegészítés a kultúra Meida (p < 0,0001) (5. ábra).

Valós idejű kvantitatív PCR érvényesítés katalógusa

Annak vizsgálata microarray adatok, hat fel szabályozott lncRNAs és tíz alulszabályozott lncRNAs véletlenszerűen kiválasztott következetesen eltérően expresszált lncRNAs segítségével SGC7901 /ADR, SGC7901 /videomagnó és SGC7901 cellines és qRT-PCR eredmények és microarray adatok konzisztensek (6A); további vizsgálata expressziós szintjét az ezeket lncRNAs a gyógyszer-rezisztens gyomor szövetek, húsz gyógyszer-rezisztens gyomor minták és párosított nem multirezisztens szöveteket vizsgáltuk az expressziós szint ezek lncRNAs kvantitatív valós idejű PCR (QRT-PCR) (6B) .A eredmények igazolták, hogy a gyomorrák kezelt mintákban ADR 5 napon mutatott szignifikáns különbséget expressziós szintje a tizenhat lncRNAs afformentioned, mint a kontroll csoportban (ábra 6C). Sőt, korrelációs elemzés azt mutatta, hogy lncRNA NR_015379 expressziós szintje korrelált az a gátlás mértékét a húsz gyógyszer-rezisztens gyomor minták (ábra 6D és 6E, p < 0,01). Katalógusa

Vita katalógusa

korábbi kutatások már megállapították, hogy a miR-21 elősegíthetik a gyógyszer-rezisztencia különféle rákok [32]; LncRNA-MRUL elősegíti ABCB1 kifejezést multirezisztens gyomorrák sejt altermékvonal [33]; CUTL1 aktivitás fordítottan társított hatóanyag-rezisztencia és így vonzó terápiás célpont modulálja multidrog rezisztencia gyomorrák [34]; gyomor CSC azonosítottunk VCR-prekondicionált SGC7901 sejtvonal, jellemző a magas tumorgenézisre és a kapacitás önmegújító és differenciálódását [35]; MAD2 lehet fontos szerepet játszanak a fejlesztés a humán gyomorrák, és hogy silencing a MAD2 gén segíthet kezelni a multidrog rezisztencia gyomorrák-sejtek [36] és a hipoxia által kiváltott MGr1-Ag /37LRP expresszióját aktiváljuk a HIF-1 függ ERK aktiváció. Ezek az események függvénye reaktív oxigén intermedierek [37] .Ugyanakkor a multidrog rezisztencia mechanizmusok GC sokkal felderítették és lncRNAs zavara GC MDR altermékvonal nem vizsgálták még. Katalógusa

Ebben a vizsgálatban a GC-sejtvonal , SGC7901, és két MDR alvonalainál, SGC7901 /VCR és SGC7901 /ADR vetettük alá lncRNA microarray. Bioinformatikai és ellenőrzés kísérleteket végeztünk, hogy vizsgálja meg a lehetséges lncRNAs részt vesz a fejlesztés az MDR. Pathway analízis azt jelezte, hogy 15 utak megfelelt alulszabályozott transzkriptumai és hogy a 20 utak megfelelt felülszabályozott átiratok (p-érték cut-off 0,05). GO elemzés azt mutatta, hogy a legmagasabb dúsított GO-k által megcélzott felülszabályozott átiratok "rendszer fejlesztése", és a legmagasabb esenriched garanciák által megcélzott alulszabályozott átiratok "szterin bioszintetikus folyamat".

Egyre több bizonyíték azt mutatta, hogy lncRNA ( hosszú nem-kódoló RNS-t) is fontos szerepet játszanak a karcinogenezisben, és a tumor invázió és metasztázis [38]. Például, John [39] stb. Kimutatták, hogy lncRNA PCGEM1
társított prosztatarák; transzformáló növekedési faktor-β-indukált lncRNA-Smad7 találtuk, hogy gátolják az apoptózist az egér emlőrák JygMC (A) sejtek, és így javasoljuk ed bonyolult mechanizmus szabályozására az anti-apoptotikus és a tumor-progresszív szempontjait TGF-β jelátviteli [40]; lncRNA, prosztatarák-asszociált átirat 29 (PCAT29) jellemeztük együtt a kapcsolata a androgén receptor, működött egy androgén-szabályozott tumorszuppresszor prosztatarák [41]; Yuan stb felfedezett egy új TGF-β-indukált lncRNA, lncRNA-ATB, ami ösztönözte EMT keresztül szekvesztráló miR-200S, és megkönnyítette kolonizációja stabilizáló IL-11
mRNS, és ezáltal elősegítse mind a korai és késői lépéseket a rák metasztázis [42].

Azt találtuk, hogy a lncRNAs sarkalatos szerepet játszanak a megváltoztatása expresszióját fehérje-kódoló gének keresztül cisz- vagy transz-mechanizmusokat. Itt azt találtuk, hogy lncRNAs up-szabályozott SGC7901 /ADR és SGC7901 /VCR képest SGC7901lncRNA, mint AF119893, ami intronic antiszensz NRP2 (Neuropilin-2). Azt javasolták, hogy a NRP2 /VEGF-C tengely szerepet játszik a húgyhólyag rákterápiában ellenállás és a VEGF-paxillin-NRP2 útvonal jelenthet egy új terápiás célpont a rák és más angiogenezissel kapcsolatos betegségek. lncRNA AF461897 volt intron érzéki átfedése ABCB9. Dong stb bebizonyította, hogy a miR-31 gyakorolt ​​anti-apoptotikus hatását valószínűleg gátlásán keresztül ABCB9, és így olyan új stratégia használatával járó miR-31, mint egy potenciális célpontja NSCLC kemoterápia. lncRNA BC065904 volt intron értelme-halmozódása CTBP2, az egyik a transzkripciós corepressors a C-terminális fehérje (CtBP) család, amely funkcionált korepresszor az E2F7, és mint egy szabályozó DNS károsodás választ. lncRNA NR_026900 volt exon értelme-átfedése QSOX1, amely kimutatható volt, hogy csökkentsék a proliferációt, migrációt és invázió emlőrák-sejtek in vitro, és csökkenti a tumor növekedését in vivo.

Másrészt, lncRNAs alulszabályozott in SGC7901 /ADR és SGC7901 /VCR képest SGC7901lncRNA, mint AF113689 természetes volt antiszensz RRM1. Khatri stb arról számoltak be, hogy a pre-expozíció RRM1 siRNS csökkentette a IC50-értéke gemcitabin-hidroklorid 5 redők A-549 sejtekben, mint a gemcitabin-hidroklorid egyedül, jelezve, hogy RRM1 volt potenciális onkogén a tüdőrák. lncRNA uc010iyh volt intronikus antiszensz az NAIP (a neuronális apoptózist gátló fehérjéje), amely egyike a IAP-családba. Bebizonyosodott, hogy a IAP lehetne vonni prosztata rendellenesség (BPH, PIN-kód és PC) fejlesztés, mivel lehet, hogy provokál az apoptózis gátlása, és ezt követően a sejtproliferáció. LncRNA uc003jsd volt exon értelme-átfedése PDE4D, azaz, cAMP-specifikus 3 ', 5'-ciklikus foszfodiészteráz 4D. Lin stb azt mutatta, hogy a PDE4D működik, mint egy tumor-elősegítő tényező, és egy egyedülálló megcélozható enzim a rákos sejteket. LncRNA NR_002332 volt exon értelme-átfedése ST7, szupresszor a tumorképző 7, amelyet javasoltak, hogy egy tumorszuppresszor gén kromoszóma régió 7q31.1-q31.2.

Pathway analízis kimutatta, lehetséges útvonalakon részt a fejlesztés a multidrog rezisztencia (MDR) a gyomorrák. ARNT egyike volt a 20 utak következetesen megfelelt fel szabályozott átiratok és jelentették, hogy részt vegyen a több szerrel szembeni rezisztencia kialakulásáért több rosszindulatú daganatok [43], beleértve a myeloma multiplex [44], és az AML (akut mieloid leukémia) [45] . MDR1 kódol P-glikoprotein, amely egy energia-függő efflux pumpa, amely exportálni síkbeli hidrofób molekulákat, beleértve néhány kemoterápiás gyógyszerek, mint az adriamicin, ciszplatin, taxol és így a sejt [46, 47]. Itt azt találtuk, hogy ARNT és MDR1 szignifikánsan up-szabályozott SGC7901 /ADR és SGC7901 /VCR sejtvonalak compacared hogy SGC7901, a hatás jelentős up-regulációja MDR1 által közvetített ARNT expressziós vektor transzfekcióbó fért Sp1 siRNS transzfekció, amely jelezte a szerepe ARNT-MDR1pathway az MDR-fenotípus gyomorrák.

a további vizsgálat azt mutatta, hogy egyes fehérjét kódoló gén részt vesz a kábítószer-rezisztencia fenotípus és fejlődését a rosszindulatú daganatok talán voltak cisz-által szabályozott korrelált lncRNAs . Például ABCB1 (ATP-kötő kazetta, alosztály B (MDR /TAP), tagja 1, P-glikoprotein (P-gp) kódoló gén) található 400KB upstream lncRNA MRUL (NR_024549: MDR kapcsolatos és fel- szabályozott lncRNA) szignifikánsan serkentő szabályozás révén a javítás lehetséges hasonló szerepet játszott MRUL és támogatni gyógyszer-rezisztencia fenotípus SGC7901 /ADR és SGC7901 /VCR sejtek [33]; ADAM22, a jelölt gén malignus átalakulás petefészek endometriózis [48], korrelált lncRNA AL133090 egy exon értelemben átfedő módon; PLCG1 viszonyították lncRNA AK021471 egy intron értelemben átfedő módon és visszatérő mutációt PLCG1 ben azonosították angiosarcomas [49]; FYN korrelált lncRNA AK AK090692 egy intron értelemben átfedő módon, és antagomir-1290 elnyomja CD133 (+) sejtek nem-kissejtes tüdőrák célzásával Fyn kapcsolatos Src család tirozin-kináz [50] stb

a vizsgálat azt igazolta, hogy a dereguláció a lncRNAs részt a fejlesztési multidrog-rezisztencia phynotype gyomorrák. További elemzés ezen lncRNAs és a kapcsolódó utak nyújthatnak betekintést mechanizmusok kemoterápia gyógyszer-rezisztencia a gyomorrák és olyan új irányok fordított multidrog phynotype. Katalógusa

Anyagok és módszerek katalógusa

Etikai nyilatkozat

az összes kísérleti eljárásokat jóváhagyta az Institutional Review Board negyedik Katonai Orvostudományi Egyetem. Írásos beleegyezését adta az összes beteg mintát. Katalógusa

Sejtvonalak és sejtkultúrák katalógusa

Az emberi GC sejtvonal SGC7901 kapunk Akadémia Katonai Orvosi Science (Peking, Kína). Két multirezisztens alvonalainál, SGC7901 /VCR és SGC7901 /ADR, dolgoztak a mi labor [51]. SGC7901 /VCR, SGC7901 /ADR és SGC7901 növesztettük RPMI1640 közeggel (Thermo Scientific Co., USA), amelyet kiegészítve 10% magzati borjúszérummal (FCS) (Thermo Scientific Co., USA), párásított inkubátorban, 5% CO 2 37 ° C-on. VCR (1,0 ug /ml) vagy ADR (0,5 ug /ml) adtunk be a táptalajba a megfelelő sejteket, hogy fenntartsák a gyógyszer-rezisztens fenotípus.

RNS-izolálás, a címkézés és array hibridizációs

Teljes RNS-t betakarított SGC7901, SGC7901 /ADR és SGC7901 /VCR TRIzol reagens (Invitrogen, CA, USA), és az RNeasy Kit (Qiagen Co., Németország) a gyártó utasításai, beleértve a DN-áz feltárási lépést. Teljes RNS-t minden egyes cellline mennyiségét használva NanoDrop ND-1000 (OD 260 nm-en, NanoDrop, Wilmington, DE), RNS integritását vizsgáltuk standard denaturáló agaróz gél elektroforézissel, és a tisztaságot megítélni aránya abszorbancia 260 nm-en, hogy 280 nm (A260 /A280). Kettős szálú cDNS-t (DS-cDNS) alkalmazásával szintetizáltuk 5 ug össz-RNS által Invitrogen SuperScript DS-cDNA Synthesis Kit jelenlétében 100 pmol oligo dT primerek alkalmazásával. Ezután a DS-cDNS jelzett és végeztünk hibridizációt a korábban leírtak [52]. Az RNS címkézés és microarray hibridizáció végeztük KangChen Bio-tech, Shanghai, Kína. Katalógusa

Highthroughput lncRNA expressziós profiljának elemzése katalógusa

Minősített RNS szintéziséhez használjuk kettős szálú cDNS Superscript Dupla Stranded cDNA Synthesis Kit (Invitrogen Co., USA). A kettős szálú cDNS-t jelzett és hibridizáltuk a humán LncRNA microarray 2.0 verzió (Arraystar Co. USA). microarray V2.0 tartalmaz körülbelül 33.000 lncRNAs gyűjtött a mérvadó adatforrásokat ideértve NCBI RefSeq, UCSC, RNAdb, LncRNAs származó irodalmak és UCRs. Szekvenciák kiválasztott szabadalmaztatott stratégiákat. Ismétlődő szekvenciák és ncRNAs rövidebb mint 200 bp törölték. Hogy fokozza statisztikai megbízhatósággal, minden emberi lncRNA tömb állt 60.302 különböző szondák (60 merek), és minden átirat képviselte 1-5 próbák. Minden átirat képviselte adott exon vagy illesztési próbát azonosítani az egyes átiratokat pontosan. A microarray hibridizáció és bioinformatikai elemzést végeztünk KangChen Bio-tech, Shanghai, Kína. A nyers intenzitás adatok és a normalizált adatokat mutatja Gene Expression Omnibus (GSE69342: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE69342). Katalógusa

mennyiségi valós idejű PCR (qRT-PCR)

A teljes RNS-t SGC7901, SGC7901 /ADR és SGC7901 /VCR-t izoláltunk TRIzol reagens (Invitrogen, CA, USA), és ezután reverz transzkripció révén PrimeScript RT reagens készlet a gDNS Eraser (Perfect Real Time) (TaKaRa, Dalian Kína) szerint a gyártó ciókra. A kifejezés a nyolc felülszabályozott lncRNAs és hat alulszabályozott lncRNAs mértük QRT-PCR-SYBRGreen vizsgálatokban (TaKaRa, Dalian, Kína), és GAPDH használtuk belső kontrollként. A primereket az 1. táblázatban felsorolt ​​expressziós szintjét minden egyes lncRNA képviselte mint szeres változást 2- △△ Ct módszerekkel. Az expressziós szintje lncRNAs eltérő expressziót között SGC7901 és MDR alvonalainál SGC7901 /ADR és SGC7901 /VCR segítségével elemeztük t-próba SPSS (17.0 verzió SPSS LNC). A p < 0,05 értéket tekintettük szignifikánsnak.

Histoculture gyógyszerre adott válasz vizsgálat (HDRA) Fresh GC tumorszövetben takarítottunk mindegyik műtétileg eltávolított minta és helyezzük egy 24 mélyedéses lemezen. Kocka kollagén gél szivacs (1 cm-es ^{3) merítettük 1 ml RPMI 1640-kiegészítéssel, 20% magzati borjúszérumot. A tumor szöveteket helyeztük kollagén szivacs következő ADR adtunk végkoncentrációban 6 ng /ml, és inkubáltunk 37 ° C-on, 5% CO2-t. Tumorszövetekben kezelt normál sóoldat (N.S) nélkül ADR használtunk kontrollként. Az értékelés és a számítási módszerek a korábban leírt [53]. A gátlási arány (IR) a tumor növekedésének = (1-átlag abszorbanciája kezelt lyukakból grammonként tumor /átlag abszorbanciája ellenőrző lyukak grammonként tumor) × 100. Ebben a vizsgálatban, az IR cut-off érték egyenlő vagy nagyobb, mint 30% (IR30) definiáltuk kemoszenzitivitás szerint az előzetes tanulmány eredménye [54]. Csak az utasításban a klinika kóros információt a daganatos szövet forrás használható HDRA kell adni, illetve mutatták be a 2. táblázatban katalógusa}

Sejtvonalak és tenyésztési körülmények katalógusa

Az emberi GC sejtvonal SGC7901 volt nyert Akadémia Katonai Orvosi Akadémia (Peking, Kína). A multirezisztens altermékvonal SGC7901 /VCR és SGC7901 /ADR fejlesztettek ki a laborban. SGC7901 /VCR, SGC7901 /ADR és SGC7901 RPMI 1640 közegben (Thermo Scientific, USA), kiegészítve 10% magzati borjúszérummal (FCS) (ThermoScientific) egy 5% CO 2 párásított inkubátorban 37 ° C-on. Vinkrisztin (VCR; Sigma, Inc., St. Louis, MO; 1,0 ng /ml) és az ADR (Sigma, Inc., St. Louis, MO; 0,5 ng /ml) adtunk a táptalajhoz megfelelő sejt altermékvonal hogy fenntartani a gyógyszer-rezisztens fenotípus. katalógusa

Építőipari pcDNA3.1 (+) - ARNT plazmid katalógusa

a túlzott express Arnt pcDNA3.1 (+) - ARNT szerinti plazmidot. Az emberi ARNT cDNS expressziós vektor (pcDNA3.1 (+) - ARNT) került kialakításra, CW Biotech Co. Ltd., Peking, Kína. Röviden, a plazmidot pcDNA3.1 (+) - ARNT keletkezett szerint a cDNS-szekvenciát a GenBank. A ARNT gént PCR-rel előállított amplifikációs. A plazmidot pcDNA3.1 (+) extraháljuk át Maxi készítmény készlet (Omega, Georgia, USA). A PCR-terméket szubklónoztuk BamHI (Takara, Mountain View, USA) és HindIII (Takara) helyei pcDNA3.1 plazmiddal T4 ligázzal (Takara, Mountain View, USA). A pcDNA3.1 (+) - ARNT konstrukciót DNS-szekvenálással igazoljuk (Invitrogen, Grand Island, USA) (az adatokat nem mutatjuk be).

generálása ARNT stabil sejtvonalak

SGC7901 /ADR sejt tenyésztettünk 12 lyukú lemezekre 1,0 × 10 ^{5 sejt minden egyes lyukban, egy inkubátorban állandó ellátás 5% CO2, 37 ° C-on. A tápközeget lecseréltük 24 órával később különböző koncentrációjú G418 antibiotikum G418-cal (600 ng /ml), és helyébe minden 3 nap után 14 nappal sejttenyészetben. Szülői sejteket transzfektáltunk a pcDNA3.1 (+) - ARNT plazmidokat Lipofectamine 2000 szerint a gyártó utasításai szerint. A sejtek sűrűsége volt 2 × 10 5 sejt per lyuk hat-üregű lemezeken. Monoklonális sejt kolóniát G418 rezisztencia állítottunk elő a limitáló hígítási módszerrel tenyésztjük egyetlen sejt 100 jil tápközegben 96 üregű lemezeken 24 órán át. Monoklonális sejt kolóniákat emésztettük 15 nappal később további amplifikáció a kultúrához sejtek stabil ARNT expresszió 24 mérőhelyes lemezeken. A sejteket átvittük sejttenyésztő lombikba, amíg körülbelül 90% -os összefolyó. A ARNT túiexpresszálódó sejtvonalak transzfektálhatóak pcDNA3.1 (+) - ARNT nevezték SGC7901 /ADR ARNT. Katalógusa}

Kis interferáló RNS (siRNS) transzfekciós katalógusa

knockdown a ARNT mRNS expresszió , siRNS transzfekció végeztünk. A transzfekció, Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), és 50 nM siRNS (Gene Pharma Co., Shanghai, Kína) alkalmaztunk a gyártó ajánlásai a korábban leírtak szerint [55]. A siRNS-szekvenciák használhatók a következők: 5'-AGUUUAUCCACAUCAUCUGGG-3 ', 5'-CAGAUGAUGUGGAUAAACUUC-3'.

Western blot

teljes sejtfehérje lizáltuk alkalmazásával lízispufferben kiegészített fenil-metil-fluorid (1 mM ) jégen. Ezután fehérjét elektroforézisnek keresztül 12% -os SDS poliakrilamid gélen és átvisszük PVDF membránra (Millipore, Massachusetts, USA). 5% zsírmentes tejport használtuk, hogy blokkolja a membránok szobahőmérsékleten 1 órán és a primer antitestekkel inkubáltuk egy éjszakán át. Ezután membránokat másodlagos antitestekkel jelzett HRP 1 óra után szobahőmérsékleten három 10 perces mosás trietanol pufferolt sóoldat Tween (TBS-T). Végül a jelek alkalmazásával detektáltuk ECL kit (Pierce, Biotech., Rockford, IL, USA), és a membránokat beolvasott és analizáltuk ChemiDoc XRS + (Bio-Rad, California, USA) képalkotó rendszer képalkotó szoftver (1.0 verzió) . Tubulin használtuk belső kontrollként. A Spectra többszínű széles spektrumú protein létra (Beyotime, Jiangsu, Kína) alkalmaztunk egy molekuláris marker. Az antitestek használt Western blot assay látható a 3. táblázatban

Plate telepképző assay

A log-fázisú sejteket összegyűjtöttük, szélesztettünk hat lyukú lemezekre (1 × 10 ^{4 sejt /lyuk), és a kemoterápiás hatóanyag adtunk a táptalajhoz a második napon. A kapott telepeket megfestjük Coomassie Brilliant Blue (Sigma, Inc., St. Louis, MO, USA), valamint a látható telepeket megszámoltuk 2 hét elteltével.}

Adatelemzés

Ebben a tanulmány, informatikai adatelemzés végeztük KangChen Biotech (Sanghaj, Kína) Minden a metszeteket szkennelt 5 lm /pixel felbontású használ Axon GenePix 4000B szkennerrel (Molecular Devices Corporation) runed által GenePix Pro 6.0 szoftvert (Axon). A beolvasott kép (JPEG formátumban) ezután végre rács összehangolás és a véleménynyilvánítás adatelemzés segítségével NimbleScan szoftvert (2.5 verzió). Expression adatok normalizálódtak a Robust Multichip Average (RMA) algoritmus tartalmazza a NimbleScan szoftver. Sőt, a szonda szintje fájlokat és mRNS szinten fájlok követően generált normalizálás. Minden génszintû fájlokat behozták Agilent GeneSpring GX software (version 11.5.1) és normalizált a kvantilis módszerrel; Ezután, Combat szoftvert használtunk, hogy beállítsa a normalizált intenzitás eltávolítására kötegelt hatásokat. Jelentősen eltérő expressziót lncRNAs és mRNS azonosítottak keresztül Ulcerációval szűrés. Hierarchikus klaszterezés segítségével végeztük Agilent GeneSpring GX software (version 11.5.1) [56]. Az adatokat átlag ± standard deviáció (SD). Lineáris korrelációs analízist Pearson módszer SPSS 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). A különbségeket akkor tekintettük szignifikánsnak P értéke < 0.05.

alátámasztó információk
S1 táblázat. A lncRNA expressziós profil adatokat. Katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0135461.s001 katalógusa (XLS) hotelben S2 táblázat. A következetesen fel szabályozott és leszabályozott lncRNAs között SGC7901 /ADR, SGC7901 /VCR és SGC7901. Katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0135461.s002 katalógusa (XLS) hotelben S3 táblázat. Az mRNS expressziós profil adatokat. Katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0135461.s003 katalógusa (XLS) hotelben S4 táblázat. A következetesen fel szabályozott és leszabályozott mRNS között SGC7901 /ADR, SGC7901 /VCR és SGC7901. Katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0135461.s004 katalógusa (XLS) hotelben S5 táblázat. Gene Ontology (GO) elemzés. Katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0135461.s005 katalógusa (XLSX-) hotelben S6 táblázat.

• PLoS One: A szérum HER2 potenciális helyettesítője Tissue HER2-státus gyomorrákban: rendszeres felülvizsgálatát és meta-analízis
• PLoS One: HIF-1α indukál multidrog gyomorrákban Cells kiváltása miR-27a