Modelo de camundongo recém-nascido fornece pistas sobre a causa da doença intestinal devastadora em prematuros anêmicos

Os médicos há muito suspeitam que as transfusões de glóbulos vermelhos dadas a bebês prematuros com anemia podem colocá-los em risco de desenvolver enterocolite necrosante, ou NEC, uma doença inflamatória potencialmente letal dos intestinos. Contudo, evidências sólidas para a conexão têm sido difíceis de obter, em parte devido à falta de um modelo animal prático capaz de representar com precisão o que ocorre fisicamente quando um bebê tem NEC.

Um rato de laboratório alimenta seus filhotes recém-nascidos, que têm cerca de um quarto de idade e pesam menos de 30 gramas. Uma equipe de pesquisa liderada pela Johns Hopkins Medicine superou problemas anteriores ao trabalhar com ratos infantis para desenvolver um modelo para estudar uma doença gastrointestinal devastadora que atinge bebês prematuros com anemia. Crédito:The Jackson Laboratory

Agora, pesquisadores da Johns Hopkins Medicine relatam que desenvolveram esse modelo - que se acredita ser o primeiro de seu tipo - usando camundongos infantis, ou filhotes, que primeiro ficam anêmicos e depois recebem transfusões de sangue de neonatos de uma linhagem diferente de camundongos. O novo método, os pesquisadores dizem, imita o que acontece quando as transfusões de sangue são dadas a bebês humanos de um doador não relacionado.

Uma descrição do modelo do mouse, junto com descobertas significativas e benefícios potenciais de seus primeiros usos, é publicado em um novo artigo na revista Nature Communications .

Precisávamos de um modelo de camundongo vivo que funcionasse para saber se uma transfusão de sangue por si só leva a NEC ou se ela só acontece se a transfusão for dada quando houver anemia. "

Akhil Maheshwari, M.D., Professor de pediatria na Escola de Medicina da Universidade Johns Hopkins, diretor de neonatologia do Centro Infantil Johns Hopkins, e autor sênior do artigo de pesquisa

Observado em aproximadamente 10% a 12% das crianças com peso inferior a 3,5 libras ao nascer, NEC é uma emergência gastrointestinal de rápida progressão na qual as bactérias invadem a parede do cólon, causando inflamação que pode destruir o tecido saudável no local. Se células suficientes forem necrotizadas (mortas) para que um buraco resulte na parede intestinal, material fecal pode entrar na corrente sanguínea e causar sepse com risco de vida.

Desde 2004, Maheshwari diz, estudos de pesquisa têm mostrado repetidamente que bebês nascidos prematuramente que são gravemente anêmicos - aqueles com uma proporção de glóbulos vermelhos em relação ao volume total de sangue entre 20% e 24% ao nascer - podem desenvolver NEC dentro de 48 horas após receber uma transfusão de glóbulos vermelhos. Por comparação, a Academia Americana de Pediatria diz que bebês nascidos a termo normalmente têm volumes de glóbulos vermelhos entre 42% e 65%, caindo para entre 31% e 41% na idade de 1.

Em busca de um modelo de mouse útil e prático, Maheshwari e seus colegas tiveram que superar um problema de tamanho.

“Os filhotes de ratos recém-nascidos têm aproximadamente o tamanho de um quarto e pesam menos de 30 gramas, por isso é extremamente difícil remover sangue suficiente deles para os laboratórios analisarem, ”Maheshwari diz.

Para superar esse obstáculo, uma empresa privada de equipamentos de diagnóstico médico doou o uso de seu avançado sistema de análise de sangue que requer apenas uma amostra de 5 microlitros (5 milionésimos de um litro) em vez dos 50 microlitros - 60% do suprimento total de sangue de um filhote de rato - que a maioria dos laboratórios de teste exige .

Próximo, os pesquisadores desenvolveram um procedimento para induzir anemia severa nos filhotes, removendo cerca de metade de seu volume de sangue a cada dois dias durante 10 dias após o nascimento. Isso reduziu a contagem de glóbulos vermelhos para níveis próximos aos de bebês recém-nascidos com anemia grave.

Sete dias após o nascimento, os pesquisadores introduziram bactérias que foram isoladas e cultivadas em um bebê prematuro com NEC. Finalmente, transfusões de hemácias foram realizadas no 11º dia após o nascimento.

Nas próximas 48 horas, os pesquisadores procuraram o desenvolvimento de sintomas semelhantes aos da NEC em seu grupo experimental e três outros conjuntos de filhotes de camundongos:(1) um grupo de controle sem qualquer intervenção, (2) um grupo sem anemia que recebeu transfusões e (3) um grupo com anemia, mas não transfundido.

Apenas os filhotes gravemente anêmicos que receberam transfusões de sangue mostraram danos intestinais que se assemelhavam a NEC humana com necrose, inflamação e separação dos tecidos que sustentam o revestimento do cólon. O próximo passo foi ver se poderíamos encontrar um mecanismo para explicar por que isso ocorreu. "

Akhil Maheshwari, M.D

Examinar o sangue dos filhotes com condições semelhantes à NEC após serem transfundidos, os pesquisadores descobriram que ele continha três componentes não vistos no sangue dos outros ratos de teste:(1) um grande número de macrófagos, as células imunológicas que engolfam e digerem resíduos celulares, bactérias e vírus, (2) hemoglobina de livre circulação, as moléculas à base de ferro que normalmente transportam oxigênio por todo o corpo quando ligadas aos glóbulos vermelhos, e (3) níveis elevados de proteínas indutoras de inflamação, indicando que os macrófagos foram ativados mesmo sem uma ameaça biológica ao intestino.

Os pesquisadores também observaram que os níveis de haptoglobina, uma proteína que remove a hemoglobina livre do sangue, foram extremamente baixos.

“Essas descobertas sugerem que a anemia reduz a quantidade de haptoglobina no recém-nascido, evitando que a hemoglobina livre que chega por meio da transfusão seja removida adequadamente como faria normalmente, ”Maheshwari diz.

O que aparentemente acontece, ele diz, é que a hemoglobina livre se liga a um receptor de proteína na parede intestinal que é o mesmo local onde os venenos bacterianos se ligam. Como resultado, o sistema imunológico acredita erroneamente que o intestino está sendo atacado e ativa os macrófagos.

Assim que essas células imunológicas começarem a funcionar, Maheshwari explica, eles desencadeiam a liberação de proteínas inflamatórias vistas no sangue do anêmico, camundongos transfundidos. “Esse evento inicia um golpe duplo na parede intestinal, " ele diz. "Primeiro, as proteínas dos macrófagos inflamam e enfraquecem os tecidos, tornando-os vulneráveis, e então, bactérias se movem e produzem endotoxinas que matam as células individuais. ”

Com evidências de um provável mecanismo para explicar a conexão entre anemia e transfusão no desenvolvimento de NEC, em seguida, os pesquisadores procuraram confirmá-lo, vendo se eles poderiam bloquear duas de suas fases, e talvez, avançar na busca por terapias potenciais.

Em um ensaio, demos haptoglobina a nosso modelo de camundongos anêmicos antes de transfundi-los e bloquear a ativação de macrófagos, portanto, eles não desenvolveram sintomas semelhantes aos da NEC. "

Akhil Maheshwari, M.D

Em outro teste, nanopartículas que Samuel Wickline, M.D., e seus colegas da University of South Florida desenvolvidos foram usados ​​para entregar uma interrupção genética - uma molécula de RNA conhecida como um pequeno RNA interferente, ou siRNA - que bloqueia o sinal químico que diz aos macrófagos para começar a produzir proteínas inflamatórias. As nanopartículas foram marcadas com um corante fluorescente para rastrear seu movimento e incluiu um composto não tóxico derivado do veneno de abelha.

Maheshwari diz que os macrófagos no sangue de filhotes de camundongos anêmicos engolfaram as nanopartículas e as envolveram em vacúolos. O derivado do veneno de abelha, ele explica, abriu os vacúolos para que o siRNA pudesse ser liberado dentro dos macrófagos.

O bloqueador de sinal genético funcionou bem, Wickline diz, protegendo os filhotes de camundongos anêmicos da inflamação intestinal após transfusões de glóbulos vermelhos.

“Porque mostramos que as nanopartículas inibitórias com siRNAs foram capazes de controlar um regulador mestre da inflamação em NEC, talvez esta tecnologia possa um dia ser aplicada não apenas para tratar ou prevenir a NEC, mas outras doenças em que a inflamação desempenha um papel fundamental, como artrite e aterosclerose, " ele diz.

Maheshwari diz que espera que o novo modelo de camundongo e as descobertas do estudo atual possam ser usados ​​para desenvolver biomarcadores sanguíneos que possam indicar quais recém-nascidos humanos estão em maior risco de desenvolver NEC.

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