PLOS ONE: Revelando o mecanismo molecular de câncer gástrico marcador anexina A4 na proliferação de células cancerígenas Usando Exon Arrays

Abstract

O câncer gástrico é uma doença maligna que surge do epitélio gástrico. Um potencial biomarcador para o câncer gástrico é a anexina proteína A4 (ANXA4), um Ca intracelular ^{2 + sensor. ANXA4 é encontrada principalmente nas células epiteliais, e é conhecido por estar envolvido em vários processos biológicos, incluindo a apoptose, o ciclo celular e anticoagulação. No que diz respeito ao câncer, ANXA4-superexpressão tem sido observada em cancros de várias origens, incluindo tumores gástricos associados com infecção por Helicobacter pylori
. H. pylori
induz a expressão ANXA4 e intracelular [Ca 2 +] _{i elevação, e é um importante fator de risco para a carcinogênese que resulta em câncer gástrico. Apesar desta correlação, o papel de ANXA4 na progressão de tumores gástricos permanece obscura. Neste estudo, investigou-se ANXA4 pode mediar a taxa de crescimento celular e se os sinais a jusante ANXA4 estão envolvidos na tumorigénese. Após a observação da taxa de crescimento celular em tempo real, determinou-se que ANXA4 promove a proliferação celular. O perfil de transcrição de genes de células que sobre-expressam ANXA4 foi medida e analisada por matrizes exão humanos. A partir destes dados de genes de transcrição, que mostram que a sobreexpressão de ANXA4 regula os genes que são conhecidos por estar relacionada com o cancro, por exemplo, a activação de hialuronano mediada por receptor de motilidade (RHAMM), AKT, e dependente de ciclina-cinase 1 (CDK1), bem como a supressão de p21. A regulação destes genes induz a proliferação de células cancerígenas. Encontramos também Ca 2 + poderia regular a transmissão de sinais a jusante por ANXA4. Sugerimos que ANXA4 desencadeia uma cascata de sinalização, levando a aumento da proliferação de células epiteliais, em última análise, promovendo a carcinogénese. Estes resultados podem, portanto, proporcionar uma nova visão para a terapia de câncer gástrico, especificamente através da modificação da atividade ANXA4}}

Citation:. Lin LL, Huang HC, Juan HF (2012) Revelando o mecanismo molecular de câncer gástrico marcador anexina A4 na proliferação de células cancerígenas Usando Exon Arrays. PLoS ONE 7 (9): e44615. doi: 10.1371 /journal.pone.0044615

editor: Eric Y. Chuang, Universidade Nacional de Taiwan, Taiwan

Recebido: 06 de junho de 2012; Aceito: 06 de agosto de 2012; Publicação: 07 de setembro de 2012

Direitos de autor: © Lin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Conselho Nacional de Ciência de Taiwan (NSC 99-2621-B-002-005-MY3, NSC 99-2621-B-010-001-MY3), a Universidade Nacional de Taiwan de ponta Projeto Direcção de Investigação (10R70602C3) e do Instituto Nacional de Pesquisa em Saúde, Taiwan (NHRIEX100-9819PI). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico é a segunda principal causa de mortes por câncer em todo o mundo e apresenta alta prevalência em populações asiáticas. Embora a incidência de câncer gástrico está em declínio, a taxa global de sobrevida em 5 anos permanece baixa [1]. Determinar os mais eficientes terapias de câncer gástrico e desenvolvimento início de carreira ferramentas de diagnóstico são estratégias importantes que afectam os resultados clínicos. A investigação abrangente dos mecanismos moleculares que estão na base carcinogênese gástrica poderia prestar assistência no desenvolvimento de estratégias terapêuticas úteis para esta doença.

Helicobacter pylori
é um patógeno gástrico e é o fator etiológico predominante para a carcinogênese gástrica . Aproximadamente metade da população mundial está infectada com o H. pylori
, e mais de 60% dos pacientes com câncer gástrico têm uma história de H. pylori
-positivity [2], [3], [4]. Estudos recentes mostraram que H. pylori
pode induzir tanto a proliferação de células de cancro gástrico e respostas inflamatórias da mucosa [5], [6]. Assim, a fim de investigar os mecanismos moleculares carcinogênese gástrica subjacente, é necessário investigar o papel e os mecanismos de H. pylori
na carcinogênese gástrica.

Anexinas são ubiquamente expressa na maioria dos organismos, incluindo animais, plantas, fungos e protistas. Ela está associada com uma variedade de funções fisiológicas [7]. Com base na estrutura do seu domínio do núcleo conservado, anexinas são considerados intracelular de Ca ^{2+ sensores e proteínas de ligação de fosfolipidos. Eles têm sido observados para estimular o tráfico de vesículas de membrana e de agregação em resposta ao aumento intracelular [Ca 2 +] _{I [8], [9]. Nos seres humanos, anexinas foram observados para ter uma gama de funções celulares que tenham sido implicada na organização do citoesqueleto, exocitose, endocitose, regulação de canais de iões, a inflamação, a apoptose, a fibrinólise e coagulação [8]. Anexinas também são considerados para ser envolvido no cancro, diabetes e a inflamação [10]. Recentemente, mais e mais estudos têm surgido que implicam o envolvimento das anexinas na carcinogénese, bem como para promover a proliferação de [11], [12], invasão [13] e metástase [14], [15]. No entanto, a relação entre todos os membros da família com cancro anexinas não foi caracterizado.}}

anexina A4 (ANXA4) é um membro da família anexinas associados com o sistema digestivo. Ele está proeminentemente expresso nas células epiteliais [16]. Estudos recentes têm mostrado que ANXA4 é considerado para ser um biomarcador potencial gástrica com base na sua identificação, em tecidos de pacientes com cancro gástrico em estudos de proteómica. -Regulação de ANXA4 é especificamente encontrada em H. pylori
tecidos tumorais infectados [17], [18]. Além disso, muitos estudos têm relatado uma relação entre a expressão ANXA4 e câncer. Esta relação foi reportado no adenocarcinoma pancreático [19], carcinoma de células claras de ovário [20], [21], carcinoma renal [22], carcinoma colorrectal [23] e o cancro da próstata [24]. No carcinoma de células renais, a sobre-regulação de ANXA4 está envolvido na disseminação de células tumorais, promovendo a migração de células [22]. Em pacientes com cancro colo-rectal, de expressão elevada de ANXA4 foi associada a uma baixa taxa de sobrevivência e foi classificado como um biomarcador potencial para o diagnóstico de tumores [23]. Na medida em que funcionam como celular, ANXA4 poderia induzir a sinalização de cálcio, anticoagulação e resistência à apoptose [25], [26]. Estes eventos indicam que ANXA4 tem uma função tumorigênico regulando taxa de crescimento celular.

Neste estudo, pretende-se elucidar o mecanismo molecular pelo qual ANXA4 induz carcinogênese. Para conseguir isso, monitorizada a taxa de crescimento de células de cancro gástrico com diferentes níveis de expressão ANXA4. Também avaliamos o perfil de expressão transcricional de células ANXA4-sobre-expressam e usado matrizes de exão para analisar a sinalização a jusante de ANXA4. A partir desses estudos, foram identificados 9 genes relacionados ao câncer de sinais a jusante ANXA4 usando o banco de dados Ingenuity Pathway Analysis (IPA). Além disso, demonstramos que ANXA4 regula a ativação de RHAMM, AKT, CDK1 ea supressão de p21, e, portanto, proposto uma via proliferação celular regulada por ANXA4.

Resultados

A Ativação do ANXA4 Promove Proliferação celular

Temos relatado anteriormente que ANXA4 é sobre-expresso em H. pylori
tecido infectado gástrica tumor [17]. Para investigar mais a relação entre ANXA4 e carcinogênese, que teve como objetivo determinar se ANXA4 promove a proliferação celular. As células foram transf ectadas com quer de comprimento completo ANXA4
ADNc para aumentar a expressão ANXA4 ou ARNsi específico destinado para silenciar a expressão ANXA4. Após a transfecção, que monitorizada a taxa de crescimento de células de cancro gástrico AGS usando um sistema de análise de células em tempo real (RTCA). Os números de células foram registados como um valor de índice de células (CI). As curvas de crescimento de células de AGS foram modificados após a transfecção. A sobre-expressão de ANXA4 aumentou significativamente a taxa de crescimento celular em células AGS em comparação com células de controlo ( P
< 0,001; Figura 1A), ao passo que ANXA4 knockdown diminuiu significativamente a taxa de crescimento ( P <
; 0,001; Figura 1B). Estes resultados sugerem que ANXA4 tem o potencial para promover a proliferação celular.

ANXA4 aumenta a expressão das proteínas de membrana, o RHAMM e LAMP2

Examinámos também a diferença na expressão génica entre as células que sobre-expressam e ANXA4 as células de controlo que expressam um vector vazio. Nós examinamos isso usando análise de arranjo de exão, que oferece uma visão mais precisa da expressão em nível de gene, utilizando quatro sondas por exão, em comparação com os convencionais "matrizes de 3 [27]. Na Figura S1, o X
-axis do gráfico de dispersão mostra a intensidade de expressão sonda medido em um experimento e Y-
eixo exibe as intensidades de expressão sonda medidos em outro experimento . Estes resultados indicam uma correlação entre os resultados dos dois experimentos e, portanto, indicam uma consistência entre as nossas microarrays duplicados. Os níveis de expressão de genes foram calculadas a partir das intensidades medidas por meio de conjuntos de sondas. No geral, a expressão de 1.052 genes foram encontrados para ser significativamente diferentes ( P Art < 0,05). Entre as células-superexpressão ANXA4 e células de controlo

ANXA4 é uma membrana plasmática proteína de ligação, por isso, propor que outras proteínas da membrana plasmática pode ser regulada por ANXA4 e trabalhar em conjunto para transduzir a sua sinalização a jusante. Para explorar a transdução de sinalização regulada por ANXA4, nós investigamos proteínas de membrana de plasma a partir de análise de matriz exão. Quarenta e sete proteínas de membrana de plasma foram observados para ter uma mudança ≥1.5 vezes em células que sobre-expressam ANXA4 (Tabela S1). Entre estes, receptor motilidade mediada por ácido hialurônico ( HMMR
) apresentou o maior aumento na expressão (2,4 vezes; Tabela S1). Além disso, o nosso estudo anterior mostrou que a expressão da superfície celular da proteína associada à membrana lisossomal-2 ( LAMP2
), um marcador lisossomal, é sobre-regulada por ANXA4 e está envolvido na exocitose (Figura S2 e S1 arquivo) . Aqui, a expressão transcricional de o LAMP2
também mostraram um aumento na expressão (1,8 vezes; Tabela S1), quando medido por análise de matriz exão. Neste estudo, foi superexpresso ANXA4 ou silenciados (Figura 2A) e em seguida analisados ​​por imunotransferência para verificar a expressão de proteínas de o RHAMM e LAMP2. ANXA4 superexpressão aumentou a expressão de RHAMM (Figura 2B) e LAMP2 (Figura 2C) e, de acordo com isso, o knockdown da expressão ANXA4 diminuíram os níveis de expressão (Figura 2B e 2C).

A sobre-expressão do cancro ANXA4 Regula -relacionados gene Expression

foi utilizado o banco de dados Ingenuity Pathway Analysis (IPA) para realizar uma análise da função dos genes dos dados de matriz exão e descobriram que 25 dos 42 genes eram elegíveis para análise da função de rede (≥2 vezes expressão diferencial, t
teste, P Art < 0,05) (Tabela 1). Três redes funcionais foram significativamente associados com genes regulados por ANXA4. A rede mais fortemente associada era câncer, ciclo celular e sistema reprodutivo doença
( P Art < 0,05; Figura 3A), eo topo do ranking de doenças ou distúrbios foi
câncer ( P Art < 0,05; Figura 3B). Havia 9 genes classificados como genes relacionados ao câncer em células-superexpressão ANXA4 incluindo 7 genes que foram up-regulamentados em nossos experimentos. Esses genes são a tradução eucariótica 4E fator de iniciação ( eIF4E
), complexo succinato desidrogenase, subunidade C, proteína de membrana integral, 15 kDa ( SDHC
), dependente da ciclina quinase 1 ( CDK1
), suprimido em leucemia linfocítica 2 ( dLEU2
), cromatina modificar proteínas 5 ( CHMP5
), proteína interagindo TIMELESS ( TIPIN
), PDZ- quinase de ligação ( PBK
). Coriônica somatomamotropina hormona 1 (placentária lactogênio) ( CSH1
) e interferon alfa 2 ( IFNA2
) foram regulados negativamente pela ANXA4. Com base em nossos resultados, propomos que ANXA4 tem uma função na indução de proliferação celular. Além disso, CDK1
e PBK
(Figura 3B e Tabela 1) foram considerados como estando envolvidos no modelo de indução de proliferação ANXA4. Uma vez que a activação CDK1 está associado com a proliferação de células no desenvolvimento de linfoma MALT gástrico [28]. A activação mútuo de CDK1 e PBK foi previamente relatada [29]. Neste estudo, a sobre-regulação de CDK1
e PBK
observada em células que sobre-expressam ANXA4 foi validado pela reacção em cadeia da polimerase em tempo real quantitativo (qRT-PCR), análise (Figura S3) .

ANXA4 Regula a ativação de AKT, CDK1 e a Supressão de p21

activação CDK1, que é regulada por p21, inibe a prisão fase G2 /M, promovendo assim a mitose e proliferação celular [30 ]. Também tem sido relatado que os blocos de AKT a activação de p21, causando a sua acumulação no citoplasma e, por conseguinte, promover a proliferação de células [31]. Utilizando análise de imunotransf erência, foi observado que a sobre-expressão de ANXA4 aumentou a fosforilação da serina 473 no AKT e treonina 161 de CDK1 e diminuiu a expressão de p21 (Figura 4A). Em adição a isso, o knockdown da expressão ANXA4 diminuiu fosfo-AKT e fosfo-CDK1 e aumentou a expressão de p21 (Figura 4B). Estes dados sugerem que fosfo-AKT, fosfo-CDK1 e p21 são regulados por ANXA4 e são sinais a jusante de ANXA4.

Ca 2 + medeia ANXA4 Downstream Sinalização Transdução

Na carcinogênese, Ca ^{2+ está envolvido em causar a transdução de sinal para mediar uma ampla variedade de processos biológicos incluindo a invasão, proliferação, angiogénese e metástase [32]. Tem sido relatado que anexinas pode mediar alguns mecanismos fisiológicos num Ca 2 + maneira dependente [9]. Em estudos anteriores, intracelular [Ca 2 +] _{i elevação foi induzida por H. pylori
infecção, o que, por sua vez, regula a expressão se-ANXA4 [17], [33]. Para determinar se um aumento intracelular de [Ca 2 +] i medeia a transmissão de sinais a jusante de ANXA4, AGS células foram tratadas com ionomicina. Ionomicina é uma Ca 2+ ionóforo e foi adicionado ao meio de cultura no nosso modelo de células AGS para induzir uma elevação sustentada da intracelular [Ca 2 +] i [34]. As expressões proteína de ANXA4, LAMP2, RHAMM, p21, fosfo-AKT e fosfo-CDK1 foram medidos por análise de imunotransferência (Figura 5A). Semelhante a nossas observações com superexpressão ANXA4, o aumento da [Ca 2 +] i níveis significativamente up-regulada a expressão de RHAMM ( P Art < 0,01) e fosfo-AKT (Ser 473) ( P Art < 0,05) e significativamente regulada a expressão da p21 ( P Art < 0,01) (Figura 5B). activação CDK1 foi ligeiramente aumentada por [Ca 2 +] i elevação. No entanto, elevado [Ca 2 +] i níveis não teve efeito sobre a expressão de ANXA4 e LAMP2. Em nosso estudo anterior, ANXA4 e LAMP2 pode localizar a membrana plasmática após H. pylori
infecção intracelular [Ca 2 +] i elevação (Figura S4 e S1 arquivo). Estes resultados sugerem que Ca 2 + apenas muda de localização intracelular de ANXA4 e LAMP2, mas não regula a sua expressão.}}

Discussão

Na pesquisa do câncer, a identificação de biomarcadores e o esclarecimento posterior das suas relações com mecanicistas tumorigénese pode contribuir para o desenvolvimento de ferramentas de diagnóstico úteis e resultam em estratégias terapêuticas óptimas. Recentemente, mais e mais estudos têm demonstrado que as proteínas de biomarcadores candidatos na família anexinas são potencialmente importante na progressão de vários cancros; por exemplo, ANXA1 para o câncer clara de células renais, ANXA2 para o câncer de estômago e câncer colorretal, ANXA4 para o cancro colorectal, ANXA8 para câncer de mama, ANXA10 para o câncer hepatocelular, ANXA11 de cancro do ovário e cancro colorectal [35]. ANXA4, um membro da família anexinas, foi observada a ser sobre-expressos em tecidos de tumor gástrico e também está associada com o cancro relacionados com H gástrico. pylori
infecção [17]. Além disso, um outro membro da família anexinas, ANXA2, também tem sido observada a ser sobre-expresso em cancro gástrico e está relacionada com o resultado clínico pobre, tornando-o um potencial factor de prognóstico [36]. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem o envolvimento de ANXA4 na tumorigénese; No entanto, o seu mecanismo exacto no processo permanece obscuro. A fim de melhor avaliar a função celular de ANXA4 na progressão do cancro gástrico, que explorou a ligação entre os dois e, posteriormente, demonstrou que ANXA4 pode regular genes relacionados ao câncer e propagar o caminho para a proliferação celular.

no presente estudo, verificou-se que proteínas associadas à carcinogênese, como RHAMM, AKT, p21, PBK, e CDK1 são regulados pela superexpressão de ANXA4. Uma representação esquemática de sinais a jusante induzidos por ANXA4 relacionadas com proliferação de células é mostrada na Figura 6. HMMR
(RHAMM) é um oncogene que é sobre-expressa em vários cancros, incluindo o cancro gástrico, e tem sido implicada em muitos celular processos, tais como a sinalização celular, proliferação celular, e tumorigénese [37], [38].

tem sido relatado que o RHAMM induz a cascata de sinalização RAS e activa AKT [39]. A cascata de sinalização RAS transduz sinais a jusante ativando fosfo-AKT através de fosfatidilinositol 3-quinases. Esta activação de AKT, também tem sido relatado como um marcador de progressão para cancro gástrico [40]. Temos relatado anteriormente que H. pylori
está associada com sobre-expressão ANXA4 [17]. H. pylori
pode entregar o gene associado citotoxina A (CagA) nas células hospedeiras, que resulta na activação AKT, e promover, assim, a proliferação de células [41]. Em termos de sobrevivência celular, AKT suprime a apoptose por estimular NF-kB [42]. Estudos recentes mostraram também que ANXA4 interage com p105 (proteína precursora de p50 de NF-kB) e suprime a actividade transcricional de NF-kB para induzir um efeito anti-apoptótico [25]. Tomados em conjunto, estas observações indicam que ANXA4 desempenha um papel importante na sobrevivência celular e crescimento celular.

complexos ciclina B1-CDK1 regulam a fase do ciclo celular G2 /M, e também têm sido implicadas na promoção da tumorigénese [43]. Um estudo recente revelou que o aumento da expressão de CDK1 está associada com a progressão de H. pylori
gastrite -associated de linfoma do tecido linfóide associado à mucosa [28]. Neste estudo, a ativação CDK1 foi regulada por ANXA4. Esses eventos sugerem que ANXA4 poderia mediar a via de sinalização a jusante, levando à tumorigênese em pacientes com câncer gástrico com um H. pylori
infecção.

Além de seu envolvimento na progressão do câncer, ANXA4 também tem sido associada a chemoresistance adquirido para drogas anticâncer [44], [45], [46]. Numa linha celular de paclitaxel-resistente (H460 /T800), a expressão é aumentada ANXA4 e localizada no núcleo [44]. No carcinoma de células claras das células de ovário e mesotelioma, expressão ANXA4 é elevada e associada com resistência ao tratamento com carboplatina, e é considerado como um biomarcador para a susceptibilidade à cisplatina [45], [46]. Além disso, ANXA4 é um sensor de 2+ intracelular de Ca ^{, e Ca 2+ desempenha um papel importante na insuficiência cardíaca e neurotoxicidade [47], [48]. Estudos recentes têm mostrado que o aumento da quantidade de ANXA4 não só está associada com o cancro, mas também da doença de Alzheimer, insuficiência cardíaca e lesão celular causada por etanol [49], [50], [51].}

Ca ^{2+ também é necessário sistema mensageiro para o processo de proliferação de células e pode regular o ciclo celular [52], [53]. Tem sido relatado que o Ca 2 + pode activar Akt para promover a sobrevivência de células [54]. Neste estudo, verificou-se que a expressão de RHAMM, fosfo-AKT ea supressão da p21 foram significativamente aumentados por [Ca 2 +] _{i elevação (Figura 5). H. pylori
está associada a superexpressão ANXA4 e intracelular [Ca 2 +] i elevação (Figura S4 e S1 arquivo) [17], [33]. Estes resultados indicam que H. pylori
pode induzir alguma sinalização a jusante de ANXA4 estimulando intracelular [Ca 2 +] i elevação. No entanto, o mecanismo de detalhe no processo pode ser complexo e ainda não está claro. Estes poderiam fornecer elucidação do processo de tumorigênese gástrica subjacente H. pylori
estimulação. Tomados em conjunto, essa evidência sugere que Ca 2 + pode ajudar ANXA4 para transduzir sinalização e promover tumorigênese em pacientes gástricas com H. pylori
infecção.}}

Em conclusão, os nossos resultados mostram que o silenciamento de ANXA4 diminui a proliferação de células epiteliais, enquanto a sua superexpressão aumenta a proliferação. Além disso, ANXA4 induz sinais a jusante que promovem o crescimento celular. Nossa hipótese é que esses sinais a jusante e a ativação da divisão de célula hospedeira pode ser eventos patogênicos em H. pylori
carcinogênese induzida. Na terapia clínica corrente, AKT, p21 e CDK1 foram utilizados como alvo de um fármaco anticancerígeno. inibidor de AKT, perifosine, é um agente oral anti-cancro e tem actividade anti-proliferação em vários modelos de tumores [55], [56], [57]. O paclitaxel (Taxol) e vincristina pode induzir e aumentar a expressão de p21 para diminuir a fase G2 /M prisão e a proliferação de células bloco [58], [59], [60], [61]. O flavopiridol é um inibidor de várias CDKs incluindo CDK1 para induzir apoptose e anti-angiogénese [62]. Estes estudos indicam que a elevação de ANXA4 em pacientes poderia ser considerado como um fármaco alvo para terapia do cancro gástrico. O uso de vários medicamentos em combinação pode proporcionar um tratamento mais eficaz para o bloqueio de sinais na via. Tomados em conjunto, este estudo poderia fornecer novos insights sobre o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para o câncer gástrico.

Materiais e Métodos

linhas de células e condições de cultura

Estômago humano adenocarcinoma de células AGS (CRL-1739, ATCC) foram cultivadas em 90% de RPMI 1640 (Biological Industries, Beth-Haemek, Israel) que foi suplementado com 1% de penicilina /estreptomicina e soro bovino fetal a 10% (Biological Industries, Beth-Haemek, Israel) . As células foram cultivadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada controlada numa incubadora contendo 5% de CO _2.

Plasmídeos e transfecções

Full-length
foi ANXA4 amplificado por PCR utilizando o par de iniciadores ANXA4
-F (5 'atataagcttgccaccatggccatggcaaccaaa 3') e ANXA4
-R (5 'gcgcgggaattcttaatcatctcctccaca 3'), e o produto de amplificação foi inserido no HindIII /EcoRI de pcDNA3.1 (+) (Invitrogen, Carlsbad, CA). ANXA4
espec�ico siRNA controlo negativo e discrição siRNA (discrição ARNi ™) foram adquiridos a partir de Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA). As células foram cultivadas em placas de seis poços ou em lamelas revestidas durante 24 h. As células foram então transf ectadas transitoriamente com pcDNA 3.1 (+) / ANXA4
(8 ug para uma placa de seis poços; 0,4 ug /ml para uma placa de 96 poços e-placa) ou ANXA4
ARNsi (100 pmol para uma placa de seis poços; 10 pmol de 96 poços e-placa) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. A eficiência do vector de expressão e siRNA de transfecção foi analisada por imunotransf erência. Depois de transfecção durante 48 h, foi detectada a expressão diferencial de proteínas e genes

Anticorpos

Os anticorpos monoclonais de ratinho utilizadas neste estudo foram como se segue:. CDK1 p34 (SC-51578) a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA); LAMP2 (ab25631) e RHAMM (ab67003) da Abcam (Cambridge, UK); e α-tubulina (T5168) a partir de Sigma (Dorset, Reino Unido). O coelho anticorpos policlonais foram como se segue: ANXA4 (SC-28827), p21 (SC-397), e p34 pCDK1 (Thr 161; SC-101654) a partir de Santa Cruz Biotechnology; e AKT (9272) e pAKT (Ser473; 9271S). a partir de Cell Signaling Technology (Beverly, MA, EUA)

imunotransferência

Os lisados ​​celulares foram preparados a partir de células AGS que foram transitoriamente transfectadas com o vectores de expressão pcDNA 3.1 (+) / ANXA4
(8 ug) ou ANXA4
siRNA (100 pmol). Para determinar as diferenças na expressão de proteínas sob condições de alta intracelular [Ca ^{2 +] _{i, ionomicina (5 uM) foi adicionado às células durante 1 h. Para estudar os efeitos de inibição da fosforilação de Akt, as células foram jejuadas durante 1,5 h depois de uma 48-h a transfecção e foram tratadas com 5 uM de inibidor de AKT a VIII (Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha) durante 1 h. As amostras foram separadas por 10% SDS-PAGE e depois transferidos para difluoreto de polivinilideno (PVDF) membranas (Millipore, Billerica, MA, EUA). anti-ANXA4 (: Após o bloqueio em 5% de leite desnatado e soro fisiológico (TBS) contendo 0,1% de Tween 20 (JT Baker, Phillipsburg, NJ, EUA) durante 1 h à TA com agitação suave, foram aplicados os seguintes anticorpos primários tris-tamponada 1:1000), anti-p21 (1:500), anti-AKT (1:500), anti-pAKT (Ser473; 1:500), anti-CDK1 (1:1000), anti-pCDK1 (161 Thr; 1:500), e anticorpo anti-RHAMM (1:400). As membranas foram incubadas com anticorpos de cabra anti-ratinho secundário conjugado IgG (Sigma) ou de cabra anti-IgG de coelho conjugado (Rockland, Gilbertsville, PA), respectivamente. anticorpo a-tubulina (1:4000) foi usada como um controlo interno. As imunotransferências foram desenvolvidas utilizando o kit de quimioluminescência aumentada (ECL) de detecção (Millipore) e visualizada em películas de raios-X. A intensidade das bandas observadas foi normalizada com a intensidade da banda α-tubulina. A análise densitométrica foi efectuada utilizando um Kodak D-software de Análise de Imagem Versão 3.6 (Eastman Kodak, Londres, Reino Unido).}}

Exão matriz e hibridação Análise

Para estudar os genes a jusante de ANXA4, comparamos os perfis de expressão do gene entre as células transfectadas com pcDNA3.1 (+) / ANXA4
e as células de controlo transfectadas com um vector vazio utilizando uma matriz exão. O ARN celular total foi extraído utilizando TRIzol ® Reagent (Invitrogen), e a pureza foi confirmada de ARN por espectrofotometria (razão A260 /A280), bem como por electroforese capilar (Agilent Bioanalyzer 2100, Agilent Technologies, Palo Alto, CA, EUA). processamento do RNA e hibridação foram realizadas utilizando os Affymetrix Exon Human 1.0 matrizes ST (Affymetrix, Santa Clara, CA, EUA), de acordo com o protocolo do fabricante. Cada matriz tem 28,869 genes bem anotado com 764,885 sondas diferentes. A matriz contém aproximadamente 26 sondas para cada gene. informações Affymetrix sonda define são exibidas no site NetAffx (http://www.affymetrix.com) [63]. Microarray Analysis (n = 2 por grupo) foi realizada utilizando o Partek Genomics Suite versão 6.5 (Partek Inc., St. Louis, MO, EUA). Os dados brutos (arquivos CEL) foram normalizados utilizando o algoritmo robusto multichip média (RMA) e analisados ​​utilizando t
testes. Análise da função e mecanismo biológica dos genes expressos diferencialmente foi realizada utilizando o software Engenho Pathway Analysis (IPA) versão 7.5; uma pontuação de 3 ou acima foi considerado estatisticamente significativo ( P Art < 0,01) para anotar as informações. Nós apresentaram os dados de matriz à base de dados GEO, eo número do registro série é GSE33620.

Quantitative PCR em tempo real (qRT-PCR)

Os dados da matriz exão obtidos utilizando software Partek e a base de dados IPA foi confirmada por qRT-PCR. O ARN foi isolado a partir de células AGS utilizando TRIzol ® Reagent (Invitrogen) e o Kit RNeasy® Mini (Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. O ADNc da primeira cadeia foi sintetizado a partir do ARNm total, utilizando um kit de transcrição reversa (Invitrogen, Carlsbad, CA). Os iniciadores (Tabela S2) foram concebidos utilizando o software DNAStar (DNAStar, Inc., Madison, WI, EUA) e PrimerBank (http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank). A expressão de genes foi medida usando um sistema em tempo real, detecção por PCR da Bio-Rad com um IQ5 SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA), e foi normalizado para a expressão de GAPDH.

Ensaio de Proliferação de Células

AGS células foram carregados em cada poço de uma 16 poços de microtitulação de E-placa. Cada poço continha matrizes de sensores microelectrónicos na base para detectar o índice de célula (Cl). Para as experiências de transfecção, após incubação durante 24 h, as células foram transfectadas com AGS vectores de expressão ou ARNsi durante 6 horas e monitorizada por um total de 84 h. O E-placa foi colocada no analisador de sistema celular em tempo real (RTCA) e incubadas numa incubadora contendo 5% de CO _{2 a 37 ° C. O nível de proliferação celular foi representada como a CI, que foi baseada na impedância eléctrica medida usando o sistema xCELLigence (Roche, Mannheim, Alemanha).}

Análise estatística

Os dados foram expressos como média ± desvio padrão (SD). Diferença entre grupos independentes foi analisada utilizando t
um teste de Student bilateral. Os dados obtidos a partir do ensaio de proliferação de células foram analisados ​​utilizando o teste de duas amostras de Kolmogorov-Smirnov. A valor P
inferior a 0,05 indicaram significância estatística.

Informações de Apoio
Figura S1. Gráfico de dispersão
das intensidades de sonda nos experimentos de matriz de exão repetidas. As intensidades de sonda de duas experiências repetidas foram apresentados separadamente em um X
-axis e Y
-axis. Cada sonda foi representada por um único ponto no gráfico de dispersão. Estes resultados mostraram a consistência em nossos experimentos de matriz duplicado exão
doi:. 10.1371 /journal.pone.0044615.s001
(TIF)
Figura S2.
ANXA4 participa no reparo da membrana plasmática através do recrutamento de membrana exocitótica. As análises de citometria de fluxo Representante demonstrou a presença de LAMP2 em H. pylori
células infectados. células que sobre-expressam ANXA4 (A) foram comparados com (B) em> -silenced células. Os resultados indicam que promove a expressão ANXA4 LAMP2 na superfície de H. pylori
células infectados. ANXA4 superexpressão, Over-ANXA4; ARNsi de controlo, siControl; . ANXA4
siRNA, si ANXA4
doi: 10.1371 /journal.pone.0044615.s002
(TIF)
Figura S3.
ANXA4 induz transdução de sinal a jusante. Um ensaio de qRT-PCR de células que sobre-expressam ANXA4 AGS (caixas pretas) foi realizada para confirmar os dados obtidos a partir de matrizes de exões (caixas cinzentas). Os níveis de mRNA relativa de CDK1
e PBK
foram medidos e normalizados para GAPDH
níveis de mRNA
doi:. 10.1371 /journal.pone.0044615.s003
(TIF)
Figura S4.
intracelular Ca 2 + elevação, ANXA4 e localização LAMP2 sobre H. pylori
infecção. (A) H. pylori
células AGS infectados foram carregadas com Fluo-3 /AM para monitorar intracelulares Ca 2 + níveis por citometria de fluxo. (B) a localização dinâmica de ANXA4 na célula viva. imagens de fluorescência em tempo real, mostrando a localização de EGFP-ANXA4 em H. pylori
AGS infectados e células SC-M1 (seta amarela) corados com Hoechst 33258. fluorescência (C) LAMP2 na superfície do H.

• PLOS ONE: O Efeito da XPD /ERCC2 Polimorfismos em câncer gástrico risco entre diferentes etnias: uma revisão sistemática e meta-análise
• PLOS ONE: proteína secretada ácido e rico em cisteína (SPARC) Suprime Angiogenesis por Down-regulação da expressão de VEGF e MMP-7 em Câncer Gástrico