PLoS ONE: Den apoptotiske Effekt av HIF-1α Hemming Kombinert med Glukose pluss insulinbehandling på magekreft etter hypoksisk Conditions

Abstract

Magekreft utvikler seg under et hypoksisk miljø. HIF-1α er kjent for å spille en viktig rolle i regulering av produksjon av reaktive oksygenarter (ROS) i mitokondriene i henhold hypoksiske betingelser. Vi har tidligere etablert HIF-1a knockdown (KD) celler og kontroll (SC) celler i 58As9 magekreft cellelinje. I denne studien viste vi at KD-celler, men ikke SC celler, apoptose under betingelser med hypoksi (1% O _{2) på grunn av overdreven produksjon av ROS. En kvantitativ RT-PCR-analyse viste at uttrykket av ti gener som er involvert i kontrollmekanismer ROS (inkludert Warburg virkning, mitophagy, elektrontransportkjeden [etc] modifikasjon og ROS scavenging), ble regulert av HIF-1α. Videre, fremming av glukoseopptak av glukose pluss insulin (GI) behandling forsterket apoptotisk virkning, som ble fulgt av ytterligere ROS produksjon i hypoksiske celler KD. Et Western blot-analyse viste at ekspresjon av membran GLUT1 i KD-celler ble løftet av glukose og /eller insulin behandlinger, noe som indikerer at GI-induserte glukoseopptak er formidlet ved øket translokasjon av GLUT1 på cellemembranen. Til slutt ble den anti-tumor effekt av HIF-1α knockdown (KD) pluss GI evaluert ved hjelp av en tumor xenograft modell, hvor en hypoksisk miljø naturlig eksisterer. Som et resultat av den behandling GI sterkt hemmet veksten av tumorer KD hvorved celle apoptose var sterkt indusert i sammenligning med kontrollbehandling. I motsetning til dette ble veksten av tumorer som uttrykker SC HIF-1α ikke påvirkes av GI behandling. Tatt sammen tyder disse resultatene på at HIF-1α inhibering plus GI kan være en ideell behandling fordi apoptose på grunn av ødeleggelse av ROS homeostase er spesifikt indusert i magekreft som vokser under et hypoksisk miljø, men ikke i normalt vev under aerobe forhold}

Citation:. Tanaka T, Kitajima Y, Miyake S, Yanagihara K, Hara H, Nishijima-Matsunobu A, et al. (2015) Den apoptotiske Effekt av HIF-1α Hemming Kombinert med Glukose pluss insulinbehandling på Gastric Cancer henhold hypoksiske betingelser. PLoS ONE 10 (9): e0137257. doi: 10,1371 /journal.pone.0137257

Redaktør: Ester Hammond, University of Oxford, STORBRITANNIA

mottatt: 30 april 2015; Godkjent: 13 august 2015; Publisert: 04.09.2015

Copyright: © 2015 Tanaka et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer

finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

hypoksisk miljø er betydelig i solide tumorer hvor det akselererer sin ondartede atferd [1-4]. I likhet med andre solide tumorer, er magekreft kjent for å involvere store deler av hypoksi innen svulsten [5-7]. Hypoksiske forhold indusere flere biologiske hendelser som angiogenese, lokal invasjon, metastatisk spredning, radio- eller chemoresistance og endret energiomsetningen i mange karsinom, som fører til en dårlig prognose hos pasienter [2-4].

transkripsjonsfaktor hypoksi-induserbar faktor 1 (HIF-1) er den viktigste formidler av den cellulære tilpasning til hypoksi [8-10]. HIF-1 er et heterodimert protein som består av et konstitutivt uttrykt β-subenhet (HIF-1β) og en hypoksi-induserbar α (HIF-1α) subenhet [8-10]. Den HIF-1α subenheten blir degradert gjennom ubiquitin-proteasome veien etter normoxia. I motsetning til dette, i henhold til hypoksi, er HIF-1α stabilisert og dimerizes med HIF-1β samspill med CBP /p300, som deretter bindes til hypoksi responselement (HRE) på promotorområdet av hundrevis av målgener [11-16]. Disse tidligere rapporter har ført til anerkjennelse av HIF-1α som en sentral regulator i patogenesen av solid kreft

reaktive oksygenforbindelser (ROS), som superoksid anion (O _{2 ^{. - ), hydrogenperoksid (H 2o 2), og hydroksyl-radikalet (HO •), består av radikale og ikke-radikal-oksygenforbindelser dannet ved delvis reduksjon av oksygen. Intracellulær ROS er hovedsakelig genereres i mitokondriene av oksidativ fosforylering (OXPHOS), en prosess som utføres av elektrontransportkjeden (ETC) [17]. Når ROS velde mobilantioksidantforsvar, oppstår oksidativt stress. Overdreven oksidativt stress fører til at ROS-mediert skade av nukleinsyrer, proteiner og lipider, og fører til celledød [17, 18].}}

HIF-1α er blitt rapportert å kontrollere ROS-produksjon under hypoksiske betingelser gjennom flere mekanismer inkludert omdannelse av energimetabolisme fra OXPHOS til glykolyse, som er referert til som Warburg virkning [19-23], induksjon av mitokondriell selektiv autophagy (betegnet som mitophagy) [24, 25], ETC modifisering av en subenhet bryter i cytokrom c oksidase (COX) [26] og ROS-fjerningsmidler [27]. I metabolisme av Warburg effekten, aktiverer HIF-1α første transkripsjon av GLUT1
å øke glukoseopptak i cellene. Glukose blir deretter metaboliseres til pyruvat av handlingene glykolytiske enzym medlemmer, som er kjent mål for HIF-1α [28, 29]. Under aerobe betingelser blir pyruvat omdannes til acetyl-CoA (AcCoA) av pyruvat-dehydrogenase (PDH) for oppføring i trikarboksylsyre (TCA) syklus. Omvendt, i kreftceller eksponert for hypoksi, er pyruvat shunted bort fra mitochondria, hvorved HIF-1α oppregulerer ekspresjonen av PDK1 å inhibere PDH aktivitet. Deretter LDHA konverterer alternativt pyruvat til laktat og MCT4 transporterer laktat ut av cellen. Disse genene er også regulert av HIF-1α [16, 30, 31]. Hypoksi induserer mitophagy å hindre overdreven ros produksjon der de skadede mitokondriene elimineres via lysosomal fordøyelsen [24, 25]. Nyere studier har vist at HIF-1α aktiverer transkripsjoner av genene som koder BNIP3 og BNIP3L, viktige faktorer i mitophagy prosessen [32]. En annen studie rapporterte at HIF-1α regulerer COX4 subenheten veksling ved å aktivere transkripsjon av ETC-relaterte gener COX4-2 og LON, en mitokondriell protease som er nødvendig for COX4-1 degradering under hypoxi [26]. Den COX4 subenheten bryteren ble rapportert som et viktig skritt i ROS homeostase, på grunn av sin rolle i å optimalisere effektiviteten av respirasjon etter hypoksi [26]. ROS-scavenger MnSOD er ​​kjent for å omdanne superoksidradikaler til hydrogenperoksyd. En tidligere studie har rapportert at MnSOD blir oppregulert etter hypoksi, selv om dette oppregulering er mediert av HIF-1α ennå ikke er blitt vist [27]. Nylig, en annen rapport viste interessant funn at de embryonale fibroblaster (MEFs) av hypoksisk HIF-1α-null mus døde på grunn av overflødig ROS produksjon, mens MEFs ble reddet av behandling med antioksidant N acetyl-L-cystein (NAC) [ ,,,0],33]. Samlet utgjør disse rapportene tyder på at HIF-1α spiller en sentral rolle i organiseringen av mitokondrielle ROS produksjon i levende celler etter hypoksi.

I denne studien ønsket vi å etablere en terapeutisk modell som viser at hypoksi-indusert apoptose via overproduksjon av ROS kan bli introdusert til HIF-1α mangel mage kreftceller. Vi først avgjøres om hypoksi induserer celledød ved overdreven ros produksjon i HIF-1α knockdown (KD) celler. Deretter adressert vi hypotesen om at innføringen av høye glukosenivåer ved behandling av KD-celler med insulin kan øke den apoptotiske effekt. Til slutt, ved hjelp av en svulst xenograft modell, foreslo vi at HIF-1α hemming kombinert med glukose pluss insulin (GI) behandling kan være en potensiell behandling for magekreft.

Materialer og metoder

Cellekultur betingelser og reagenser

den magekreft cellelinje 58As9 ble vennlig levert av Dr. K. Yanagihara (National Cancer Center Hospital East, Chiba, Japan) desember i 2009. 58As9 cellelinjen ble opprinnelig etablert fra scirrhous gastrisk karsinom-avledet cellelinje HSC-58 [34]. Denne cellelinje ble deretter videre godkjent februar ^{th 24, 2015 av JCRB Cell Bank (Osaka, Japan). En annen magekreft cellelinje, MKN74 ble kjøpt fra Cell Bank, (Tsukuba, Japan) Riken Bio Resource Center. I denne studien har vi brukt stabile HIF-1α knockdown celler KD og 74-KD, som ble etablert av transfeksjon av siRNA plasmid RNAi sekvenser inn i 58As9 og MKN74 celler som beskrevet tidligere [7, 35]. Sekvensene til siRNA som målretter HIF-1α og kontroll egge siRNA ble utformet som følger: HIF-1α siRNA for KD eller 74-KD (5'-CCA CAT TCA CGT ATA TGA T-3 ') og krafse siRNA for SC eller 74- SC (5'-TCT TCG TAA ATA CGT AGG C-3 '). Cellene ble dyrket i RPMI-1640 medium (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO, USA) supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (FBS) og 100 pg /ml kanamycin (Meiji, Tokyo, Japan ) og inkubert ved 37 ° C i en fuktig atmosfære. Cellene ble dyrket under enten normoksisk betingelser (20% O _{2 og 5% CO 2 i luft) eller hypoksiske betingelser (1% O 2, 5% CO 2 og 94% N 2) i et hypoksisk kammer (ASTEC, Fukuoka, Japan) og så behandlet med NAC (Sigma-Aldrich) og insulin (Wako, Osaka, Japan) ved en sluttkonsentrasjon på henholdsvis 5 mM og 500 ng /ml. Konsentrasjonen av den høye glukosemedium ble fremstilt ved tilsetning av 45% D - (+) - Glukose-løsning (Sigma-Aldrich) og sluttkonsentrasjonen ble bestemt til å være 10 g /l, som er 5 ganger høyere enn i normal RPMI-1640 medium.}}

celleviabilitet analysen

celleviabilitet etter normoxia eller hypoksi ble vurdert ved trypanblått fargestoff eksklusjons analyser. For evaluering av medikamentbehandlingseffekter, inkludert NAC, høy glukose og /eller insulin på cellenes levedyktighet, 1 x 10 ^{5-celler ble sådd ut på 6 cm kulturskåler. Cellene ble behandlet med forskjellige stoffer ved de angitte konsentrasjoner og dyrket med normoxia eller hypoksi i 24 timer til 96 timer. Ved slutten av inkubasjonen ble de flytende og adherente celler samlet og pelletert ved sentrifugering (3000 rpm, 5 min). Cellene ble resuspendert i 90 pl av komplett medium, blandet med 10 ul av 0,4% trypanblått-oppløsning og telt ved bruk av et hemocytometer under et mikroskop. Cellen Dødeligheten ble bestemt som forholdet mellom antallet døde celler /det totale celleantall. Alle forsøk ble utført in triplo og uavhengig gjentas minst tre ganger.}

Western blot-analyse

helcellelysater fra dyrkede celler og de xenograft tumorer i mus ble fremstilt ved anvendelse av lyseringsbuffer bestående av 150 mmol /l NaCl, 50 mmol /liter Tris-HCl (pH 7,6), 0,5% Triton X-100, og en protease inhibitor cocktail blanding (Roche, Mannheim, Tyskland). Cellelysater fra cytosoliske fraksjonen og cellemembranfraksjonen ble utarbeidet med en cytokrom c Releasing apoptose Assay Kit og en plasmamembran Protein Extraction Kit (BioVision Inc., Milpitas, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Western blot-analyse ble utført som tidligere beskrevet [7]. Porsjoner inneholder 30 mikrogram av protein ble elektro separert i 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen) og overført til en Amersham Hybond-ECL membran (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) i en overføringsbuffer. Etter blokkering med 5% skummet melk i 30 minutter, ble membranen inkubert med primære antistoffer over natten ved 4 ° C. De følgende primære antistoffer ble brukt: anti-HIF-1α (1: 1000 fortynning, Abcam, Cambridge, UK), anti-spaltet caspase 3 (1: 1000, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), anti-cytokrom c (1 : 500-fortynning, BioVision), anti-GLUT1 (1: 100.000 fortynning, Abcam), og anti-β-aktin (1: 10000 fortynning, Sigma-Aldrich, Inc.). Etter inkubasjon med de tilsvarende sekundære antistoffer, ble signalene utviklet ved hjelp av en Amersham ECL Plus Western blotting Detection System (GE Healthcare).

Påvisning av intracellulær ROS ved flowcytometri

Intracellulær ROS-verdier ble evaluert ved hjelp av en Total ROS Detection Kit (Enzo Life Sciences, Inc., Farmingdale, NY, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. I korte trekk, KD, SC, ble celler dyrket under betingelser med enten normoxia eller hypoksi med eller uten medikamentell behandling (dvs., NAC, høy glukose og /eller insulin) i 24 timer, 48 timer og 72 timer. 74-KD og 74-SC ble også dyrket under betingelser med enten normoxia eller hypoksi i 24, 48 og 72 timer uten enhver behandling. Cellene ble vasket og resuspendert i ROS-deteksjon løsning. ROS-fluorescens ble påvist ved FACS-Calibur flowcytometer (Becton-Dickinson, San Jose, CA) og analysert ved hjelp av Cell quest programmet. Alle forsøk ble utført in triplo. Gjennomsnittlig fluorescens av ROS produksjonen ble avgjort automatisk og presenteres som GEO mener.

Total RNA ekstraksjon og kvantitativ RT-PCR

Total RNA ble ekstrahert fra cellelinjer ved hjelp av en Isogen RNA ekstraksjon kit ( Nippon Gene, Osaka, Japan). En mikrogram av RNA ble konvertert til cDNA ved hjelp av en ReverTra Ace (Toyobo) revers transkripsjon reaksjon kit. CDNA ble anvendt som et templat for PCR. En sanntids kvantitativ RT-PCR (RT-qPCR) ble utført ved hjelp av lys Cycler instrumentsystemet (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Tyskland) ved hjelp av et Lys-Cycler-Faststart DNA Master SYBR grønn I-sett (Roche). De ti gener som ble analysert ved RT-qPCR var som følger: glukosetransportør 1 ( GLUT1
), aldolase C ( ALDOC
), pyruvat dehydrogenase kinase 1 ( PDK1
), laktat dehydrogenase A ( LDHA
) og monokarboksylat transporter 4 ( MCT4
), BCL-2 /adenovirus EIB 19-kDa samspill protein 3 ( BNIP3
), BINP3 som ( BNIP3L
), mitokondrielle mangan superoksid dismutase ( MnSOD
), en mitokondriell protease LON Hotell og cytokromoksydase subenhet 4-2 ( Cox4 - 2
). Primerne ble utformet i henhold til de rapporterte cDNA-sekvenser (GenBank, Bethesda, MD) (tabell 1). Etter å ha utført et denatureringstrinn ved 95 ° C i 3 minutter, ble PCR-amplifisering utført med 50 sykluser av 15 s med denaturering ved 95 ° C, 5 s av annealing ved 60 ° C og 10 s med forlengelse ved 72 ° C. De kvantitative verdier ble normalisert til den β-aktin ( ACTB
) ekspresjon (Tabell 1). Alle forsøk ble utført in triplo og uavhengig gjentas minst tre ganger.

glukoseopptaksanalyse

glukoseopptak i dyrkede celler ble bestemt ved anvendelse av en 2-deoksyglukose (2DG) Opptak Måling Kit (Cosmo BIO Co Ltd, Tokyo, Japan). I korthet ble cellene dyrket under et serum-sultet tilstand i 6 timer, etterfulgt av ytterligere dyrkning i 18 timer i vanlig medium supplert med 10% FBS. Cellene ble inkubert i 24 timer under normoxia eller hypoksi. Deretter ble cellene behandlet med eller uten 500 ng /ml insulin i 18 min. Til slutt, ble cellene behandlet med 2DG i 20 minutter og underkastet måling av 2DG opptak i henhold til produsentens instruksjoner. Alle forsøkene ble utført i tre eksemplarer og middelverdiene ble beregnet.

Dyrestudier

Dyret protokollene ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Komiteene Saga University (protokoll 24-008-0 ) og dannet Arrive retningslinjer for bruk av dyr i forskning. Kvinnelige 4 uker gamle atymiske BALB /cA JCL mus (nu /nu) ble oppnådd fra Nihon Crea Co. (Osaka, Japan). Dyrene ble holdt under spesifikt patogenfrie forhold. De ble gitt mat og sterilt vann autoklaveres med en 12-timers lys-mørke-syklus. Musene ble akklimatisert til miljøet i 7 dager før forsøkene. KD eller SC-celler (3 x 10 ^{6) ble injisert subkutant i ryggen av mus (n = 9 for hver cellelinje). Ti dager etter subkutan inokulering, de xenografter av begge cellene ble håndgripelig. Ni mus som bærer KD eller SC xenotransplantater ble deretter delt i tre grupper for behandling av glukose (8 g /kg /dag, Sigma), glukose pluss insulin (GI) (1 enhet pr 3 g glukose /dag, Wako) eller fosfatbufret saltvann (PBS) som kontrollbehandling. Hver av disse medikamentene ble administrert intraperitonealt til tre mus (seks totalt) tumorer hver 24 timer fra dag 1 til dag 11. I løpet av denne perioden, ble tumorene målt i 2 perpendikulære dimensjoner med en skyvelære hver fjerde dag. Svulsten størrelse ( T
) vurdert som det maksimale kutt området og bestemmes av følgende formel: T
= π /4 × en
× b
, der en
er den korteste akse (mm) og b
er den lengre aksen (mm). Musene ble avlivet 12 dager etter at medikamentell behandling og svulstene ble høstet for den påfølgende forsøket.}

kløyvet caspase 3 immunhistokjemi og vurdering av apoptose in vivo

frosne svulster ble integrert med Tissue-Tek oktober Compound. Disse blokkene ble kuttet i 4-mikrometer tykke seksjoner. For antigen gjenfinning, ble platene oppvarmet i Tris-EDTA-buffer (pH 9,0) i en mikrobølgeovn (500 watt) i 5 minutter. Snittene ble deretter inkubert med anti-spaltet caspase 3 (1: 200, Cell Signaling Technology) i 2 timer ved romtemperatur, og den DAKO Envision + System (Dako Cytomation, Glostrup, Danmark) ble anvendt som det sekundære antistoff. Signalene ble visualisert med diaminobenzidin tetrahydroklorid (0,02%). For vurderingen av apoptose, kløyvde caspase 3-positive celler med brune fargede kjerner ble talt opp i fem felt på 400x forstørrelse og gjennomsnittlig ble beregnet. Immunhistokjemisk uttrykk for spaltet caspase 3 ble blindt gjennomgått og vurdert av en sertifisert patolog (Dr. AN).

Statistisk analyse

Dataene ble analysert ved en ANOVA bruke Prism 5 programvarepakken ( GraphPad Software, La Jolla, CA). For sammenligning mellom to grupper, ble forskjellene i gjennomsnittsverdiene vurderes av Student t-
test og Mann-Whitney U
test. For sammenligning mellom tre eller flere grupper, ble Bonferroni post hoc tester utført for en en-veis ANOVA. En verdi på p < 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant. Alle data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM.

Resultater

HIF-1α knockdown indusert celledød ved apoptose etter hypoksi i 58As9 magekreftceller

HIF-1α uttrykk var vurdert i stabilt HIF-1α knockdown (KD) celler og SC (som kontrollcellelinje) celler. Et Western blot-analyse viste at HIF-1α ekspresjon var fullstendig slått ned i KD-celler etter 8 timer under hypoxi i forhold til de SC celler (figur 1A). Cellen dødeligheten ble anslått etter 24 timer til 96 timer under normoxia og hypoksi. Dødeligheten var høyere i KD-celler enn i de SC cellene under normoxia i 24 til 96 timer, men forskjellene var ikke statistisk signifikant (figur 1B). I motsetning til dette ble det celledød hastighet i KD cellene sterkt øker under hypoksi og signifikant høyere enn det som ble observert i SC-cellene ved 72 og 96 timer (figur 1C). Western blot analyse viste at spaltede kaspase 3 samt cytosoliske cytokrom c ble forhøyet i KD-celler, men ikke i SC-celler under hypoxi i 8 timer (figur 1D og 1E). Hypoksi-indusert celledød ble også bekreftet i andre HIF-1α knockdown magecancerceller 74-KD (S1 Fig). Resultatene indikerte at hypoksi sterkt indusert apoptose i HIF-1α knockdown cellelinje KD.

scavenging ROS snudd den apoptotiske fenotype observert i HIF-1α knockdown celler

Den intracellulære ROS nivået ble beregnet og sammenlignet blant KD og SC celler. ROS-nivået økes på en tidsavhengig måte i KD cellene under hypoksi, mens nivået var svakt forhøyet i SC-celler (figur 2A). ROS-nivået i KD cellene var betydelig høyere etter hypoksi i 24 til 72 timer enn det i SC-celler (figur 2A). ROS-nivåer ble også vurdert i 74-SC celler og 74-KD celler (S2 Fig). ROS-nivåer var ikke forskjellig mellom 74-SC og 74-KD celler i henhold normoxia (S2A Fig). Men under hypoksi, ROS-nivåene var signifikant høyere i 74-KD-celler enn i de 74-SC-celler på 48 til 72 timer (S2B Fig). NAC, en antioksidant, betydelig redusert ROS-nivået i KD cellene under hypoxi i 48 til 72 timer (figur 2B). For å vurdere hvorvidt ROS produksjon induserer hypoksi-indusert celledød i KD-celler, ble celle dødeligheten med eller uten NAC evaluert i KD celler under normoxia og hypoksi. NAC behandling ikke påvirke graden av celledød i KD-celler i henhold til normoxia (figur 2C). I motsetning til dette, NAC behandling reduserte betydelig celledød i KD cellene under hypoxi i 48 til 96 timer (figur 2D).

HIF-1α knockdown redusert hypoksiske induksjon av forskjellige gener som er involvert i kontrollen av ROS produksjons

for å undersøke hypoksi-indusert ROS ansamling i HIF-1α knockdown celler, mRNA uttrykk av ti gener som er involvert i ROS kontroll mekanisme ( GLUT1
, ALDOC
, PDK1
, LDHA
, MCT4
, BNIP3
, BNIP3L
, LON
, COX4-2 Hotell og MnSOD
) ble analysert ved hjelp av en RT-qPCR. Hypoksisk induksjon av genekspresjon ble bestemt ved bretten induksjon (FI). FIS i de ti genene var betydelig lavere i KD celler enn i SC celler (fig 3). Videre, når begrenset til hypoksiske betingelser, uttrykket nivåer av alle ti genene var signifikant lavere i de KD celler enn SC-celler. Disse resultatene viste at HIF-1α knockdown markert redusert hypoksi-indusert ekspresjon av de ti gener. På den annen side, i henhold normoxia, ekspresjonen av PDK1 og BNIP3L var signifikant lavere i de KD cellene enn i SC-celler. Derimot er uttrykk nivåer av LON og COX4-2 var betydelig høyere i KD celler i forhold til SC cellene.

glukose og insulin behandlinger forbedret apoptotisk celledød i KD celler etter hypoksi

Vi neste undersøkt om markedsføringen av glukoseopptak påvirker hypoksi-indusert apoptose i KD celler. Cellen levedyktighet ble vurdert i KD og SC celler følgende behandlinger med kontroll (PBS), høy glukose, insulin eller høy glukose pluss insulin (GI). Hypoksi-indusert celledød ble beregnet ved den FI. Cellen dødeligheten etter hypoksi ble sammenlignet mellom kontrollen behandling og de andre behandlinger i begge cellelinjer (Fig 4). I SC-celler, ble ingen signifikante forskjeller i FI og celledød kurs under hypoksi observert blant noen av behandlingene (figur 4A). I KD cellene ble FI betydelig økt ved hypoksi i alle behandlinger. Særlig GI behandlingen ga den høyeste FI blant alle behandlinger (figur 4B). Cellen dødelighet etter hypoksi var signifikant høyere i GI-behandlede celler enn i kontrollbehandlede celler (figur 4B). For å undersøke hvorvidt behandlinger påvirket ROS-produksjon, ble det ROS nivå analysert i KD cellene. I forhold til normoksisk betingelser ble ROS nivå signifikant forhøyet i KD cellene under hypoksiske betingelser (figur 4C). Under hypoksi ble ROS nivået i KD-celler i betydelig grad økes ved høy glukose, insulin og GI behandling sammenlignet med kontrollbehandling. Den høyeste ROS nivået ble positivt observert i GI-behandlet KD celler (fig 4C).

Vurdering av glukoseopptak etter insulinbehandling

glukoseopptak evne ble analysert i en 2DG innlemmelse studie . I SC og KD-celler under normoxia ble 2DG inkorporering signifikant forhøyet ved 2DG behandling i forhold til ubehandlede celler. Den 2DG innlemmelse ble ytterligere øket ved ytterligere insulinbehandling i begge celler (figur 5A). I forhold til normoxia, hypoksi sterkere stimulerte 2DG opptaket i SC-celler, med eller uten insulin (figur 5B). Lignende funn ble observert i KD cellene under hypoksi (Fig 5B). Men under hypoksi, ble mindre 2DG innlemmet i KD-celler enn i SC-celler, med eller uten ytterligere insulinbehandling (figur 5B). For å undersøke mekanismen for insulinavhengig glukoseopptak, ble den membran ekspresjonen av GLUT1 analysert i KD cellene under normoxia og hypoksi. Under normoxia ble membran GLUT1 uttrykk forhøyet med høy glukose og /eller insulinbehandling i forhold til at med ingen behandling (figur 5C). Sammenlignet med det som ble observert i henhold til normoxia under hypoksi, ble den membran GLUT1 uttrykket forhøyet i alle behandlinger. Videre ble uttrykket økt med høy glukose og /eller insulinbehandling, sammenlignet med den på ingen behandling (figur 5C). Spesielt ble den membran GLUT1 uttrykk de sterkt økte med høy glukose og insulin (GI) behandling i de hypoksiske celler (KD Fig 5C). På den annen side, et uttrykk for en annen GLUT familie, GLUT3, ble svakt observert i KD-celler, og dette funn ble ikke endret blant disse forskjellige behandlinger (data ikke vist). I denne studien ble GLUT2 og GLUT4 ikke uttrykt i KD cellene.

HIF-1α knockdown pluss GI behandling sterkt undertrykte veksten av tumorxenotransplantater i nakne mus

Til slutt fant vi ut at in vivo
effekten av GI behandling på KD og SC tumorxenotransplantater. Fig 6A viser den eksperimentelle design av xenograft musemodell. Ti dager etter den subkutane inokulering av SC eller KD-celler, ble xenografter dyrket på ryggen av nakne mus. På dette tidspunkt bekreftes en Western blot-analyse av HIF-1α uttrykk i SC tumorer, men ikke i KD tumorer (figur 6B). Deretter ble tre medikamenter, bestående av PBS, glukose eller GI, ble intraperitonealt injisert inn i nakne mus som bærer en SC eller KD tumor (daglig fra dag 1 til dag 11). De representative bilder av de tumor-bærende mus som ble behandlet med PBS (SC-PBS og KD-PBS), glukose (SC-glukose og KD-glukose) eller GI (SC-GI og KD-GI) er vist i fig 6C . De KD-glukose og KD-GI tumorer som syntes å være mindre enn de andre svulster. Figur 6D viser vekstkurven av de 6 tumorer. Størrelsen på KD-glukose og KD-GI tumorer var betydelig mindre enn KD-PBS tumor på dag 12. KD-GI tumor var den minste. På den annen side, i de SC mus, var det ingen signifikant forskjell i størrelse av SC-PBS, SC-glukose og SC-GI tumorer (figur 6D). En immunohistokjemisk analyse av spaltet kaspase 3 ble utført for å vurdere apoptose indusert av glukose eller GI behandling. Den positive uttrykk for spaltet caspase3 ble ofte observert i KD-Glukose og KD-GI tumorer (figur 6E). Men alle de KD tumorer oppviste noen grad av spaltet kaspase 3 (figur 6F). I motsetning til dette var det ingen signifikant forskjell i ekspresjonen av spaltet caspase 3 mellom SC-PBS, SC-glukose og SC-GI tumorer. I KD tumorer, den positivt uttrykk for spaltet caspase3 var signifikant høyere i KD-PBS tumor enn i SC-PBS tumor. Videre er ekspresjon av spaltede caspase3 var signifikant høyere i KD-glukose eller KD-GI tumorer enn i KD-PBS tumor. Den høyeste uttrykk ble observert i KD-GI svulst.

Diskusjoner

I denne studien ble HIF-1α knockdown celler brukes til å undersøke om dødelig ROS produksjon kan induseres under hypoksi. Resultatene viste at den apoptotiske celledød ble indusert i KD-celler, men ikke i kontroll SC cellene under hypoksi. Samtidig ROS akkumulert i knockdown cellelinje i henhold til varigheten av hypoksi. Hypoksi- indusert celledød og ROS-akkumulering ble også observert i de forskjellige HIF-1α knockdown 74-KD-celler, men ikke i kontroll 74-SC-celler. Videre NAC behandling reduserte frekvensen av hypoksi-indusert celledød i KD cellene. Disse resultatene indikerer forekomsten av hypoksi-indusert apoptose grunn av overdreven ROS akkumulering i KD celler og støttet en tidligere studie som HIF-1a knockout MEFs døde på grunn av overdreven ros produksjon [33].

ROS er i hovedsak generert i mitokondriene av ETC [17, 19]. Det har blitt rapportert at de mitokondrielle ROS øker under hypoksiske betingelser [17, 19]. Hvis hypoksi vedvarer, induksjon av HIF-1α fører til adaptive mekanismer for å redusere ROS og gjenopprette Redox homeostase via oppregulering av relevante gener [19]. Vi undersøkte derfor om HIF-1α knockdown påvirket mRNA uttrykk av ti gener involvert i kontrollen av ROS produksjon under hypoksi ( GLUT1
, ALDOC
, PDK1
, LDHA Hotell og MCT4
knyttet til Warburg effekten; BNIP3 Hotell og BNIP3L
om mitophagy; LON Hotell og COX4-2
knyttet til ETC, og MnSOD
, en ROS åtseldyr). De integrerte analyser av RT-qPCR serie viste at den hypoksi-indusert ekspresjon av alle ti-genene ble betydelig undertrykt i KD celler, mens under normoxia, mRNA ekspresjon av LON og COX4-2 var signifikant høyere i celler enn KD i SC celler. Disse resultatene indikerte at den dødelige akkumulering av ROS under hypoxi i HIF-1α knockdown-celler kan være på grunn av flere forstyrrelser i ROS-styremekanismen. Derfor kan cancerterapi målretting HIF-1α være effektiv i hypoksisk region innenfor magekreft vev. Mekanismen bak den oppregulert mRNA uttrykk for LON og COX4-2 i KD cellene under normoxia kunne ikke avklart.

Ifølge ovennevnte funn, hypotese vi at markedsføringen av glukoseopptak kan akselerere hypoksi-indusert apoptose gjennom videre ROS produksjon i HIF-1α knockdown KD celler. Som forventet, GI behandling forbedret celledød i hypoksiske KD-celler, som ble ledsaget av øket produksjon ROS. I glukoseopptak studien, insulin økte 2DG opptak i både SC og KD-celler. I forhold til det som ble observert i henhold til normoxia, hypoksi økte 2DG opptak i SC og KD-celler behandlet med eller uten insulin. Opptaket ble øket sterkere i SC enn KD-celler, noe som tyder på en forskjell på grunn av den svekkede GLUT1 induksjon i de hypoksiske celler KD. På den annen side, en Western blot-analyse viste at membran GLUT1 ekspresjon ble øket med høy glukose og /eller insulin behandlinger, sammenlignet med kontrollbehandling i normoksisk og hypoksiske celler KD. Spesielt GI behandling sterkest økte membran GLUT1 uttrykk i hypoksiske KD celler. En tidligere studie rapporterte at insulin fremmer glukose transport ved å stimulere translokasjon av GLUT4 fra intracellulære lagrings vesikler til plasmamembranen i skjelettmuskelceller eller adipocytter [36, 37].

• PLoS ONE: Kopier Antall Gevinst ved 8q24 og 20q11-q13 i magekreft er mer vanlig i tarm-Type enn Diffuse-Type
• PLoS ONE: Serum HER2 er en potensiell surrogat for Tissue HER2 status i Gastric Cancer: en systematisk oversikt og meta-analyse