PLoS One: Az apoptotikus hatását HIF-1α gátlása kombinált glükózt plusz inzulin kezelés hatása gyomorkarcinóma hipoxiás Conditions

absztrakt katalógusa

A gyomorrák alatt nő a hipoxiás környezetben. HIF-1α ismert, hogy fontos szerepet játszik szabályozásában a termelés a reaktív oxigéngyökök (ROS) a mitokondrium hipoxiás körülmények között. Mi korábban megállapított HIF-1α knockdown (KD) sejtek és kontroll (SC) sejtek a 58As9 gyomorrák sejtvonalon. Ebben a vizsgálatban, feltártuk, hogy KD sejtek, de nem SC sejtek, apoptózist indukált körülmények között a hipoxia (1% O _{2) miatt túlzott ROS-termelés. A kvantitatív RT-PCR analízis kimutatta, hogy a kifejezést tíz gének, amelyek részt vesznek az ellenőrzési mechanizmusok ROS (beleértve a Warburg hatás mitophagy, elektrontranszport lánc [ETC] módosítása és ROS öblítő), szabályozta a HIF-1α. Sőt, a promóciós glükóz felvételét glükózt plusz inzulin (GI) kezelés fokozott apoptotikus hatása, ami együtt járt a további ROS termelést hipoxiás KD sejtekben. Western-blot analízis azt mutatta, hogy a hártyás expresszióját GLUT1 a KD sejtek emelkedett volt a glükóz és /vagy inzulin kezelések, jelezve, hogy a Gi-indukált glükóz felvételét közvetíti a megnövekedett áthelyeződését GLUT1 a sejtmembránon. Végül, az anti-tumor hatását HIF-1α knockdown (KD) plusz GI segítségével értékelték tumor xenograft modellben, ahol egy hipoxiás környezet természetben létezik. Ennek eredményeként, a GI kezelés erősen gátolta a növekedést a KD tumorok, amellyel sejt apoptózis magasan indukált, összehasonlítva a kontroll kezelést. Ezzel ellentétben, a növekedés a SC expresszáló tumorok HIF-1α nem befolyásolta a GI kezelést. Mindent összevetve, az eredmények azt sugallják, hogy a HIF-1α gátlás plusz GI lehet ideális terápia, mert a apoptózis következtében a megsemmisítése ROS homeosztázis specifikusan indukálódik gyomorrák, hogy a nő alatt egy hipoxiás környezetben, de nem a normál szövet alatt a aerob körülmények között.}

bevezető hivatkozás: Tanaka T, Kitajima Y, Miyake S, Yanagihara K, Hara, H Nishijima-Matsunobu A, et al. (2015) apoptotikus hatása a HIF-1α gátlása kombinált glükózt plusz inzulin kezelés hatása gyomorkarcinóma hipoxiás körülmények között. PLoS ONE 10 (9): e0137257. doi: 10,1371 /journal.pone.0137257 katalógusa

Szerkesztő: Ester Hammond, University of Oxford, Egyesült Királyság katalógusa

Beérkezett: április 30, 2015; Elfogadva: augusztus 13, 2015; Megjelent: szeptember 4, 2015 katalógusa

Copyright: © 2015 Tanaka et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra katalógusa

Az adatok elérhetősége: Minden lényeges adatot belül a papír és az azt támogató információs fájlokat. katalógusa

Forrás: a szerzők nem támogatja vagy finanszírozási jelenteni. katalógusa

Érdekütközés: a szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. katalógusa

Bevezető katalógusa

A hipoxiás környezetben jelentős, szolid tumorok, ahol gyorsítja rosszindulatú viselkedést [1-4]. Mint más szolid tumorok, gyomorrák ismert bevonni kiterjedt területeit hipoxia belüli tumor [5-7]. Hipoxiás körülmények baktériumtörzs számos biológiai események, mint például az angiogenezis, a helyi invázió, áttétek, radio- vagy kemorezisztenciájának és megváltozott az energia-anyagcsere számos carcinoma, ami rossz prognózist betegek [2-4]. Katalógusa

A transzkripciós faktor hipoxia-indukálható faktor 1 (HIF-1) a fő közvetítő a celluláris alkalmazkodtak az oxigénhiányos [8-10]. HIF-1 egy heterodimer fehérje, amely egy konstitutívan expresszált β-alegység (HIF-1β), és egy hipoxia-indukálható α (HIF-1α) alegység [8-10]. A HIF-1α alegység lebomlik keresztül az ubiquitin-proteaszóma reakcióút alatt normoxia. Ezzel szemben, a hipoxia, a HIF-1α stabilizálódik, és dimerizálódik a HIF-1β interakció CBP /P300, ami aztán kötődik a hipoxia válasz elem (HRE) a promoter régió több száz célgének [11-16]. Ezek a korábbi jelentések vezettek elismerésének HIF-1α központi szabályozó patogenezisében szilárd rák. Katalógusa

A reaktív oxigén gyökök (ROS), mint például a szuperoxid anion (O _{2 ^{- ), hidrogén-peroxid (H 2 O 2), és a hidroxil gyök (HO •), áll a radikális és nem-gyökös oxigén fajták által alkotott részleges csökkentése az oxigén. Intracelluláris ROS elsősorban keletkezik a mitokondriumban az oxidatív foszforiláció (OXPHOS), ez a folyamat által végrehajtott elektron transzport lánc (ETC) [17]. Amikor ROS elborít a celluláris antioxidáns védelmi rendszer, az oxidatív stressz alakul ki. A túlzott oxidatív stressz hatására a ROS által közvetített károsodást a nukleinsavak, fehérjék, és a lipidek és vezet a sejthalál [17, 18].}}

HIF-1α leírták, hogy ellenőrizzék a ROS-termelés hipoxiás körülmények révén több mechanizmusok beleértve az átalakítás az energia-anyagcsere származó OXPHOS a glikolízis, amely a továbbiakban a Warburg hatás [19-23], az indukciós a mitokondriális szelektív autofágiát (kijelölt mitophagy) [24, 25], ETC módosítás egy alegység kapcsoló citokróm c oxidáz (COX) [26] és a ROS dögevők [27]. A metabolikus út a Warburg hatás, HIF-1α első aktiválja a transzkripciós GLUT1 katalógusa növelésére glükóz felvételét a sejtekben. A glükóz ezután metabolizálódik piruvát cselekedetei glikolitikus enzim tagjai, amelyeknek ismert célpontokat a HIF-1α [28, 29]. Aerob körülmények között, a piruvát alakítjuk acetii-CoA (AcCoA) által piruvát-dehidrogenáz (PDH) lépésének a trikarbonsav (TCA) ciklus. Ezzel szemben, a rákos sejtekben kitett hypoxia, piruvát párhuzamosan van távol a mitokondriumok, miáltal a HIF-1α upregulálja a kifejezés a PDK1, hogy gátolja a PDH aktivitást. Ezután ldhA Alternatívaként átalakítja piruvát laktát és MCT4 szállítja a laktát ki a cellából. Ezek a gének is szabályozza a HIF-1α [16, 30, 31]. Hypoxia mitophagy hogy megakadályozzuk a túlzott ROS-termelés, amely a sérült mitokondriumok ürül lizoszomális emésztés [24, 25]. Az újabb vizsgálatok kimutatták, hogy a HIF-1α aktiválja a átiratai kódoló gének BNIP3 és BNIP3L, lényeges tényezők a mitophagy folyamatban [32]. Egy másik tanulmány számolt be, hogy a HIF-1α szabályozza a COX4 alegység kapcsolási aktiválásával transzkripcióját az ETC kapcsolatos gének COX4-2 és LON, egy mitokondriális proteáz, ami szükséges a COX4-1 degradáció alatt hypoxia [26]. A COX4 alegység kapcsoló számoltak be, melynek fontos lépés a ROS homeosztázis miatt szerepet hatékonyságának optimalizálását légzés alatt hipoxia [26]. A ROS megkötő MnSOD ismert átalakítani szuperoxid gyökök hidrogén-peroxid. Egy korábbi tanulmány arról számolt be, hogy a MnSOD felülszabályozott alatt hypoxia, bár hogy ez upreguláció közvetítik a HIF-1α még nem mutatták [27]. Nemrég egy másik jelentés bizonyította érdekes megállapítása, hogy az embrionális fibroblaszt (MEFs) hypoxiás HIF-1α-null egerek miatt halt meg a felesleges ROS termelés, míg a MEFs mentettek kezelés antioxidáns N-acetil-L-cisztein (NAC) [ ,,,0],33]. Együttesen ezek a jelentések azt mutatják, hogy a HIF-1α központi szerepet játszik szervezésében mitokondriális ROS termelés az élő sejtekben alatt hypoxia. Katalógusa

Ebben a tanulmányban azt kívánta megállapítani, terápiás modell azt mutatja, hogy a hipoxia indukálta apoptózis útján a túltermelés ROS lehet bevezetni, hogy a HIF-1α hiányos gyomor rákos sejteket. Kezdetben határozni, hogy a hipoxia sejthalált indukál a túlzott ROS-termelés a HIF-1α knockdown (KD) sejtek. Ezt követően megvizsgáltuk a hipotézist, hogy a bevezetése a magas glükóz szintek kezelésére KD sejtek inzulin fokozhatja az apoptotikus hatást. Végül, egy tumor xenograft modellben, azt javasolta, hogy a HIF-1α gátlás kombinált glukóz plusz inzulin (GI) kezelés lehet egy potenciális terápiás gyomorrák.

Anyagok és módszerek

Sejtkultúra körülmények és reagensek katalógusa

a gyomorrák sejtvonal 58As9 volt szíves rendelkezésünkre Dr. K. Yanagihara (National Cancer Center Hospital East, Chiba, Japán) december 2009-ben 58As9 sejtvonal eredetileg létre a scirrhous gyomorkarcinóma-eredetű sejtvonal HSC-58 [34]. Ez a sejtvonal azután tovább hitelesített február 24-én ^{th, 2015 által JCRB Cell Bank (Osaka, Japán). Egy másik gyomorrák sejtvonal MKN74 került beszerzésre Cell Bank, RIKEN Bio Resource Center (Tsukuba, Japán). A jelen tanulmányban alkalmazott stabil HIF-1α knockdown sejtek KD és 74-KD, melyeket által létrehozott transzfekciója az siRNS plazmidot az RNSi-szekvenciák a 58As9 és MKN74 sejteket a korábban leírtak szerint [7, 35]. A szekvenciák siRNS célzási HIF-1α és vezérlő kódolt siRNS terveztünk a következő: a HIF-1α siRNS Száraz vagy 74-KD (5'-CCA CAT TCA CGT ATA TGA T-3 ') kódoltakat siRNS SC vagy 74- SC (5'-TCT TAA TCG CGT ATA AGG C-3 '). A sejteket RPMI-1640 tápközegben (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO, USA), kiegészítve 10% hővel inaktivált magzati borjúszérummal (FBS) és 100 ng /ml kanamicint (Meiji, Tokió, Japán ), és inkubáljuk 37 ° C-on, nedvesített atmoszférában. A sejteket bármelyike ​​alá normoxiás körülmények között (20% O _{2 és 5% CO 2 levegőn), illetve hipoxiás körülmények között (1% O 2, 5% CO 2 és 94% N 2) egy hipoxiás kamrába (ASTEC, Fukuoka, Japán), majd az oldathoz NAC (Sigma-Aldrich) és inzulin (Wako, Osaka, Japán) végső koncentrációja 5 mM és 500 ng /ml volt. A koncentráció a magas glükóz táptalajban hozzáadásával 45% D - (+) - glükóz-oldatot (Sigma-Aldrich), és a végső koncentrációt meghatároztuk, hogy 10 g /l, amely 5-ször nagyobb, mint a normális RPMI-1640 közegben.}}

életképesség teszt

a sejt életképességét alatt normoxia vagy hypoxia értékelték tripánkék festék kizárásával vizsgálatokban. Az értékeléshez a gyógyszeres kezelés hatások, beleértve a NAC, magas glükóz és /vagy inzulin a sejtek életképességét, 1 × 10 ^{5 sejtet oltunk 6 cm-es csészékbe. A sejteket kezeltünk különböző gyógyszer a jelzett koncentrációkban, és tenyésztjük alatt normoxia vagy hypoxia 24 órán át 96 h. Végén az inkubációs, a lebegő és az adherens sejteket összegyűjtjük és centrifugálással (3000 rpm, 5 perc). A sejteket újra szuszpendáljuk 90 | il teljes közeget, hozzákeverünk 10 | il 0,4% -os tripánkék oldat és számláltuk hemocitométerrel mikroszkóp alatt. A sejt pusztulás mértékét határoztuk meg az arány a száma az elhalt sejtek /összes sejt számát. Minden kísérletet három párhuzamossal végzett, és egymástól függetlenül ismételt, legalább három alkalommal.}

Western-blot-analízis

teljes sejt lizátumokat a tenyésztett sejtekből és a xenograft tumorok egereket elő lízis puffer, amely 150 mmól /l nátrium-klorid, 50 mmol /l Tris-HCl (pH = 7,6), 0,5% Triton X-100, és egy proteázinhibitor-koktél mix (Roche, Mannheim, Németország). Sejtlizátumok a citoszol frakció és a sejtmembrán frakciót állítunk elő a citokróm C Releasing Apoptosis Assay Kit és egy plazma membránprotein, Extraction Kit (BioVision Inc., Milpitas, CA, USA) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint. A Western blot analízist végeztünk a korábban leírtak [7]. Tartalmazó alikvot részt 30 ug protein elektroforetikusan elválasztott 4-12% Bis-Tris zselé (Invitrogen), és átvisszük egy Amersham Hybond-ECL-membránra (GE Healthcare, Buckinghamshire, Egyesült Királyság) egy transzfer pufferben. Blokkolás után 5% -os bőr tej 30 percig, a membránt inkubáltuk primer antitestekkel egy éjszakán át 4 ° C hőmérsékleten. A következő primer antitesteket használtuk: anti-HIF-1α (1: 1000 hígítás, ABCAM, Cambridge, UK), anti-gyel hasított kaszpáz-3 (1: 1000, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), anti-citokróm C (1 : 500 hígítás, BioVision), anti-GLUT1 (1: 100,000 hígítás, ABCAM), és anti-β-aktin (1: 10000 hígításban; Sigma-Aldrich, Inc.). Inkubálás után a megfelelő szekunder antitestekkel jeleket segítségével dolgozzák Amersham ECL Plus Western blot Detection System (GE Healthcare). Katalógusa

kimutatása ROS áramlási citometriával katalógusa

Az intracelluláris ROS értékeket értékelték használva Összesen ROS Detection Kit (Enzo Life Sciences, Inc., Farmingdale, NY, USA), a gyártó utasításai szerint. Röviden, a KD, SC, sejteket tenyésztünk olyan körülmények között sem normoxia vagy hypoxia vagy anélkül gyógyszeres kezelések (azaz, a NAC, magas glükóz és /vagy inzulin) 24 órán, 48 óra és 72 óra. 74-KD és 74-SC is körülményei között tenyésztjük akár normoxia vagy hypoxia 24, 48, és 72 órán át anélkül, gyógyszeres kezelést. A sejteket mostuk, és újra szuszpendáljuk a ROS kimutatási megoldás. ROS a fluoreszcenciát a FACS Calibur áramlási citométerrel (Becton-Dickinson, San Jose, CA), és elemeztük a sejt által Quest szoftver programot. Minden kísérletet három párhuzamosban végeztük. Az átlagos fluoreszcencia a ROS-termelés határoztuk automatikusan és bemutatott, mint a GEO jelent.

Teljes RNS-extrakció és kvantitatív RT-PCR

Teljes RNS-t extraháltunk a sejt vonalak segítségével egy Isogen RNS extrakciós kit ( Nippon Gene, Osaka, Japán). Egy ug RNS-t alakítjuk cDNS alkalmazásával ReverTra Ace (Toyobo) reverz transzkripciós reakció kit. A cDNS-t templátként használtuk a PCR-hez. A valós idejű kvantitatív RT-PCR (RT-qPCR) segítségével végeztük a Fény Cycler műszer rendszer (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Németország) alkalmazásával Light-Cycler-FastStart DNA Master SYBR Green I kit (Roche). A tíz gének analizáltuk RT-qPCR a következők voltak: a glükóz transzporter 1 ( GLUT1
), aldoláz C ( ALDOC
), piruvát dehidrogenáz kináz 1 ( PDK1
), a laktát-dehidrogenáz A ( ldhA katalógusa) és monokarboxilátot transzporter 4 ( MCT4 katalógusa), Bcl-2 /adenovírus EIB 19 kDa fehérje kölcsönható 3 ( BNIP3 katalógusa ), BINP3 mint ( BNIP3L katalógusa), mitokondriális mangán-szuperoxid-dizmutáz ( MnSOD katalógusa), a mitokondriális proteáz LON katalógusa és a citokróm-oxidáz alegység 4-2 ( Cox4 - 2 |). A primereket úgy terveztük szerint a jelentett cDNS-szekvenciákat (GenBank, Bethesda, MD) (1. táblázat). Elvégzése után egy denaturációs lépés 95 ° C-on 3 percig, PCR-amplifikációt végeztünk 50 ciklus: 15 s követett denaturálással 95 ° C-on, 5 s a hőkezelés 60 ° C-on és 10 s 72 ° C-on. A kvantitatív értékeket normalizáltuk a β-aktin ( ACTB
) expressziós (1. táblázat). Minden kísérletet három párhuzamossal végzett, és egymástól függetlenül ismételt, legalább három alkalommal.

Glükózfelvétel assay

A glükóz felvételét tenyésztett sejtekben segítségével határoztuk meg 2-dezoxiglükóz (2DG) felvétel mérése Kit (COSMO BIO Co. Ltd., Tokyo, Japán). Röviden, a sejteket alatt egy szérum-éheztetett állapotban 6 órán, majd a további termesztési 18 órán rendszeres tápközegben, kiegészítve 10% FBS-sel. A sejteket 24 órán át inkubáltuk alatt normoxia vagy hypoxia. Ezt követően a sejteket kezeltük vagy anélkül 500 ng /ml inzulinnal, 18 min. Végül a sejteket kezeltük 2DG 20 percig vetjük alá a mérés a 2DG felvétel szerint a gyártó utasításai szerint. Minden kísérletet három példányban, valamint az átlagos értékeket számoltunk. Katalógusa

Az állatkísérletek katalógusa

Az állat engedélyezett terv az Institutional Animál Care and Use bizottságok Saga University (protokoll 24-008-0 ) és megfelelnek a ARRIVE iránymutatások az állatok felhasználását a kutatásban. Nő 4 hetes csecsemőmirigy nélküli BALB /cA Jel egereket (nu /nu) szereztünk be a Nihon Crea Co. (Osaka, Japán). Az állatokat alatt specifikus patogénmentes körülmények között. Kaptak steril élelmiszerek és autoklávozott vízzel, egy 12 órás fény-sötét ciklusban. Az egereket akklimatizálódott a környezet előtt 7 nappal a kísérletekben. KD vagy SC-sejteket (3 x 10 ^{6) szubkután fecskendeztünk a hátán a egereket (n = 9 minden egyes sejtvonal). Tíz nappal azután, hogy a szubkután beoltás, a xenograftok mindkét sejtek váltak tapintható. Kilenc hordozó egerekben KD vagy SC xenograftok ezután három csoportba osztottuk a kezelés glükózt (8 g /kg /nap, Sigma), a glükóz plusz inzulin (GI) (1 egység per 3 g glükóz /nap, Wako) vagy foszfát-puffereit sóoldattal (PBS), mint a kontroll kezelést. Minden e gyógyszerek intraperitoneálisan három egereket (hat tumorok összes) minden 24 órában az 1. naptól a 11. napon Ebben az időszakban, a tumorok mértük 2 egymásra merőleges irányban egy tolómércével minden négy napig. A tumor mérete ( T katalógusa) értékeltük maximális vágás terület határozza meg a következő képlet szerint: T katalógusa = π /4 × egy fiatal × b katalógusa, ahol a egy fiatal a rövidebb tengely (mm) és a b katalógusa a hosszabb tengely (mm). Az egereket megöltük 12 napon belül a gyógyszeres kezelések és a tumorokat gyűjtöttünk a későbbi kísérlet. Katalógusa}

hasított kaszpáz-3 immunhisztokémiai és az értékelési apoptózis in vivo Matton

A fagyasztott tumorokat beágyazott Tissue-Tek október Összetett. Ezek a blokkok vágtuk 4 mm vastag metszeteket készítettünk. Az antigén-visszanyerés, a lemezeket melegítettük Tris-EDTA-pufferben (pH = 9,0) egy mikrohullámú (500 watt) 5 percig. A metszeteket ezután inkubáltuk anti-gyel hasított kaszpáz-3 (1: 200, Cell Signaling Technology) 2 órán át szobahőmérsékleten keverjük, és DAKO Envision + Rendszer (Dako Cytomation, Glostrup, Dánia) alkalmaztunk a szekunder antitest. A jeleket tettük láthatóvá diaminobenzidin-tetrahidroklorid (0,02%). Az értékeléshez az apoptózis, hasított kaszpáz 3-pozitív sejtek barna színű magok megszámoltuk öt területen, 400x nagyítással, és az átlagot számítva. Az immunhisztokémiai expressziója hasított kaszpáz 3-t vakon áttekintette és értékelte a tanúsított patológus (Dr. AN). Katalógusa

A statisztikai elemzés katalógusa

Az adatokat elemeztük ANOVA Prism 5 szoftver csomag ( GraphPad Software, La Jolla, CA). Az összehasonlítás két csoport között a különbség az átlagos értékek értékeltük Student t- katalógusa teszt és Mann-Whitney U katalógusa teszt. Az összehasonlítás között három vagy több csoport, Bonferroni post hoc tesztet végeztünk egy egyutas ANOVA. A p < 0,05 tekintettük statisztikailag szignifikánsnak. Minden adatot kifejezve átlag ± SEM formában. Katalógusa

Eredmények katalógusa

HIF-1α knockdown indukált apoptotikus sejthalál alatti hypoxia 58As9 gyomorrák sejtek katalógusa

A HIF-1α expresszió értékelni stabil HIF-1α knockdown (KD) sejtek és az SC (mint a kontroll-sejtvonal) sejteket. Western-blot analízis azt mutatta, hogy a HIF-1α expresszió teljesen leütötte a KD sejtekben után 8 órán át hipoxia összehasonlítva a SC sejtek (1A ábra). A sejthalál mértéke becslések 24 óra múlva 96 óra alatt normoxia és hypoxia. A halálozási arány magasabb volt a KD sejtekben, mint az SC sejtek alatt normoxia 24 és 96 óra, de a különbség nem volt statisztikailag szignifikáns (1B ábra). Ezzel szemben a sejthalál ráta a KD sejtek erősen megnőtt alatt hypoxia és jelentősen magasabb, mint a megfigyelt SC sejteket 72 és 96 óra (ábra 1C). A Western-blot analízis azt mutatta, hogy a hasított kaszpáz 3, valamint a citoszolban a citokróm c emelkedettek voltak KD sejtekben, de nem a SC sejtek alatt hypoxia 8 órán át (ábra 1D és 1E). A hipoxia indukált sejthalált is megerősítette más HIF-1α knockdown gyomorrák sejtek 74-KD (S1 ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a hipoxia erősen apoptózist a HIF-1α knockdown sejtvonal KD. Katalógusa

takarítását ROS fordított apoptotikus fenotípus figyelhető meg a HIF-1α akciós sejtek katalógusa

A ROS szint becsülték és míg között KD és SC sejtek. A ROS szint növekedett időfüggő módon a KD sejtekben alatt hipoxia, míg a szint halványan emelkedett a SC sejtek (2A ábra). A ROS szint a KD sejtek szignifikánsan nagyobb volt alatt hypoxia esetében 24-72 órával, mint az SC sejtek (2A ábra). A ROS szintek is értékelték a 74-SC sejtek és a 74-KD sejtekben (S2 ábra). A ROS szintek nem különböztek a 74 SC és 74-KD sejtek alatt normoxia (S2A ábra). Azonban az oxigénhiány, a ROS szintek szignifikánsan magasabbak voltak a 74-KD sejtekben, mint a 74-SC sejtek 48-72 óráig (S2B ábra). NAC, egy antioxidáns, jelentősen csökkent a ROS szint a KD sejtekben alatt hypoxia 48 72 óráig (2B ábra). Annak érdekében, hogy megvizsgálja a ROS-termelés indukál hipoxia által kiváltott sejtpusztulás KD sejtekben a sejthalál mértéke, vagy anélkül NAC értékelték KD sejtekben alatt normoxia és hypoxia. NAC kezelés nem befolyásolta az arány a sejthalál KD sejtekben alatt normoxia (2C ábra). Ezzel szemben, a NAC kezelés szignifikánsan csökkentette a sejtpusztulást a KD sejtekben alatt hypoxia 48 96 órán át (ábra 2D).

HIF-1α knockdown csökkentette a hipoxiás indukció különböző gének szabályozásában részt vevő a ROS-termelés

Annak vizsgálatára, a hipoxia-indukált ROS felhalmozódását a HIF-1α knockdown sejtek, mRNS expressziója tíz gének, amelyek részt vesznek a ROS vezérlő mechanizmus ( GLUT1 katalógusa, ALDOC katalógusa, PDK1 katalógusa, ldhA katalógusa, MCT4 katalógusa, BNIP3 katalógusa, BNIP3L katalógusa, LON
, COX4-2 katalógusa és MnSOD katalógusa) segítségével elemeztük RT-qPCR. A hipoxiás indukciója a gén expresszió értékelte az szeres indukció (FI). A FIS a tíz gén szignifikánsan alacsonyabb volt a KD sejtekben, mint az SC sejtek (3. ábra). Továbbá, amikor korlátozódik hipoxiás körülmények között, az expressziós szintek mind a tíz gén szignifikánsan alacsonyabbak voltak a KD sejtekben, mint az SC sejteket. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a HIF-1α knockdown jelentősen csökkent a hipoxia-indukált expresszióját a tíz géneket. Másrészt, alatt normoxia, a kifejezés a PDK1 és BNIP3L szignifikánsan alacsonyabb volt a KD sejtekben, mint a SC sejtekben. Ezzel szemben, az expressziós szintek LON és COX4-2 szignifikánsan magasabbak voltak a KD sejtekben, összehasonlítva az FB sejteket.

glükóz és inzulin kezelések fokozott az apoptotikus sejthalál KD sejtekben alatt hypoxia

Mi a következő vizsgáltuk, hogy a támogatása a glükóz felvételét befolyásolja a hypoxia indukálta apoptózist KD sejtekben. A sejt életképességét értékelni KD és az SC-sejtek alábbi kezelések kontroll (PBS), a magas glükóz, inzulin vagy magas glükóz plusz inzulin (GI). Hipoxia által indukált sejtpusztulást által becsült FI. A sejthalál mértéke alatt hipoxia összehasonlítottuk a kontroll kezelés és a többi kezelések mindkét sejtvonalban (lásd 4. ábra). Az SC sejtek, nincs jelentős különbség az FI és a sejthalál mértéke alapján hypoxia észleltek között kezelések bármelyikének (ábra 4A). A KD-sejtek, a FI szignifikánsan nőtt, hypoxia minden kezelésben. Különösen GI kezelés eredményezte a legmagasabb FI között minden kezelés (ábra 4B). A sejthalál mértéke alatt hypoxia szignifikánsan magasabb volt a Gi-kezelt sejtekben, mint a kontroll-kezelt sejtekben (ábra 4B). Annak vizsgálatára, hogy a kezelések befolyásolja a ROS termelés, a ROS szint elemeztük a KD sejtekben. Összehasonlítva a normoxiás körülmények között, a ROS szint szignifikánsan magasabb volt a KD sejtek hipoxiás körülmények között (ábra 4C). Under hipoxia, a ROS szint KD sejtek szignifikánsan nőtt, magas glükóz, inzulin és a GI kezelés képest, hogy ellenőrizzék a kezelést. A legmagasabb szintű ROS pozitívan megfigyelhető a GI kezelt KD sejtekben (4C). Katalógusa

felmérése glükóz felvételét követően az inzulinkezelés katalógusa

A glükóz felvételét képességét vizsgáltuk egy 2DG beépítése tanulmány . Az SC és a KD sejtek alatt normoxia, a 2DG beépülését szignifikánsan emelkedett a 2DG kezelés, összehasonlítva a kezeletlen sejteket. A 2DG beépítése tovább nőtt a kiegészítő inzulinkezelés mindkét sejtek (5A). Összehasonlítva a normoxia, hypoxia erősebben stimulálta a 2DG felvételét az SC sejtek, inzulinnal vagy anélkül (5B ábra). Hasonló eredményeket figyeltek meg a KD sejtek a hypoxia (5B). Értelmében azonban hipoxia, kevésbé 2DG beépítette a KD sejtekben, mint a SC sejtek, vagy anélkül a további inzulin kezelés (5B ábra). Annak megállapítására, a mechanizmus az inzulin-függő glükóz felvételét, a hártyás expresszióját GLUT1 elemeztük a KD sejtekben alatt normoxia és hypoxia. Alatt normoxia, a hártyás GLUT1 expresszió emelkedett a magas glükóz és /vagy inzulin kezelés képest, hogy kezelés nélkül (ábra 5C). Ehhez képest a megfigyelt alatt normoxia alatt hipoxia, a hártyás GLUT1 expresszió emelkedett minden kezelésben. Továbbá az expressziós növelte magas glükóz és /vagy inzulin kezelésre, szemben azzal a kezelés nélkül (ábra 5C). Különösen, a hártyás GLUT1 expresszió legerősebben nőtt magas glükóz és az inzulin (GI) kezelés a hipoxiás KD sejtek (ábra 5C). Másrészt, a kifejezés a másik GLUT család, GLUT3, halványan megfigyelhető a KD sejtekben, és ez a megállapítás nem változott ezek között a különböző kezelések (az adatokat nem mutatjuk be). Ebben a vizsgálatban, GLUT2 és GLUT4 nem expresszálódik a KD sejtekben.

HIF-1α knockdown plusz GI kezelés erősen elnyomta a növekedés a tumor xenograftok pucér egerekben

Végül meghatároztuk a in vivo katalógusa hatása GI kezelés KD és SC xenograftok. Ábra a 6A szemlélteti kísérleti tervezés a xenograft egérmodellben. Tíz nappal azután, hogy a szubkután beoltás SC vagy KD sejtek xenograftok növesztettük a hátán a csupasz egerekben. Ezen a ponton, a Western-blot-analízis megerősítette a HIF-1α expresszió a szubkután tumor, de nem a KD tumorok (6B). Ezt követően három gyógyszer, amely a PBS, glükóz vagy GI, intraperitoneálisan befecskendezett nude egerekben SC vagy KD tumor (naponta nap 1 nap 11). A reprezentatív képek a tumort hordozó egereket kezeltük PBS-sel (SC-PBS-ben és KD-PBS), glükóz (SC-glükózt és KD-glükóz) vagy GI (SC-GI és KD-GI) ábrán mutatjuk be 6C . A KD-glükóz és KD-GI daganatok tűnt, hogy kisebb, mint a többi daganat. Ábra 6D megmutatta a növekedési görbe a 6 daganatok. A méretek a KD-glükóz és KD-GI tumorok szignifikánsan kisebb, mint a KD-PBS tumor a 12. napon a KD-GI tumor volt a legkisebb. Másrészt, abban az SC egerekben, nem volt szignifikáns különbség a méret a SC-PBS, SC-glükózt és SC-GI daganatok (ábra 6D). Immunhisztokémiai elemzése hasított kaszpáz 3 végeztek, hogy felmérjék az apoptózis által indukált glükóz vagy GI kezelést. A pozitív kifejeződése hasad caspase3 ben gyakran megfigyelhető a KD-glükóz és KD-GI daganatok (ábra 6E). Azonban minden, a KD tumorok mutatott bizonyos fokú hasított kaszpáz-3 (ábra 6F). Ezzel ellentétben, nem volt szignifikáns különbség a kifejezés a hasított kaszpáz-3 között a SC-PBS, SC-glükózt és SC-GI daganatok. A KD daganatok, a pozitív expresszióját hasított caspase3 szignifikánsan magasabb volt a KD-PBS tumor, mint az SC-PBS daganat. Ezen kívül, a kifejezés a hasított caspase3 szignifikánsan magasabb volt a KD-glükózt vagy KD-GI daganatok, mint a KD-PBS daganat. A legmagasabb expressziós volt megfigyelhető a KD-GI tumor.

Discussion

A jelen vizsgálatban a HIF-1α knockdown sejteket alkalmaztunk annak vizsgálatára, hogy letális ROS-termelés indukálható alatt hypoxia. Az eredmények azt mutatták, hogy az apoptotikus sejthalál indukálódik KD sejtekben, de nem a kontroll SC sejtek alatt hypoxia. Ezzel párhuzamosan, a ROS felhalmozódott a leütést sejtvonal időtartamának megfelelően a hipoxia. Hipoxiával indukált sejthalál és a ROS akkumuláció is megfigyelhetők voltak a különböző HIF-1α knockdown 74-KD sejtekben, de nem a kontroll 74-SC sejtek. Sőt, a NAC kezelés csökkentette a hipoxia által indukált sejthalált a KD sejtekben. Ezek az eredmények azt mutatják, az esemény a hipoxia-indukált apoptózis miatti túlzott ROS akkumuláció KD sejtek és támogatott egy korábbi vizsgálatban, hogy a HIF-1α knockout MEFs meghalt miatt túlzott ROS-termelés [33].

ROS elsősorban keletkezik a mitokondrium az ETC [17, 19]. Leírták, hogy a mitokondriális ROS fokozott hipoxiás körülmények között [17, 19]. Ha hipoxia is fennáll, az indukció HIF-1α vezet adaptív mechanizmusok, hogy csökkentsék a ROS és helyreállítsa redox homeosztázis keresztül fokozza a releváns gének [19]. Mi tehát vizsgálni, hogy a HIF-1α knockdown érintett mRNS expresszióját tíz gének szabályozásában vesz részt a ROS-termelés mellett az oxigénhiány ( GLUT1 katalógusa, ALDOC katalógusa, PDK1 katalógusa, ldhA katalógusa és MCT4 katalógusa kapcsolatos Warburg hatás; BNIP3 katalógusa és BNIP3L katalógusa kapcsolatos mitophagy; LON katalógusa és COX4-2
kapcsolatos ETC és MnSOD katalógusa, a ROS dögevő). Az integrált elemzések Az RT-qPCR sorozat igazolta, hogy a hipoxia-indukált expressziója mind a tíz gének szignifikánsan csökkentette a KD sejtekben, jóllehet a normoxia, az mRNS expressziója LON és COX4-2 szignifikánsan magasabb volt a KD sejtekben, mint az SC sejtek. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a halálos felhalmozódása ROS alatt hipoxia a HIF-1α akciós sejtek lehetnek, mert több zavarok a ROS ellenőrzési mechanizmust. Ezért a rák terápia célozza HIF-1α hatékony lehet a hipoxiás belüli régió gyomorrák szövetet. Mechanizmusának serkentett mRNS expressziója LON és COX4-2 a KD sejtekben alatt normoxia nem lehetett tisztázni. Katalógusa

A fenti megállapítások azt feltételeztük, hogy a támogatása a glükóz felvételét felgyorsulhat hipoxia által indukált apoptózis további ROS termelés HIF-1α knockdown KD sejtekben. Ahogy várható volt, a GI kezelés fokozta a sejthalál hipoxiás KD sejtekben, ami együtt járt a megnövekedett ROS-termelés. A glükóz felvételét vizsgálatban az inzulin növelte a 2DG felvétel mind a SC és a KD sejtekben. Képest, hogy megfigyelt alatt normoxia, hipoxia növelte a 2DG felvételét az SC és a KD kezelt sejtek inzulinnal vagy anélkül. A felvétel nőtt erőteljesebben SC mint KD sejtekben, ami arra utal, a különbség miatt legyengített GLUT1 indukció a hipoxiás KD sejtekben. Másrészt, egy Western-blot analízis azt mutatta, hogy a hártyás GLUT1 expresszió fokozott magas glükóz és /vagy inzulin kezelések, mint a kontroll kezelést a normoxiás és hypoxiás KD sejtekben. Különösen GI kezelés leginkább nőtt a hártyás GLUT1 kifejezés hypoxiás KD sejtekben. Egy korábbi tanulmány számolt be, hogy az inzulin elősegíti a glükóz közlekedés serkenti a transzlokációját GLUT4 intracelluláris tárolási vezikulumok a plazma membrán a vázizom sejtekben vagy adipociták [36, 37].

• PLoS One: Copy Number nyeresége a 8q24 és 20q11-q13 gyomorrákban gyakoribbak bél típusú, mint a diffúz típusú
• PLoS One: A szérum HER2 potenciális helyettesítője Tissue HER2-státus gyomorrákban: rendszeres felülvizsgálatát és meta-analízis