PLoS ONE: Sirkulasjons denaturert XAF1 DNA Indikerer dårlig prognose for Gastric Cancer

Abstract

Bakgrunn

denaturert DNA i væsker kan være et egnet biomarkør for kreftpasienter. XAF1
har vist seg å være ofte nedregulert i human magekreft (GC). Her undersøkte vi om XAF1
metylering i GC kan være en nyttig biomarkør.

Metoder

Real-time RT-PCR ble brukt til å oppdage XAF1
mRNA uttrykk; immunhistokjemi og western blot ble brukt til å undersøke XAF1 protein uttrykk i GC vev (n = 202) og de tilhørende para kreft histologiske normalt vev (PCHNTs). Sanntids metylering spesifikk-PCR ble brukt til å undersøke XAF1
promoter metylering i samme panel av GC vev, deres PCHNTs og sera.

Resultater

Vi har bekreftet hyppig XAF1
ned-regulering i både mRNA og proteinnivåene i GC vev sammenlignet med normale kontroller og PCHNTs. XAF1
hypermethylation ble dokumentert i 83,2% (168/202) av GC vev og 27,2% (55/202) av PCHNTs, mens ingen metylering ble påvist i de 88 normale kontroller. Metyleringen nivå i GC vev var signifikant høyere enn i PCHNTs ( p <
0,05). Den hypermethylation av XAF1
signifikant korrelert med nedregulering av XAF1
i GC vev i både mRNA og proteinnivå ( p
< 0,001 hver). Videre, vi har oppdaget høy frekvens av XAF1
metylering (69,8%, 141 av 202) i sera DNA fra de samme pasientene, mens sera DNA fra 88 ikke-tumor kontroller var negative for XAF1
metylering. XAF1
metylering i både GC vev og i sera kan være en god biomarkør for diagnostisering av GC (AUC = 0,85 for vev og AUC = 0,91 for sera) og signifikant korrelert med dårligere prognose ( p
< 0,001). I tillegg, etter operasjonen negativ til positiv overgang fra XAF1
metylering i sera sterkt assosiert med tumor tilbakefall.

Konklusjoner

1) dysfunksjon av XAF1
er hyppig og er regulert gjennom XAF1
promoter hypermethylation; 2) Påvisning av sirkulerende metylert XAF1
DNA i serum kan være en nyttig biomarkør i diagnose, vurdere pasientens utfall (prognose og tilbakefall) for GC pasienter

Citation. Ling ZQ, Lv P Lu XX, Yu JL, Han J, Ying LS, et al. (2013) Sirkulasjons denaturert XAF1
DNA Indikerer dårlig prognose for magekreft. PLoS ONE 8 (6): e67195. doi: 10,1371 /journal.pone.0067195

Redaktør: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, USA

mottatt: 12 mars 2013; Godkjent: 16 mai 2013; Publisert: 27 juni 2013

Copyright: © 2013 Ling et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av en bevilgning fra Science and Technology Generelt Prosjekt i Zhejiang-provinsen (nr. 2009C33143), og dels ved en bevilgning fra Backbone talent av Zhejiang Provincial Medisin og Hygiene Platform programmer (nr. 2011RCA009). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er en av de vanligste kreftformene i Kina, med en høy forekomst og dødelighet, ca sto for 10% av alle kreftformer [1]. Gastric tumorigenesis er en komplisert, flertrinnsprosess som involverer endringer av mange gener [2]. Avvikende promoter metylering er en av de viktigste mekanismene for å slå noen tumorsuppressorgener og kreftrelaterte gener og spiller svært viktige roller i patogenesen og progresjon i humane kreftformer [3], [4] - [6], inkludert magekreft [7] , [8]. I mellomtiden, samler data sterkt antydet at DNA-metylering kan være nyttig og kraftig biomarkør i kreftrisiko evaluering [5], [7], tidlig diagnose [7], å forutsi pasientens prognose [7], [8], og evaluere følsomheten til cellegifter [9]. Vår nylig studie og andre forskere vist at detektere sirkulerende denaturert DNA i blod er en potent og praktisk metode for kreftpasienter [7], [10], [11].

X-bundet hemmer av apoptose ( XIAP
) -associated faktor 1 ( XAF1
) er en roman negativ regulator av XIAP
, som reverserer XIAP beskyttelse rolle på kreftceller [12] - [14]. Tapet av XAF1
uttrykk vil gjøre kreftceller resistens mot apoptose og fremme svulst celle overlevelse [14] - [17]. Dysfunksjon av XAF1
har blitt rapportert i flere kreft hos mennesker sannsynligvis gjennom arrangøren metylering [15] - [19], noe som tyder på dens betydning i tumorigenesis. I human magekreft, XAF1
har blitt rapportert å være ofte og betydelig nedregulert og dette nedregulering av XAF1
sannsynligvis gjennom DNA hypermethylation spesifikke CpG områder [15], [16 ], [18]. Men det er heller ikke rapportert om XAF1
metylering i blodet og dens potensiale som en biomarkør. I denne studien undersøkte vi XAF1
promoter metylering i parede vev og serumprøver fra et stort panel av pasienter med magekreft, og evaluert sirkulerende denaturert XAF1
som en potensiell biomarkør for magekreft .

Materiale og metode

Etikk erklæringen

De identifiserte menneskelige vevsprøver og sera ble oppnådd fra Zhejiang-provinsen menneskelig vev Specimen Bank. Bruken av prøvene ble godkjent av Institutional Review Board i Zhejiang-provinsen Cancer Hospital. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hver pasient i samsvar med kravene i vår institusjonens styre av etikk. 88 ikke-kreft frivillige ga skriftlig informert samtykke. En del av prøvene var fra Zhejiang-provinsen Folkets sykehus, og det første Folkets sykehus i Chunan County. The Institutional Review Board på medisinsk etikk i Zhejiang-provinsen Folkets sykehus, og det første Folkets sykehus i Chunan fylke godkjent metode for prøvetaking, inkludert skriftlig informert samtykke fra alle pasienter, henholdsvis.

vevsprøve

sammenkoblede tumor og para-kreft histologiske normalt vev (PCHNT) prøver~~POS=HEADCOMP ble samlet på tidspunktet for kirurgi fra 202 pasienter med primær adenokarsinom i ventrikkel i Zhejiang-provinsen Cancer Hospital, Zhejiang-provinsen Folkets sykehus, og det første Folkets sykehus i Chunan fylke fra januar 2008 til desember 2009. PCHNT ble vurdert mikroskopisk for nærvær av normale celler og fravær av dysplastiske celler. Ingen av disse tilfellene hadde gjennomgått noen medisinsk behandling før operasjonen. Demografiske, kliniske og histopatologiske parametre av disse tilfellene ble vist i tabell 1. vekstmønster av tumorceller ble bestemt i henhold til Ming klassifisering [20]. Alle rekrutterte pasientene hadde blitt fulgt opp med jevne mellomrom til forfall. Antrum slimhinnen snitt fra 88 ikke-kreft frivillige ved gastroskopi ble tilfeldig samlet som kontroller i samme periode, inkludert 54 menn og 34 kvinner, med en gjennomsnittsalder på 52,9 år. Blant disse frivillige, ble 48 pasienter diagnostisert med kronisk ikke-atrofisk gastritt. I mellomtiden var forbundet serumprøver samlet inn før kirurgi eller endoskopi.

Analyse av Helicobacter pylori ( H. Pylori
) Infeksjon

Biopsi ble innhentet fra alle pasienter som hadde endoskopisk undersøkelse . H
. pylori
status ble bestemt ved hurtig Urease test og Giemsa farging metoder [21], [22]. Det ble ansett som H
. pylori
smitte når begge testene var positive, og de prøver med én positiv ble ekskludert for statistisk analyse [22].

Real-time RT-PCR

mRNA uttrykk av XAF1
ble analysert ved real-time RT-PCR [23]. Totalt RNA ble ekstrahert ved hjelp av Trizol (Gibco). Totalt 3 ug totalt RNA ble underkastet revers transkripsjon ved bruk av M-MLV-revers transkriptase (Promega). Den glyseraldehyd fosfat dehydrogenase ( GAPDH
) ble valgt som intern referanse. Sekvensene til XAF1
primere var som følger: (F) 5'-TGGGTGTAGGATTCTCCAGG-3 ', (R) 5'- GGTTTGCCCAAG GACTACAA-3'. GAPDH
Primersekvensene var som følger: (F) 5'-CATGA GAAGTATGACAACAGCCT-3 ', (R) 5'-TAATTTTAGGTTAGAGGGTTATTGT- 3'. De 2 ^{-ΔΔCt metoden ble brukt til å beregne relative endringer i genuttrykk.}

immunhistokjemisk farging

uttrykk for XAF1 protein ble bestemt ved immunhistokjemisk analyse med XAF1 monoklonalt antistoff (Santa Cruz Biotechnology ). Immunhistokjemisk farging for XAF1 ble utført ved hjelp av representative parafininnstøpte prøvene fra de 202 GC pasienter. Etter deparaffinization, antigen gjenfinning i 0,01 M citratbuffer, og inaktivering av endogen peroksidase-aktivitet i 3% H _{2o 2 /metanol, inkubert vi lysbildene med antistoffer for XAF1 ved 4 ° C over natten, og immunhistokjemisk farging, etter en standard avidinbiotin-peroksydase kompleks teknikk, ble utført ved anvendelse av 3,3'-diaminobenzidin (DAB) som kromogen. Kjerner ble kontra med hematoksylin. Den immunhistokjemisk farging score (ISS) bestemmes av tre uavhengige patologer som kombinerer farging hyppigheten og intensiteten som følger [24], [25]: ingen farging er scoret som 0, 1~10% av celler farget scoret som en, 11~50% som to, 51~80% som 3, og 81~100% som 4. fargeintensitet er rangert på en skala fra 0 til 3, med 0, negativ; 1, svak; 2, moderat; og 3 = sterk. Når det er multifokal immunreaktivitet og det er betydelige forskjeller i fargingsintensitet mellom brennpunkter, var gjennomsnittet av minst intens og mest intense farging registrert. Rådataene ble omdannet til ISS ved å multiplisere frekvensen stillingen og fargingsintensitet. Teoretisk sett kan ISS variere fra 0 til 12. En ISS av 9~12 ble ansett sterke immunoreaktivitets, ble 5~8 vurderes som moderat, 1~4 ble ansett svak, og 0 ble scoret som negative. Delene der flekker ikke kan være godt karakteriseres ble ansett som usikre.}

Western Blot analyse

Paret tumor og PCHNT eksemplarer av 20 saker ble tilfeldig valgt fra 202 mage kreftpasienter for western blot analyse. Totalt protein ble ekstrahert og deretter kvantifisert ved hjelp av Lowry-metoden [26]. Western blot analyse ble utført ved hjelp av anti-XAF1 monoklonale antistoffer (Santa Cruz, California) i henhold til tidligere rapport [6]. β-tubulin ble servert som en intern kontroll.

DNA Extraction, Bisulfite Modifikasjon og Real-time Metylering Specific-PCR (MSP)

Serial 5 mm seksjoner som inneholdt karsinom og ikke-neoplastiske vevene ble montert på ikke-belagte glassplater og tørket ved 37 ° C over natten. Etter deparaffinization og farging med hematoxylin og eosin (H & E), samlet vi 5000 kjerner fra 5 til 10 seriesnitt med en 27G nål. De oppsamlede kjerner ble behandlet med 40 ml 200 mg /ml proteinase K (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ved 42 ° C i 72 timer. Den paramagnetiske perle teknologi (AxyPrep Mag Blood gDNA kit, Axygen Scientific, Inc., Union City, CA) ble benyttet for å isolere genomisk DNA fra friskt blod ifølge kit protokoll. Protokollen består av følgende trinn: lyse, binding, vasking, og eluering. Forurensninger fjernes i løpet av bindings og vasketrinn. Kvaliteten av DNA ble bestemt ved A260 /280-forhold på Nanodrop ND-1000 spektrofotometer (Nanodrop Technologies, Inc., Wilmington, DE), DNA-integritet ble undersøkt ved denaturerende agarosegel-elektroforese.

DNA ble modifisert etter natriumbisulfitt bruker EpiTect Bisulfite kit (Qiagen Inc.) etter manufactory instruksjoner. Modifiserte DNA ble analysert ved real-time MSP på ABI7500 PCR (ABI Co.) med SYBR Premiks Taq ExTaq Kit (Takara Co Ltd). XAF1
metylering og unmethylation spesifikke primere ble utformet som følger: XAF1 plakater (MF) 5'-TTTGTAAGAAACG AAATTTAATCGA-3 ', (MR) 5'CCTACCCTTAAAACCCACGAT-3'; XAF1 plakater (UF) 5'-TTTGTAAGAAATGAAATTTAATTGA-3 ', (UR) 5'-CTCCTACCCTTAAAACC CACAAT-3' [23]. Humant genomisk DNA (NEB) ble behandlet ved SSSI metyltransferase in vitro ble anvendt som en positiv kontroll. Et perifert blod-DNA fra en frisk person ble anvendt som en negativ kontroll. Prosentandelen av denaturert DNA i prøvene ble beregnet i henhold til de referanser som tidligere beskrevet [27], [28]. Metylert DNA-indeksen ble scoret i henhold til andelen av DNA metylering; 0, < 20%; 1, 20% -40%; 2, 40% -60%; 3, 60% -80%; og 4, > 80%. Indeksen score på 0 regnes som DNA unmethylation og scorer 1-4 ble ansett hypermethylated henholdsvis [7], [27]. Den 20% avskåret terskelen for DNA hypermethylation var basert på kontroll normal prøver og interne kvalitetskontroller oppnådd i sanntid MSP analyse.

Cell Culture and Drugs behandling

Menneske mage kreft cellelinjer (AGS og KATO-III) ble dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum, 100 U /mL penicillin og 100 U /mL streptomycin ved 37 ° C og 5% CO henholdsvis _{2,. Dyrkede celler ble behandlet med 5-aza-2'-deoksycytidin (5-Aza-CDR) (Sigma-Aldrich) ved en sluttkonsentrasjon på 1,0 pmol /L. Trichostatin A (TSA) (Sigma-Aldrich) ved en sluttkonsentrasjon på 20 ng /ml ble administrert følgende 5-Aza behandling eller alene i 24 timer. Celler ble oppsamlet og utsatt for DNA, RNA og proteinrensing og etterfølgende analyser.}

Statistical Analysis

SPSS 17,0 statistisk programvare ble tatt i bruk for dataanalyse. Telledata sammenligninger mellom grupper ble utsatt for χ
^{2 test og Fishers eksakte test. Overlevelsesanalyse ble computered ved hjelp av Kaplan-Meier-metoden og betydelige nivåer ble vurdert ved hjelp av log-rank test. En univariat analyse ved Cox-modellen regresjon ble brukt for å bestemme identifiserte prognostiske faktorer, og multivariat analyse med Cox regresjonsmodellen ble benyttet for å utforske kombinerte effekter. For alle statistiske analyser, p
verdier. ≪ 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikans}

Resultater

nedregulering av XAF1
i Primær Gastric svulster

for å undersøke XAF1
genekspresjon profil, undersøkte vi mRNA uttrykk for XAF1
i 88 ikke-kreft frivillige og 202 primær mage kreft vev og tilhørende PCHNTs. Som vist i figur 1A, XAF1
uttrykk ble betydelig redusert i magekreft prøvene sammenlignet med det i normale kontroller og PCHNTs ( p <
0,001). Men det var ingen signifikant forskjell i XAF1
uttrykk i PCHNTs sammenlignet med ikke-kreft kontroller.

Videre XAF1
uttrykk var betydelig lavere i avanserte svulster (stadium III /IV) enn i tidlig stadium svulster (stadium i /II) ( p <
0,0001, figur S1 A), og var betydelig lavere i dårlig differensierte svulster enn at i tillegg /moderat differensierte svulster ( p. <
0,0001, figur S1B)

For å sjekke XAF1 proteinnivået i magekreft vev, utførte vi immunhistokjemisk analyse i 202 mage kreft vev og tilhørende PCHNTs. Nuclear XAF1 uttrykk var konsekvent tilstede i normal mage epitel viser høye immunreaktive score. Den XAF1 protein uttrykk ble påvist i høye nivået i 97,5% (197/202) av PCHNTs (figur 1B). Men høy uttrykk for XAF1 protein ble bare påvist i 16,8% (34/202) av magekreft vev; Flertallet av magekreft vev var fraværende eller på et lavt nivå av XAF1 protein (figur 1C). De immunhistokjemiske funn er oppsummert i tabell 1. immunhistokjemisk farging score i mage kreft vev var betydelig lavere enn i PCHNTs eller i normale kontroller ( p <
0,0001, figur 1D). Tapet av XAF1 protein signifikant korrelert med H. pylori
infeksjon, tumor størrelse, histologisk differensiering, lymfatisk invasjon, venøs invasjon, invasiv dybde, lymfeknutemetastase, fjernmetastaser og klinisk stadium (tabell 1) (alle p <
0,05)
.

De immunhistokjemiske resultatene av 20 mage kreft vev ble ytterligere bekreftet ved hjelp av western blot analyse. De representative vestlige blotting resultater i to tilfeller ble vist i figur 1E. Den relative mengden av XAF1 proteinekspresjon ble normalisert til den β-tubulin av de samme prøvene. Den gjennomsnittlige XAF1 protein nivå i 20 mage kreft vev var betydelig lavere enn i PCHNTs ( p
< 0,05). (Figur 1F)

Arrangøren Hypermethylation av XAF1
i Primær Gastric Svulster

for å undersøke de molekylære mekanismer for XAF1
stillhet i mage kreft, vi brukt en real-time MSP teknologi for å studere DNA metylering status for XAF1
promoter. Hyppigheten av XAF1
hypermethylation i mage kreft vev, tilsvarende PCHNTs og ikke-kreft kontrollene var 83,2% (168/202), 24,8% (50/202) og 5,7% (5/88), henholdsvis. Den hypermethylation hyppigheten av XAF1
i kreft er betydelig høyere enn i PCHNTs og ikke-kreft-kontroller (alle p
< 0,0001, figur 2).

Av notatet den metylert status for XAF1
signifikant korrelert med noen klinisk-patologisk parametre i magekreft, som lymfeknutemetastase, T-stadium, H
. pylori
infeksjon, etc (alle p <
0,05, tabell 2). Ingen signifikant sammenheng mellom hypermethylation av XAF1 Hotell og kjønn, alder ved diagnose, svulststedet og fjernmetastaser ble dokumentert (alle p
> 0,05). (Tabell 2)

XAF1
Arrangøren Hypermethylation er assosiert med sine Transkripsjonell lyddemping i Gastric kreftceller

For å undersøke sammenhengen mellom XAF1
metylering og XAF1
uttrykk, vi sammenlignet XAF1
metylering nivå med XAF1
mRNA nivå og proteinnivåer bestemmes enten ved immunhistokjemisk analyse (figur 3A) eller western blotting (figur 3B) med Spearman korrelasjonsanalyse. Som vist i figur 3A-, XAF1 proteinekspresjon (bestemt ved immunohistokjemisk analyse) i 202 GC vev ble korrelert med XAF1
mRNA-nivå [lg (T /N)] (bestemt ved RT-PCR) ( γ
= 0,841, p <
0,0001). Mer viktig, XAF1
metylering nivået var signifikant assosiert med XAF1
mRNA nivå ( γ Anmeldelser = - 0,846, p <
0,0001) og XAF1 protein nivå ( γ
= -0,969, p <
0,0001). Lignende resultater ble oppnådd ved analyse av korrelasjonen av XAF1
promoter metylering og XAF1 proteinekspresjon bestemt ved western blot analyse (figur 3B). Disse resultatene sterkt tiltalt som XAF1
uttrykk er regulert av XAF1
promoter metylering.

5-Aza-CDR Administration Gjenoppretter Uttrykk for XAF1

for ytterligere å bekrefte epigenetisk regulering av XAF1
uttrykk, AGS og KATO-III celler ble behandlet med 5-Aza-CDR og /eller TSA. XAF1
mRNA uttrykk ble reaktivert i både mage kreft cellelinjer, ledsaget av demetylering av XAF1
promoter (figur 4), noe som indikerer at XAF1
er transcriptionally forstummet i disse cellene av DNA hypermethylation. Interessant, TSA behandling alene var effektivt for å gjenopprette XAF1
uttrykk i AGS og KATO-III uten vesentlig endring av XAF1
metylering nivå, noe som tyder på at histonmodifikasjonene kan også være involvert i regulering av XAF1
uttrykk. Imidlertid har ikke administrering av TSA følgende 5-Aza-CDR hadde en additiv effekt i å gjenopprette genuttrykk med en ytterligere nedgang i metylering nivået av XAF1
. Disse resultatene er i overensstemmelse med nyere studier som antydet at TSA kan ha en demetylering effekt i en gen-spesifikk måte [5]. Den vestlige blot analyse ved hjelp av AGS celler, som en modell, bekreftet oppregulering av XAF1 proteiner etter den 5-Aza-CDR og 5-Aza-CDR /TSA behandlinger (figur 4).

Påvisning av Sirkulasjons XAF1
metylering

Vi oppdaget høy frekvens av XAF1
metylering i grunnskolen magekreft (83,2%), noe som tyder på at det kan være en god biomarkør hvis XAF1
metylering kan påvises i serum. Derfor undersøkte vi XAF1
metylering i matchet serum DNA fra de 202 GC pasienter. XAF1
metylering ble oppdaget i 141 (69,8%) serum DNA fra de 202 mage kreftpasienter (figur 5). I kontrast, XAF1
metylering ble ikke påvist i serum DNA fra de 88 ikke-kreft kontroller.

Deretter fikk vi bekreftet konsistensen i XAF1
metylering mellom tumorvev og tilsvarende serum. I 168 tilfeller som viste XAF1
metylering i tumorvev, 141 vises XAF1
metylering i sin paret serum, noe som gir en konsistens på 83,9% mellom dem. Og i de 34 mage kreftpasienter uten XAF1
metylering i deres mage kreft vev, ingen metylering ble funnet i alle serum DNA (figur S2).

XAF1
Metylering som en biomarkør for diagnose av magekreft

for å vurdere verdien av XAF1
metylering som en biomarkør i diagnostisering GC, vi plottet mottaker drift karakteristikk (ROC) kurver og beregnet areal under kurven (AUC) verdier ved hjelp av DNA metylering data fra både GC vev og sera. Både ROC-analyser av XAF1
metylering i vev og sera viste signifikant diskriminerende kapasitet (figur 6); AUC-verdien av vev XAF1
metylering var 0,849 (95% konfidensintervall, 0,806 til 0,892; p
< 0,0001), AUC-verdien av serum AXF1
metylering var 0.909 (95% konfidensintervall, 0,875 til 0,942; p
< 0,0001).

i tillegg som XAF1
metylering status på mage kreft vev og sera signifikant korrelert med lymfeknutemetastaser, T-stadium, klinisk stadium, og andre klinisk-patologisk parametre (alle p <
0,05, tabell 2)

XAF1
Metylering. korrelert med prognose av magekreft pasienter

signifikant korrelasjon av XAF1
metylering med mange klinisk-patologisk parametre (Tabell 2) antydet at det kan assosiere med prognosen for mage kreftpasienter. Frem til forfall Oppfølging, 113 av 168 pasienter med XAF1
hypermethylation i mage kreft vev gikk rask sykdomsprogresjon eller død. Median sykdomsfri overlevelse (DFS) var bare 23,4 måneder. I motsetning til i de 34 pasienter uten XAF1
hypermethylation i deres mage kreft vev, bare 5 pasienter ble forverret, og median DFS var 39,6 måneder. Kaplan-Meier analyse viste at pasienter med XAF1
hypermethylation i deres mage kreft vev viste en tydelig dårligere overlevelse enn at uten XAF1
hypermethylation ( p <
0,0001) (Figur 7A). Tilsvarende Kaplan-Meier analyse viste at pasienter med positiv serum XAF1
metylering hadde signifikant lavere DFS enn i pasienter uten serum XAF1
metylering ( p
< 0,0001 ) (figur 7B), noe som indikerer at XAF1
promoter metylering i serum var et ugunstig prediktor for mage kreftpasienter.

Cox regresjonsanalyse viste at XAF1
metylering i sera er en uavhengig faktor på pasientenes overlevelse: pasienter med XAF1
metylering hadde dårligere prognose ( p <
0,0001, Hazard ratio, 5,710; 95% CI, 3.474~9.383). I tillegg kunne TNM etapper og alder på diagnose anses som påvirker faktor av prognose i magekreft, bare når effekten av XAF1
metylering ble eliminert. Videre sirkulerende metylert XAF1
i blodet hadde en større innvirkning på prognosen enn i TNM stadier (tabell S1).

Positiv Overgang av Sirkulasjons XAF1
Metylering Spår Tumor tilbakefall og dårlig prognose

Blant de 202 pasientene som ble evaluert for preoperativ sirkulerende XAF1
metylering, fikk 72 pasienter en oppfølgingsundersøkelse av sirkulerende XAF1
metylering 2~5 ganger i intervaller på 1~6 måneder etter operasjonen. Blant 12 gående pasienter, 10 pasienter viste negativ til positiv overgang i XAF1
metylering status i deres sera, de to andre viste alltid positivt for XAF1
metylering, noe som tyder på at oppfølging av XAF1
metylering i serum kan være en god markør for å forutsi tumorresidiv (tabell 3).

Diskusjoner

XAF1 product: ( XIAP
-associated faktor 1) er en roman XIAP
bindende protein som kan forstyrre kombinasjonen av XIAP
med caspases, opphever beskyttelsen på kreftceller og resultater i tumor celle apoptose [12] - [ ,,,0],14]. Den anti-apoptose funksjon av XIAP
er bestemt ved forholdet mellom ekspresjonsnivåer av XIAP
mot XAF1 product: [15]. Redusert uttrykk eller stillhet XAF1
er en hyppig hendelse i humane tumorer [16] - [19]. I den foreliggende undersøkelse har vi først bekreftet at XAF1
genekspresjon var signifikant nedregulert i både mRNA nivå og proteinnivå i et stort panel av primære magekreft vev, og det nedregulering av XAF1
uttrykk var signifikant assosiert med kreft etapper, metastaser og så videre, impliserer tap av XAF1
funksjon i tumor progresjon. Dette er konsistent med andre forskningsrapporter [17] - [19]. For å utforske de molekylære mekanismene som er ansvarlig for XAF1
stillhet, vi undersøkte XAF1
promoter metylering i et stort panel mage kreft vev ( n
= 202) og normale kontroller ( n
= 88) med en real-time MSP-teknologi. Vi oppdaget en høy frekvens (83,2%) av DNA hypermethylation av XAF1
i mage kreft vev. DNA hypermethylation av XAF1
betydelig korrelert med nedregulering av XAF1
både mRNA og proteinnivået i magekreft vev (figur 3). I tillegg 5-Aza-CDR behandling betydelig restaurert XAF1
uttrykk i XAF1
forstummet mage kreft cellelinjer (figur 4). Disse dataene antyder sterkt at hyppig nedregulering av XAF1
i magekreftceller er regulert av sin promoter hypermethylation. Interessant, behandling av mage-kreftceller med TSA, et histon deacetylase inhibitor også gjenopprettet XAF1
uttrykk, alene eller i kombinasjon med 5-Aza-CDR behandling, noe som indikerer at histon modifikasjon kan også være involvert i XAF1 <. br> regulering

DNA metylering kan anvendes som en potensiell svulst biomarkør i forskjellige humane cancere [3] - [11], [23]. Tilstedeværelsen av celle-fri DNA som sirkulerer i perifert blod er blitt beskrevet hos pasienter med ondartede prosesser, og aktiv frigjøring av tumor-DNA i sirkulasjon har blitt rapportert [29] - [31]. Tallrike undersøkelser har vist tumor-spesifikke endringer i sirkulerende DNA utvinnes fra plasma eller serum fra pasienter med forskjellige maligniteter som svarer til genetiske endringer er tilstede i primære tumorer, et funn som har potensial for molekylær diagnose og prognose [29] - [32]. Nukleinsyresekvensene markørene beskrevet i sirkulerende DNA'er omfatter onkogene mutasjoner, mikro endringer, genet rearrangementer og epigenetiske endringer, slik som avvikende promotor hypermethylation [7], [8], [30] - [34]. På bakgrunn av disse observasjonene, spesielt vi har oppdaget en høy frekvens av XAF1
DNA metylering i mage kreft vev (83,2%), bestemte vi oss for å undersøke muligheten for å bruke XAF1
promoter metylering i serum som en biomarkør i mage kreftpasienter. Først viste vi en flott konsistens i å oppdage XAF1
metylering mellom sera og primær mage kreft vev. Neste vi analyserte muligheten for å bruke sirkulerende metylert XAF1
som en diagnostisk markør ved hjelp av ROC analyse. AUC (arealet under kurven) på 0.909 demonstrerte en høy diagnostisk verdi detektere XAF1
metylering i serumprøver. Derfor våre data at påvisning av XAF1
metylering i sirkulerende DNA kan brukes som en ikke-invasiv biomarkør for diagnose av magekreft. I tillegg er våre resultater viste også at positiv XAF1
metylering i serum var en uavhengig prognostisk faktor; forutsi dårlig prognose. Mer interessant, overgang fra negativ til positiv sirkulerende XAF1
metylering etter operasjonen var signifikant assosiert med tumor tilbakefall. Disse data indikerer at påvisning av XAF1
metylering i sirkulerende serum DNA også kan være en tumor biomarkør for å forutsi mage kreftpasienter 'prognose og for overvåking av den tumorresidiv etter kirurgisk behandling. Fordi antall av pasientene gjennomgikk denne oppfølgingen serum undersøkelse var liten, er ytterligere forskning i et stort utvalg på pasientenes nummeret som er nødvendig for å bekrefte dette interessant funn og for å optimalisere strategi og protokoll for dette formålet. I alle fall sammenligner med de tradisjonelle måter, for eksempel gastroskopi undersøkelse for mage kreftpasienter, den mest bemerkelsesverdige karakteristisk for sirkulerende metylert XAF1
påvisning er effektiv, rask, rimelig, non-invasiv, ikke ødelegge miljøet, høy diagnostisk formbar rate og så videre, og som sådan demonstrere viktige applikasjons prospekter i fremtiden.

Konklusjoner

dysfunksjon av XAF1
er hyppig og er regulert gjennom XAF1
promoter hypermethylation i magekreft. Sirkulerende metylert XAF1
DNA ble assosiert med tumorbelastning og ondartet progresjon, noe som kan være en verdifull biomarkør for diagnostisering av magekreft, forutsi pasientens prognose og oppfølging av svulst tilbakefall etter kirurgi behandling.

Hjelpemiddel informasjon
Figur S1.
jpg. A, XAF1
genekspresjon Nivået var lavere i avansert magekreft (Stage III /IV) enn i begynnelsen av magekreft (fase I /II). B, XAF1
genekspresjon Nivået var lavere i dårlig differensiert magekreft enn i brønn /moderat (vel /Mod) differensiert magekreft, p <
0,05
doi:. 10,1371 /journal.pone.0067195.s001 product: (TIF)
Figur S2.
jpg. Korrelasjonsanalyse av XAF1
hypermethylation resultater mellom GC vev og paret perifert blod (serum)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0067195.s002 plakater (TIF)
Tabell S1.
xls. Multivariat overlevelse analyse av klinisk-patologiske data for 202 magekarsinom tilfeller.

• PLoS ONE: En ny underklassifikasjon av pt4 Gastric Kreft i henhold til bredden av serøse Invasion
• PLoS ONE: Janus Kinase 2 Polymorfisme er forbundet med risiko for pasienter med magekreft i en kinesisk Befolkning