Videobeelden bieden realtime inzicht in de kinetiek van virale assemblage

Structurele biologie heeft de structuur van virussen kunnen oplossen met een verbazingwekkende resolutie, tot elk atoom in elk eiwit. Maar we wisten nog steeds niet hoe die structuur zichzelf in elkaar zet. Onze techniek geeft het eerste inzicht in hoe virussen zich verzamelen en onthult de kinetiek en paden in kwantitatief detail."

Vinothan Manoharan, de Wagner Family Professor of Chemical Engineering en Professor of Physics aan de Harvard John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences

Manoharan is ook mededirecteur van het Quantitative Biology Initiative, een inspanning door Harvard die biologie samenbrengt, nieuwe meettechnieken, statistiek en wiskunde om causale, voorspellende wiskundige modellen van biologische systemen.

Manoharan en zijn team richtten zich op enkelstrengs RNA-virussen, het meest voorkomende type virus op aarde. In mensen, RNA-virussen zijn verantwoordelijk voor onder andere, West-Nijlkoorts, gastro-enteritis, hand, voet, en mondziekte, polio, en de gewone verkoudheid.

Deze virussen zijn meestal heel eenvoudig. Het virus dat Manoharan en zijn team bestudeerden, die E. coli-bacteriën infecteert, is ongeveer 30 nanometer in diameter en heeft één stuk RNA, met ongeveer 3600 nucleotiden, en 180 identieke eiwitten. De eiwitten rangschikken zichzelf in zeshoeken en vijfhoeken om een ​​voetbalachtige structuur rond het RNA te vormen, een capside genoemd.

Hoe die eiwitten erin slagen om die structuur te vormen, is de centrale vraag bij virusassemblage. Tot nu, niemand had de virale assemblage in realtime kunnen observeren omdat virussen en hun componenten erg klein zijn en hun interacties erg zwak zijn.

Om de virussen te observeren, de onderzoekers gebruikten een optische techniek die bekend staat als interferometrische verstrooiingsmicroscopie, waarbij het licht dat van een object wordt verstrooid, een donkere vlek creëert in een groter lichtveld. De techniek onthult niet de structuur van het virus, maar het onthult wel de grootte en hoe die grootte met de tijd verandert.

De onderzoekers hechtten virale RNA-strengen aan een substraat, als stelen van een bloem, en stroomde eiwitten over het oppervlak. Vervolgens, met behulp van de interferometrische microscoop, ze keken toe hoe donkere vlekken verschenen en steeds donkerder werden tot ze zo groot waren als volwassen virussen. Door de intensiteiten van die groeiplekken vast te leggen, de onderzoekers konden daadwerkelijk bepalen hoeveel eiwitten zich in de loop van de tijd aan elke RNA-streng hechtten.

"Een ding dat ons meteen opviel, is dat de intensiteit van alle vlekken laag begon en vervolgens omhoogschoot tot de intensiteit van een volledig virus, "Zei Manoharan. "Dat schieten gebeurde op verschillende tijdstippen. Sommige capsiden werden in minder dan een minuut geassembleerd, sommigen namen er twee of drie, en sommigen namen er meer dan vijf. Maar toen ze begonnen te monteren, ze kwamen niet terug. Ze groeiden en groeiden en toen waren ze klaar."

De onderzoekers vergeleken deze waarnemingen met eerdere resultaten van simulaties, die twee soorten assemblagepaden voorspelde. In één type traject, de eiwitten plakken eerst willekeurig aan het RNA en herschikken zich vervolgens in een capside. In de seconde, een kritische massa eiwitten, een kern genoemd, moet vormen voordat de capside kan groeien.

De experimentele resultaten kwamen overeen met de tweede route en sloten de eerste uit. De kern vormt zich op verschillende tijdstippen voor verschillende virussen, maar als dat eenmaal gebeurt, het virus groeit snel en stopt pas als het de juiste grootte heeft bereikt.

De onderzoekers merkten ook op dat de virussen vaker misassembleerden als er meer eiwitten over het substraat stroomden.

"Virussen die zich op deze manier verzamelen, moeten de vorming van kernen in evenwicht brengen met de groei van de capside. Als kernen te snel worden gevormd, volledige capsiden kunnen niet groeien. Die observatie kan ons enig inzicht geven in hoe we de assemblage van pathogene virussen kunnen laten ontsporen, ' zei Manoharan.

Hoe de individuele eiwitten samenkomen om de kern te vormen, is nog steeds een open vraag, maar nu experimentatoren de route hebben geïdentificeerd, onderzoekers kunnen nieuwe modellen ontwikkelen die de assemblage binnen dat pad onderzoeken. Die modellen kunnen ook nuttig zijn voor het ontwerpen van nanomaterialen die zichzelf assembleren.

"Dit is een goed voorbeeld van kwantitatieve biologie, in dat we experimentele resultaten hebben die kunnen worden beschreven door een wiskundig model, ' zei Manoharan.

• Veelvoorkomende genetische variant verklaart waarom immunotherapie vaak faalt bij de ziekte van Crohn
• GW-onderzoekers tonen verband tussen bacteriën in het microbioom en darmkanker