PLoS ONE: Laat-7 MicroRNA Familie wordt selectief uitgescheiden in de extracellulaire omgeving via exosomes in een Gemetastaseerde maagkanker cellijn

De abstracte

Achtergrond

exosomes spelen een belangrijke rol in de cel-cel communicatie, gericht op cellen over te dragen exosomaal moleculen zoals eiwitten, mRNA, en microRNAs (miRNAs) door een endocytosis- als route. miRNAs zijn kleine niet-coderende RNA-moleculen gemiddeld 22 nucleotiden lang is dat een groot aantal biologische processen, met inbegrip van kanker pathogenese te reguleren en bemiddelen gen neerwaartse regulatie door zich te richten mRNA RNA afbraak induceren en /of interfereren met de vertaling. Recente rapporten suggereren dat miRNAs stabiel kan worden gedetecteerd in circulerend plasma en serum sinds miRNAs worden verpakt door exosomes worden beschermd tegen RNA degradatie. Zo profileert exosomaal miRNAs hebben behoefte aan intercellulaire signalering verduidelijken en ontdek een nieuwe ziekte marker ook.

Methodologie /voornaamste bevindingen

exosomes werden uit gekweekte kanker cellijnen geïsoleerd en de kwaliteit ervan werd gevalideerd door analyse van transmissie-elektronenmicroscopie en western blotting. Eén van de geteste cellijnen, een uitgezaaide maagkanker cellijn, AZ-P7A, toonde de hoogste RNA opbrengst in de vrijgegeven exosomes en onderscheidende vorm in morfologie. Daarnaast werden RNA geïsoleerd uit cellen en kweekmedia en profielen van deze drie miRNA fracties werden verkregen via microarray analyse. Door het vergelijken van signaal intensiteiten van microarray data en de volgende validatie met behulp van RT-PCR-analyse, vonden we dat let-7 miRNA familie was overvloedig in zowel de intracellulaire en extracellulaire fracties uit AZ-P7A cellen, terwijl een lage metastatische AZ-521, de ouderlijke cel lijn van AZ-P7A, alsmede andere kankercellijnen toonden dergelijke neiging.

Conclusies /Belang

verrijking van let-7 miRNA familie in de extracellulaire fracties, in het bijzonder in de exosomes van AZ-P7A cellen kunnen hun oncogene kenmerken, zoals het ontstaan ​​van tumoren en metastase weerspiegelen. Sinds laat-7 miRNAs algemeen een tumor-onderdrukkende rol spelen als targeting oncogenen zoals RAS Kopen en HMGA2
, onze resultaten suggereren dat AZ-P7A cellen los laat-7 miRNAs via exosomes in de extracellulaire omgeving om hun oncogenese te behouden

Visum:. Ohshima K, K Inoue, Fujiwara A, Hatakeyama K, K Kanto, Watanabe Y, et al. (2010) Let-7 MicroRNA Familie wordt selectief uitgescheiden in de extracellulaire omgeving via exosomes in een Gemetastaseerde maagkanker cellijn. PLoS ONE 5 (10): e13247. doi: 10.1371 /journal.pone.0013247

Uitgever: Stefan Wölfl, Universität Heidelberg, Duitsland

Ontvangen: 14 april 2010; Aanvaard: 10 september 2010; Gepubliceerd: 8 oktober 2010

Copyright: © 2010 Ohshima et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Het werk werd gesteund door een subsidie ​​in samenwerking met innovatieve technologie en Advanced Research in Evolutional Area (CITY AREA) van het ministerie van Onderwijs, Cultuur, Sport, Wetenschap en Technologie van Japan. De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

De cellen scheiden verschillende soorten kleine membraanvesicles. Exosomes is een van de vesicles met 30-100 nm diameter en fysicochemisch onderscheiden van andere uitgescheiden vesicles [1]. Binnen exosomes, cellulaire genproducten zoals eiwitten, mRNA en microRNA's (miRNA's) zijn verpakt en deze moleculen kunnen worden overgedragen aan ontvangende cellen om hun moleculaire signalering leveren zoals oncogenese [2] - [4] en immuunrespons [1], [ ,,,0],5]. Exosomes loslaat verschillende celtypes [6] die tumorcellen, epitheelcellen en hematopoietische cellen zoals reticulocyten, cytotoxische T-lymfocyten, Epstein-Barr-virus getransformeerde B-cellen, mastcellen, dendritische cellen en bloedplaatjes bevatten. Uitgescheiden exosomes zijn geïsoleerd en gekarakteriseerd in vitro
uit gekweekte cellijnen [7] met In vivo
in lichaamsvloeistoffen [7] zoals bloed [8], urine [9], speeksel [10], vruchtwater [11], en maligne pleurale effusies [12]. Aangezien waargenomen in vele delende celtypen, is het denkbaar om tumorcellen verergeren, zoals blijkt uit hun uitbreiding in plasma en pleurale effusies van patiënten met kanker [8], [12]. Deze uitbreiding in non-invasieve lichaamsvloeistoffen kankerpatiënten versneld naar het profiel moleculaire componenten in exosomes voor het ontdekken van klinisch bruikbare tumormarkers Merkers [3], [7], [13].

miRNAs een klasse van kleine niet-coderende RNA's die zijn betrokken bij post-translationele regulatie van genexpressie door remming van zowel de stabiliteit en translatie van mRNAs [14]. Recent onderzoek heeft uitgewezen dat miRNA mutaties of misexpression correleren met verschillende menselijke kankers en merken sommige miRNAs kan functioneren als oncogenen of tumor suppressors [15], [16]. Om RNAs analyseren, is het altijd om de stabiliteit tegen afbraak door RNase overwegen. Recente bevindingen geven aan dat endogeen plasma miRNAs in bloedstalen stabiel detecteerbaar in een vorm die bestand is tegen RNase-activiteit [17], blijkt uit de identificatie van miRNAs in lichaamsvloeistoffen zoals bloed [17] - [24], urine [25], en speeksel [10], [26].

Gekweekte kankercellen zijn gebruikt om naar tumormarkers. Met name heeft het identificeren eiwitten en peptiden uitgescheiden in de kweekmedia ontwikkeld door proteomics-aanpak [27], [28]. Voor moleculaire handtekening in het exosomes zijn proteomics en transcriptomics analyses uitgevoerd om tumorvorming te tonen en te identificeren tumormarker kandidaten [2] - [4], [7], [29]. Hier te identificeren miRNA verband met tumorigenese en metastase, voerden we uitgebreide miRNA analyse in drie cellulaire fracties waaronder cellen, exosomes en medium van gekweekte cellen. Rangschikking gegevens van deze intracellulaire en extracellulaire miRNAs verkregen door microarray analyse vonden we dat let-7 miRNA familie is rijk aan alle fracties AZ-P7A cellen, uitgezaaide maagkanker cellijn, die homogeen en gecondenseerde morfologie produceert en hoge recovery snelheid van exosomaal miRNAs. Deze bevindingen waren onderscheiden van andere cellijnen zoals longkanker cellijnen (SBC-3, NCI-H69, en DMS53), colorectale kankercellijnen (SW480 en SW620) en AZ-521, de ouderlijke cellijn van AZ-P7A. Gezien het feit dat laat-7 miRNA familie functioneert vooral als tumor suppressor genen [30] om oncogenen zoals Target RAS Kopen en hoge mobiliteit groep A2 ( HMGA2
) [31], stellen wij voor dat AZ -P7a cellen selectief afscheiden laat-7 miRNAs in de extracellulaire omgeving via exosomes hun tumorigene en metastatische neigingen te handhaven.

Resultaten

Isolatie van exosomes uit verschillende kanker cellijnen

exosomes worden geproduceerd binnenste cellen aan de extracellulaire omgeving via een exocytose-like pathway [1]. Naast lichaamsvloeistoffen zoals serum en plasma uit perifeer bloed [7], [8], exosomes worden gevonden in het medium van gekweekte cellen [7], vergemakkelijkt de identificatie van exosomaal moleculen zoals eiwitten, mRNA, en miRNAs voor het streven naar hun klinisch gebruik. Profilering dergelijke exosomaal moleculen geproduceerd in gekweekte kankercellen hebben geleid tot een nieuwe kandidaat marker en antigeen ontdekken voor kanker diagnose en immunotherapie [7]. In deze studie, het doel van het profileren exosomaal miRNAs, we eerst geïsoleerd exosomes uit kweekmedia van 46 kankercellijnen bij verschillende weefselsoorten, die 8 bij maag-, 16 long-, 5 voor colon, 9 voor pancreas, 3 voor prostate omvatten , en 5 voor borstkanker. Nadat de cellen werden gedurende 48 uur werden exosomes verzameld met een combinatie van opeenvolgende centrifugatie en het molecuulgewicht cut-off membranen zoals beschreven in Materialen en Werkwijzen. De zuiverheid van exosomaal fracties werd bepaald door analyse van transmissie-elektronenmicroscopie en western blotting. Transmissie elektronenmicroscopie toonde rondvormige vesiculaire membraanstructuren ongeveer in de grootte van 100 nm in diameter. Tussen drie cellijnen, SBC-3, AZ-521 en AZ-P7A, is het van belang dat de morfologie AZ-P7A cellen was homogeen en gecondenseerd dan andere cellen (Figuur 1A). Immuno microscopie toonde dat de extracellulaire deeltjes geïsoleerd uit het kweekmedium van AZ-P7A cellen had immunoreactiviteit met antilichaam tegen CD63, een van de exosomaal membraaneiwitten, de capsulaire membranen (Figuur 1B). De aanwezigheid van bekende exosomaal eiwitten zoals CD29 /β1-integrine, AIP1 /Alix en tumor gevoeligheid gen 101 (Tsg101) werd bevestigd door Western blot analyse, terwijl een eiwit gelokaliseerd endoplasmatisch reticulum BiP /GRP78, niet detecteerbaar (Figuur 1C). Dit resultaat geeft aan dat de verontreiniging van materiaal afkomstig van andere cellulaire compartimenten in de exosomaal fracties was minimaal. De opbrengst aan exosomaal eiwitten AZ-P7A-cellen was 10 maal hoger dan die AZ-521-cellen; -2,5 Mg eiwitten werden verkregen van 1 × 10 ^{8 AZ-P7A cellen.}

Verrijking van exosomaal RNA's afgeleid van AZ-P7A cellen

Na isolatie, exosomaal totale RNA's werden geïsoleerd uit 46 gekweekte cellijnen. Interessant is dat de RNA opbrengst van AZ-P7A cellen waren veel hoger dan die van andere cellen (Figuur 2A). De verdeling lengte toonde de aanwezigheid van grote hoeveelheden kleine RNAs in exosomes (midden figuur 2B). Opgemerkt zij dat er een significant verschil in totale exosomes en exosomaal miRNA niveaus tussen patiënten met longadenocarcinoom en controles [8]. AZ-P7A cellijn werd opgericht door herhaalde enting van de ouderlijke AZ-521 cellen in muizen, resulteerden in een hoge peritoneale-metastatische potentieel [32], [33]. Aldus kunnen de hoge opbrengsten van zowel RNA als eiwit met de morfologische kenmerken AZ-P7A cellen worden toegeschreven aan de hoge tumorigene en metastatische neigingen. Omdat miRNAs zijn in celvrije lichaamsvloeistoffen gedetecteerd [17] - [20], voerden we ook directe isolatie van totaal RNA uit kweekmedium zonder procedure voor het isoleren exosomes. De bedragen van de totale RNA's van de cultuur media waren over het algemeen groter zijn dan die van exosomes (Figuur 2A). RNA distributie lengte bleek dat miRNA fracties in het bereik werden gedetecteerd 10-40 nucleotiden lengte RNA bereid uit kweekmedium (rechter paneel) en exosomes (midden) AZ-P7A cellen (Figuur 2B). Volgens het protocol van de fabrikant voor Bioanalyzer, met pieken van meer dan 40 nucleotiden lengte bevatten andere kleine RNAs zoals tRNAs in 70~90, 5S ribosomale RNA bij 100 en 5.8S ribosomaal RNA 150, zoals waargenomen in de intracellulaire fractie (linker paneel) . Deze resultaten suggereren dat miRNAs kunnen bestaan ​​in het kweekmedium buiten exosomaal fractie hoewel RNAs worden verondersteld te worden beschermd tegen RNases als zijnde verpakt in exosomes. In het bijzonder in vergelijking met hechtende cellen, de toename van de RNA opbrengst was opvallend groter drijvende cellen (NCI-H69 en Lu-135) of cellen met mix populaties drijvende en hechtende cellen (Colo205), die kan worden weerspiegeld door verontreiniging van RNA werpen uit gelyseerde cellen die permanent hebben verlaten in de cultuur media.

miRNA profilering door middel van microarray-analyse

miRNA profielen in de intracellulaire en extracellulaire fracties werden bepaald door middel van microarray-analyse voor zeven kanker cellijnen met inbegrip van AZ- 521, AZ-P7A, SBC-3, NCI-H69, DMS53, SW480 en SW620. Monsters van cultuur media evenals exosomes voorzien hybridisatiesignalen (figuur 3), met vermelding van het bestaan ​​van miRNAs in deze monsters. Tot op heden, analyseren microarray gegevens miRNA tussen monsters hebben geen duidelijke werkwijzen Bij normalisatie van signaalintensiteit, aangezien het moeilijk is een geschikt intern standaardmateriaal [34] vinden. Zo hebben miRNA microarray data in het algemeen geanalyseerd zonder normalisering geweest, in de veronderstelling dat het totale bedrag van de input RNA's zijn constant onder de monsters [34], [35]. In deze studie, na middeling miRNA microarray data tussen twee duplo, we miRNAs volgorde volgens hun signaalintensiteiten. We vonden dat let-7 miRNA gezin, zoals laat-7a, laat-7b, laat-7c, laat-7d, laat-7e, laat-7F, laat-7 g, en laat-7i werden gedetecteerd met een relatief hoge signalen gedurende het grootste deel van de intracellulaire fracties uit de zeven cellijnen (tabel 1, figuur 3). Echter, weinig of geen signaal intensiteiten voor let-7 miRNAs werden gedetecteerd in de extracellulaire fracties behalve zowel extracellulaire fracties AZ-P7A cellen en kweekmedium fractie uit NCI-H69-cellen (Tabel 1, Figuur 3). In het bijzonder, in zowel de extracellulaire fracties van AZ-P7A cellen, alle acht laat-7 miRNAs werden gedetecteerd, hoewel de rang van laat-7 g lager dan andere zeven laat-7 miRNAs was. Op basis van de verschillende patronen van let-7 miRNA niveaus tussen de drie cellulaire fracties, verdeelden we de zeven cellijnen in drie groepen (figuur 3) als volgt; (1) AZ-P7A, cellen die verhuurd 7 miRNAs werden gevonden in alle drie de fracties, (2) AZ-521 samen met SBC-3, DMS53, SW480 en SW620, cellen die verhuurd 7 miRNAs waren over het algemeen gevonden in alleen intracellulaire fracties, (3) NCI-H69 cellen die verhuurde 7 miRNAs werden gevonden in het intracellulaire fracties en in het kweekmedium enigszins.

RT-PCR analyse van intracellulaire en extracellulaire let- 7 miRNA familie

We vervolgens uitgevoerd kwantitatieve RT-PCR voor de acht let-7 miRNA familie naar de microarray gegevens te valideren. let-7 miRNAs werden gemakkelijk gedetecteerd in de intracellulaire en extracellulaire fracties AZ-P7A cellen (Figuur 4A) en AZ-521-cellen (Figuur 4B). De niveaus van laat-7 miRNAs per ingang RNA's waren over het algemeen hoger in de extracellulaire fracties uit AZ-P7A cellen dan van AZ-521 cellen. Voor het normaliseren van de niveaus van doelwit miRNAs verkregen door RT-PCR, is U6 snRNA wordt algemeen gebruikt als een interne controle. We observeerden de aanwezigheid van U6 snRNA in alle drie fracties AZ-P7A cellen en AZ-521-cellen (Figuur 4C) en daarna werden de concentraties van let-7 miRNAs tussen de overeenkomstige fracties uit deze twee cellijnen. Na normalisatie, het niveau van de laat-7 miRNAs inclusief laat-7a, laat-7b, laat-7c, laat-7d, laat-7e, en laat-7i in zowel de fracties van exosomes en cultuur media van AZ-521 cellen verlaagd in vergelijking met de AZ-P7A cellen. Daarentegen was er geen groot verschil in de niveaus van het intracellulaire let-7 miRNAs. We naast opzichte van het niveau van exosomaal laat-7a van AZ-P7A cellen met die van andere kanker cellijnen waaronder SBC-3, NCI-H69, DMS53, SW480 en SW620, en vond dat de laat-7a niveau alleen uit SW620 cellen was relatief dicht (0,7 keer) om het niveau van AZ-P7A cellen (Figuur 4E). Hierbij moet worden opgemerkt dat de intracellulaire niveau van de laat-7a van SW620 cellen was ongeveer 3,5 maal overvloediger dan die van AZ-P7A cellen. Op basis van deze resultaten, veronderstelden dat we lokalisatie van let-7a in de fracties van cellen en exosomes (figuur 5), en nader onderzocht. Genormaliseerd door het U6 niveaus, berekenden we relatieve niveaus van laat-7a verpakt in exosomes per de niveaus van cellulaire laat-7a (Figuur 4F). Dientengevolge is de hoeveelheid exosomaal laat-7a veel groter in AZ-P7A cellen dan zes andere cellen, wat suggereert dat AZ-P7A cellen selectief en actief zijn uitgescheiden let-7 miRNA familie in de extracellulaire omgeving via exosomes.

Discussie

In de huidige studie hebben we aangetoond dat let-7 miRNA familie werd afgescheiden in de extracellulaire omgeving via exosomaal vervoer, die specifiek zijn voor een uitgezaaide maagkanker cellijn, AZ-P7A was. let-7 miRNA familie in menselijke bestaat uit 10 sequenties van 13 voorlopers [30]. In het algemeen laat-7 miRNAs fungeren als een tumor suppressor door zich te richten oncogenen zoals RAS Kopen en HMGA2
en laat-7 miRNAs zijn downregulated in vele soorten kanker van vaste organen [31]. AZ-P7A cellen beschikken over een uitgezaaide vermogen met peritoneale verspreiding in naakt muizen [32], [33]. Zo stellen wij voor dat de exosomaal release van laat-7 miRNAs in de extracellulaire milieu leidt tot afname van de anti-tumorigene effect in de cellen, die leiden tot hun oncogenese en invasiviteit handhaven. Anderzijds, laat-7 miRNAs minder vaak een oncogene functie, door toename van expressie door hypomethylatie de let-7 locus [36] of gericht caspase-3 mRNA [37] spelen. In dit geval kan de exosomaal afgifte van let-7 miRNAs transformatie in doelcellen veroorzaakt door de overdracht van de oncogene eigenschappen.

Bij patiënten met longkanker, de totale niveaus van exosomen en de miRNAs toenemen in vergelijking met controles [8 ]. Het is aangetoond dat tumor induceren exosomes immune escape mechanisme kanker door spontane T cel apoptose [38] - [40]. In deze studie hebben we aangetoond homogene morfologie en verrijking van RNA in exosomes uitgezaaide AZ-P7A cellen. Dit kan tot uiting komen in hun tumorigeniciteit.

miRNAs een hoge stabiliteit in bloedplasma en serum aangezien beschermd tegen RNases [17]. Aldus maakt miRNA niveaus onderzocht op klinische diagnose tumor markers Merkers. Hoe komt het? Chin et al. zijn twee hypotheses naar de bron van miRNAs op circulerende bloedmonsters gesuggereerd; Het kan worden veroorzaakt door een resultaat van tumorceldood en lyseert of release door tumorcellen in de extracellulaire micro-omgeving van bloedvaten [19]. In tegenstelling tot hechtende cellen namen wij waar dat de totale hoeveelheid RNA in kweekmedia relatief hoger dan in exosomes voor cellen met drijvende objecten zoals NCI-H69, Lu-135, en Colo205. Deze toename waarschijnlijk resulteerde in de verontreiniging van RNA's van dode cellen in de cultuur media.

Voor de ontdekking van nieuwe bloed tumormarkers en biomarkers, omics benaderingen met inbegrip van proteomics en transcriptomics worden uitgevoerd, hetzij door directe analyse van bloedmonsters of de toepassing van profilering in weefselmonsters. Er zijn tegenstrijdige berichten als de vraag of de profielen van miRNA en mRNA in de bloedbaan zijn parallel aan het profiel van de tumor. De ondertekening van exosomaal miRNAs weerspiegelt dat van de oorsprong tumorcellen bij patiënten met longadenocarcinoom [8] en borstkanker [41]. Anderzijds, Skog et al. hebben aangetoond dat microarray analyse op mRNA verkregen uit glioblastoma cellen en de bijbehorende exosomes geopenbaard mRNA uitsluitend gedetecteerd in microvesikels, speculeren dat mRNA's gelokaliseerd op een specifiek gebied van cytoplasma [3]. Bovendien, Tanaka et al. hebben aangetoond dat het niveau van miR-92a in het bloedplasma van acute leukemie patiënten afgenomen terwijl de sterke expressie werd gevonden in de weefselmonsters [24]. Onze resultaten op selectieve verrijking van laat-7 miRNA familie in AZ-P7A cellen afgeleide exosomes fit met laatstgenoemde geval. Tenzij doelmoleculen miRNAs afgeleid van circulerende tumorcellen, suggereert zorgvuldig onderzoek nodig miRNA profielen weefselmonsters gebruiken voor detectie in serum of plasmamonsters.

Omdat exosomes worden geproduceerd in hematopoietische cellen en epitheelcellen , bloedcirculatie bevat exosomes afgeleid van beide type cellen. In het algemeen, exosomaal profielen van eiwitten, mRNA en miRNAs onderzoeken serum en plasma, exosomes afgeleid van tumoren epitheliale kenmerken worden gescheiden van die van hematopoëtische cellen [8], [13]. Dit wordt uitgevoerd met affiniteitszuivering met antilichamen tegen moleculen zoals die EpCAM tot expressie op het oppervlak van epitheelcellen. Onze bevindingen dat er werd een vergelijkbaar niveau van laat-7 miRNA familie tussen exosomes en cultuur media van AZ-P7A cellen suggereren dat deze miRNA niveaus kunnen worden gemeten zonder het isoleren exosomes uit klinische monsters zoals serum en plasma.

In Kortom, deze studie toonde aan dat let-7 miRNA familie is rijk aan exosomes van een uitgezaaide maagkanker cellijn, AZ-P7A cellen. Sinds laat-7 miRNAs betrokken zijn bij proliferatie proces [31], hun exosomaal afscheiding kan een belangrijke rol spelen bij het ontstaan ​​van tumoren en metastase.

Materialen en methoden

Cell cultuur

menselijke maagkanker cellijnen (AZ-521, MKN45, KATOIII en NUGC-3), menselijke longkanker cellijnen (SBC-3, Lu-65, Lu-135, en KNS-62) en humane pancreatische kankercellen ( suit-2) werden gekocht van de Japanse Inzameling van Research Bioresources. Menselijke maag kankercellen (SNU-1), de menselijke longkanker cellijnen (DMS-53, DMS114, NCI-H69, A549, NCI-H1299, NCI-H1155, NCI-H520, NCI-H1560, SK-MES-1, en HCC827), humane cellen mesothelioom (MSTO-H211), humane colorectale kankercellijnen (SW480, SW620, Colo205, LoVo en HCT116, humane pancreatische kankercellijnen (BxPC-3, AsPC-1, Panc-1, MIAPaca- 2, HPAF-II, PL45 en Capan-2), menselijke prostaatkanker cellijnen (PC-3, SU145 en LNCaP) en humane borstkanker cellijnen (T-47D, MCF7, SK-BR-3, BT -474 en MDA-MB-231) werden gekocht bij American Type Culture Collection. MKN28 (menselijke maagkanker cellen) en PSN-1 (humane pancreatische kankercellen) werden gekocht bij Immuno-Biological Laboratories en Europese Collection of Cell Culture, respectievelijk . Human maagkanker cellijnen, AZ-P7A [32], [33] en MKN45P [42] waren geschenk van Drs. Yutaka Yonemura en Yoshio Endo. Bij AZ-521 en AZ-P7A cellen, werden er geen RT-PCR-producten waargenomen voor 14 retrovirussen zoals HPV16, EBV, CMV, SV40, HBV, HCV, BKV, JCV, HHV7, HTLV1, HTLV2, HIV1, HIV2, en ADV type 1 (gegevens niet getoond) zonder infectie door deze retrovirussen in beide cellijnen . De cellen werden gehandhaafd in RPMI-1640 medium (Sigma-Aldrich) aangevuld met 10% door warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (Invitrogen), 100 U /ml penicilline en 0,1 mg /ml streptomycine.

Productie en isolatie van exosomes

hechtende cellen werden gezaaid tot 150 mm-gerechten in geschikte aantal cellen variërend van 3 x 10 ^{6-1 x 10 7 cellen per gerecht, terwijl de drijvende cellen werden geënt in 75 cm 2-kolf bij 2~2.5 x 10 7 cellen per fles. Cellen werden gekweekt in compleet RPMI-1640 medium van 25 ml en 50 ml voor gerechten en flacons, respectievelijk voor 24 uur bij 37 ° C en 5% CO _{2, tweemaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) gewassen, en geïncubeerd 48 h in fenolrood-vrij RPMI-1640 medium (Sigma-Aldrich) met 10% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum die eerder uitgeput contaminerende microvesicles door overnacht centrifugeren bij 100.000 x g. Exosomes werden geïsoleerd door gehele cellen variëren van 6 x 10 7-3 x 10 8 cellen zoals eerder beschreven [29]. In het kort werd het kweekmedium verzameld en gecentrifugeerd bij 800 x g gedurende 5 minuten en aanvullende 2000 xg gedurende 10 min opgeheven cellen te verwijderen. Het supernatant werd onderworpen aan filtratie over een 0,1 urn poriegrootte polyethersulfon membraanfilter (Corning) celresten en grote blaasjes, gevolgd door concentreren cut-off membraan (Centriplus-70, Millipore) verwijderen door een Mw 100.000. Het volume supernatant werd verminderd van ongeveer 250-500 ml tot ongeveer 30 ml. Het supernatant werd vervolgens ultracentrifuge bij 100.000 xg gedurende 1 uur bij 4 ° C met behulp 70Ti rotor (Beckman Coulter). De verkregen pellets werden opnieuw gesuspendeerd in 6 ml PBS en ultracentrifuge bij 100.000 xg gedurende 1 uur bij 4 ° C met behulp 100Ti rotor (Beckman Coulter).}}

Transmissie elektronenmicroscopie

De gepelleteerde exosomes werden gemengd gelijke hoeveelheden vers bereide 2% glutaaraldehyde in PBS, overnacht geïncubeerd bij 4 ° C gefixeerd met 1% osmiumtetroxide in PBS bij 4 ° C gedurende 2 uur, en gedehydrateerd in een gegradeerde reeks van ethanol. Na dehydratatie werden de monsters overgebracht naar propyleenoxide en ingebed in epoxyhars Quetol 812 (Nisshin EM). Ultradunne secties werden gesneden met Ultracut UCT (LEICA), gekleurd met uranyl acetaat en lood citraat en waargenomen met de JEM-1230 elektronenmicroscoop (JEOL). Immuno microscopische analyse werd uitgevoerd volgens de werkwijze beschreven door Xiao et al methode. [43] met kleine aanpassingen. In het kort werden exosomes gemengd en geïncubeerd met muizen anti-humaan CD63 monoklonaal antilichaam (catalogus nr. SC-51662, Santa Cruz) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Het monster werd op het membraan gedruppeld oppervlak van een koperen maas (collodion /koolstof beklede 400 mesh, Nisshin EM) en gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Na wassen met PBS, immunogoud geconjugeerd geit anti-muis IgG (catalogus nr. EM.GMHL15, BBInternational) verdund tot 01:20 werd op het membraan gedruppeld. De koperen mesh werd gedreven in de druppeltjes met membraanoppervlak onaangedaan tegenover bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Na wassen met PBS werd uranylacetaat druppels op de koperen maas oppervlak gebracht en gekleurd bij kamertemperatuur gedurende 30 s. Exosomes met zwarte colloïdale gouddeeltjes op de capsulaire membranen werden aangeduid als positief onder de elektronenmicroscoop.

Western blotanalyse

Cells and exosomaal fracties werden gewassen, opnieuw gesuspendeerd in een lysisbuffer [7,5 M ureum (Sigma-Aldrich), 2,5 M thioureum (Sigma-Aldrich), 12,5% glycerol (Wako), 50 mM Tris, 2,5% n-octyl-bèta-D-glucoside (Sigma-Aldrich), 6,25 mM Tris (2- carboxyethyl) fosfine hydrochloride (Sigma-Aldrich), 1,25 mM proteaseremmer (catalogusnr. P2714, Sigma-Aldrich)], en gedurende 1 uur bij 4 ° C met behulp van de rotator RT-50 (Taitec). Na centrifugatie bij 14.000 xg gedurende 60 min bij 4 ° C werd het supernatant verzameld en de eiwitconcentratie werd bepaald met de Bradford Protein Assay Kit (Bio-Rad). Een gedeelte van eiwitten (10 ug) werden gedenatureerd door koken in Laemmli monsterbuffer uitgevoerd op 10% SDS-polyacrylamidegels en overgebracht naar Immobilon-P PVDF-membranen (0,45 urn poriegrootte, Millipore). De blots werden geblokkeerd gedurende 1 uur met 5% vetvrije droge melk in Tris-gebufferde zoutoplossing die Tween 20 (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl en 0,01% Tween 20). Na het blokkeren werden de membranen geïncubeerd met elk primair antilichaam of antiserum waaronder konijnen anti-Tsg101 serum (catalogus nr. T5951, Sigma-Aldrich), geit anti-AIP1 /Alix serum (catalogus nr. SC-49268, Santa Cruz), muizen monoklonaal anti-CD29 /β1-integrine (catalogus nr. SC-610.468, BD Biosciences) en muizen monoklonaal anti-Bip /GRP78 (catalogus nr. 610.979, BD Biosciences) bij een verdunning 1:200 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. De blots werden vervolgens geïncubeerd met de corresponderende anti-IgG secundair antilichaam geconjugeerd met mierikswortelperoxidase (Jackson Laboratories) bij een verdunning 1:2,000 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Specifieke eiwitten werden gevisualiseerd met behulp van het ECL-systeem (GE Healthcare) en de FUJIFILM Lichtgevende Image Analyzer LAS3000 (Fuji Film). Het eiwit molecuulgewicht werd afgeleid met behulp van de Precision Plus Protein standaarden (Bio-Rad Laboratories).

RNA isolatie

Voor RNA-isolatie uit kweekmedium werden cellen gezaaid zoals hierboven beschreven. 48 uur na gekweekt, kweekmedium werd verzameld en gecentrifugeerd bij 800 x g gedurende 5 minuten en aanvullende 2000 xg gedurende 10 min. Het supernatant werd onderworpen aan filtratie over een 0,22 urn poriegrootte polyethersulfon membraanfilter (Corning), gevolgd door concentratie met een 5000 MW cut-off membraan (Centricon Plus-70, Millipore). Het eindvolume van supernatant ongeveer 10-20 ml van het oorspronkelijke volume van 250-500 ml. Het supernatant werd gemengd met een gelijk volume van QIAzol Lysis Reagent (Qiagen) en volgde de hieronder beschreven procedure voor RNA-isolatie. Totaal RNA werd geïsoleerd uit cellen, exosomes of kweekmedia met de miRNeasy Mini Kit (Qiagen) volgens de instructies van de fabrikant. Genomisch DNA te verwijderen, 40 ug cellulair totaal RNA werd geïncubeerd met 40 eenheden van RQ1 RNase-vrij DNase (Promega) bij 37 ° C gedurende 30 min in aanwezigheid van 40 eenheden RNasin Plus RNase Inhibitor (Promega). Voor totaal RNA van exosomes en kweekmedia werden alle hoeveelheden ruwe producten in dezelfde procedure behandeld behalve het gebruik van 5 U DNase. RNA werd gezuiverd met behulp van de RNeasy MinElute Cleanup Kit (Qiagen) volgens de instructies van de fabrikant. De RNA-monsters werden gekwantificeerd met een NanoDrop spectrofotometer (Thermo Fisher Scientific) en beoordeeld met behulp van de Agilent Small RNA Kit en de Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies).

Microarray analyse

Voor miRNA profilering, 100 ng en 20 ng cellulaire en extracellulaire totale RNA's ontvingen, fluorescentie gelabeld met het miRNA complete labelingsreagens en Hyb Kit (Agilent Technologies) volgens het protocol van de vervaardiging (Agilent miRNA microarrays versie 2.2). De uitgebreide miRNA analyse werd uitgevoerd met het menselijke miRNA Microarray Kit (8 x 15 K) Ver.3.0 (Agilent). Hybridisatiesignalen werden gedetecteerd met de DNA Microarray Scanner (Agilent Technologies). De gescande beelden werden geanalyseerd met behulp van de Agilent Feature Extraction software en data-analyse werd uitgevoerd met het GeneSpring GX software (Agilent Technologies). De besproken in dit manuscript gegevens zijn neergelegd in NCBI's Gene Expression Omnibus (GEO) en zijn toegankelijk via GEO Series toegangsnummer GSE21350: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc = GSE21350).

Reverse transcriptie (RT) en kwantitatieve RT-PCR analyse voor miRNA

kwantitatieve miRNA niveaus werden bepaald met real-time RT-PCR met de Applied Biosystems 7900 HT Sequence Detection System (Applied Biosystems), TaqMan® Gene Expression assay (Applied Biosystems) voor menselijke let-7a (assay ID 000377), laat-7b (assay ID 002619), laat-7c (assay ID 000379), laat-7d (assay ID 002283 ), laat-7e (assay ID 002406), laat-7F (assay ID 000382), laat-7 g (assay ID 002282), laat-7i (assay ID 002221), en U6 snRNA (assay ID 001973) als een endogene controle . Tien ng totaal RNA onderworpen aan omgekeerde transcriptie met TaqMan Universal PCR Master Mix AmpErase (Applied Biosystems) en de respectievelijke TaqMan reagentia voor doelgenen. RT-PCR werd uitgevoerd in een totaal volume van 20 gl reactiemengsel uitgevoerd volgens het protocol van de fabrikant. 95 ° C gedurende 10 min, 40 cycli van 95 ° C gedurende 15 s en 60 ° C gedurende 60 s: Amplificatie werd als volgt uitgevoerd. Monsters werden geanalyseerd in drievoud biologische repliceren of viervoud technische repliceren. De miRNA niveaus werden bepaald uit de cyclus drempelwaarde (Ct), de vergelijkende Ct werkwijze en normalisatie van het niveau van U6 snRNA in elk monster. Vouw stijgingen of dalingen in elk miRNA niveau getest werden bepaald op basis van het niveau van de AZ-P7A cellijn cellijnen.

Dankwoord

Wij danken de leden van de Shizuoka Cancer Center Research Institute voor hun vele nuttige tips. We danken ook Drs. Yutaka Yonemura en Yoshio Endo voor gift van AZ-P7A en MKN45P cellijnen.

• PLoS ONE: Een genexpressie Handtekening van Verworven chemoresistance aan cisplatine en fluorouracil Combinatie Chemotherapie bij maagkanker Patients
• PLoS ONE: hypoxia-induceerbare factor 1α Bepaalt maagkanker chemogevoeligheid via modulatie van p53 en NF-κB