PLoS ONE: Anna-7 MicroRNA Family valikoidusti erittyy solun ulkopuolelle kautta Eksosomit on mahalaukun metastasoivaa syöpäsolu Line

tiivistelmä

Background

Eksosomit on tärkeä rooli solun ja -solujen viestintä, kohdistaminen soluihin siirtää exosomal molekyylejä kuten proteiineja, mRNA: t, ja MikroRNA (miRNA) jota endosytoosin kaltainen reitin. miRNA ovat pieniä ei-koodaavaa RNA-molekyylejä, keskimäärin 22 aminohappoa pitkiä, jotka säätelevät lukuisia biologisia prosesseja kuten syövän synnyssä ja välittää geenin alassäätöä kohdistamalla mRNA: iden aiheuttamaan RNA: n hajoamisen ja /tai häiritsevät käännöstä. Viimeaikaiset raportit tarkoita, että miRNA voidaan stabiilisti havaita kiertävästä plasman ja seerumin koska miRNA on pakattu mukaan eksosomeiksi suojattava RNA: n hajoamisen. Siten profilointi exosomal miRNA ovat tarpeen selventää Parakriiniset ja löytää uusi sairauden merkkiaine samoin.

Menetelmät /Principal Havainnot

Eksosomit eristettiin viljellyistä syöpäsolun linjat ja niiden laatu oli validoitu analyyseillä lähetyksen elektronimikroskoopilla ja western-blottauksella. Yksi testatuista solulinjoista, metastasoitunut mahasyöpä solulinja, AZ-P7a, osoitti korkeinta RNA tuottavista julkaistiin eksosomeiksi ja erottuva muoto morfologia. Lisäksi RNA: t eristettiin soluista ja elatusaineet, ja profiilit näiden kolmen miRNA jakeet saatiin käyttämällä mikrosiruanalyysillä. Vertaamalla signaali intensiteettejä microarray tiedot ja seuraavat validointia käyttämällä RT-PCR-analyysi, huomasimme, että let-7 miRNA perhe oli runsaasti sekä solun sisäinen ja ulkoinen fraktioiden AZ-P7a soluissa, kun taas vähäinen metastaattinen AZ-521, emosolulinjassa linja AZ-P7a, sekä muita syövän solulinjat eivät osoittaneet tällaista taipumusta.

Johtopäätökset /merkitys

rikastuminen let-7 miRNA perheen solunulkoisessa jakeet, erityisesti, että eksosomeiksi AZ-P7a solut voivat heijastaa niiden kasvaimia synnyttävän ominaisuuksia, myös kasvaimen kehittymisen ja etäpesäke. Koska let-7 miRNA yleensä olla kasvaimeen tukahduttava rooli kohdistaminen onkogeenien kuten RAS
ja HMGA2
, tulokset viittaavat siihen, että AZ-P7a solut vapauttavat let-7 miRNA kautta eksosomeiksi osaksi solunulkoisen ympäristön säilyttää kasvaimen synnyssä.

Citation: Ohshima K, Inoue K, Fujiwara A, Hatakeyama K, Kanto K, Watanabe Y. et ai. (2010) Anna-7 MicroRNA Family valikoidusti erittyy solun ulkopuolelle kautta Eksosomit on mahalaukun metastasoivaa tasyöpäsolulinja. PLoS ONE 5 (10): e13247. doi: 10,1371 /journal.pone.0013247

Editor: Stefan Wölfl, Universität Heidelberg, Saksa

vastaanotettu: 14 huhtikuu 2010; Hyväksytty 10 syyskuuta 2010 Julkaistu: 08 lokakuu 2010

Copyright: © 2010 Ohshima et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ tukivat avustuksen yhteistyössä Innovative Technology ja Advanced Research in lajikehityksellisen Area (CITYSSÄ) alkaen opetus-, kulttuuri-, urheilu-, Science and Technology of Japan. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

solut erittävät erilaisia ​​pieniä kalvovesikkelien. Eksosomeiksi ovat yksi rakkuloita, joiden 30-100 nm halkaisijaltaan ja fysikaaliskemiallisesti selvästi muista erittyy rakkulat [1]. Sisällä eksosomeiksi, solu-geenin tuotteita, kuten proteiineja, mRNA: ita, ja MikroRNA (miRNA) ovat pakattu ja nämä molekyylit voidaan siirtää vastaanottajan solujen toimittamaan molekyyli signalointia, kuten syövän synnyn [2] - [4] ja immuunivastetta [1], [ ,,,0],5]. Eksosomeiksi vapautuu monet solutyypit [6], joka sisältää kasvainsoluja, epiteelisolut, ja hematopoieettisten solujen, kuten retikulosyyttien, sytotoksiset T-lymfosyytit, Epstein-Barr-viruksella transformoitujen B-solujen, mastocytes, dendriittisolut, ja verihiutaleet. Eritettyä eksosomeiksi on eristetty ja karakterisoitu in vitro
viljellyistä solulinjoista [7] yhdessä in vivo
kehon nesteissä [7] lukien veri [8], virtsa [9], syljen [10], lapsivesi [11], ja pahanlaatuisen Pleuraeffuusiot [12]. Koska havaittu monissa lisääntyvissä solutyypeissä, on ajateltavissa pahentaa tuumorisoluihin, mistä on osoituksena niiden lisääntynyt läsnäolo plasmassa ja Pleuraeffuusiot syöpäpotilaiden [8], [12]. Tämä lisääntynyt läsnäolo ei-invasiivisia kehon nesteistä syöpäpotilaiden on kiihtynyt profiloitua molekyyli komponenttien eksosomeiksi löytämiseksi kliinisesti hyödyllisiä kasvainmerkkiaineet ja biomarkkerit [3], [7], [13].

miRNA ovat luokka ei-koodaavaa pieniä RNA: iden, jotka ovat mukana translaation jälkeisessä geenin ilmentymisen säätelyyn estämällä sekä vakautta ja kääntäminen mRNA [14]. Viimeaikaiset todisteet ovat osoittaneet, että miRNA mutaatioiden tai misexpression korreloivat erilaisten ihmisen syöpien ja osoittavat, että jotkut miRNA voivat toimia onkogeenien tai tuumorisuppressoreilla [15], [16]. Analysoida RNA: t, se on aina harkita niiden vakauden hajoamiselta RNase. Viimeaikaiset havainnot viittaavat siihen, että endogeeninen plasma miRNA verinäytteistä ovat stabiilisti havaittavissa muodossa, joka on vastustuskykyinen RNaasi-aktiivisuus [17], osoittaa tunnistaminen miRNA kehon nesteistä, kuten verestä [17] - [24], virtsa [25], ja sylki [10], [26].

Viljellyt syöpäsolut on käytetty etsimään kasvain markkereita. Erityisesti tunnistaa proteiinien ja peptidien eritetään viljelyalustaan ​​on kehittänyt proteomiikka lähestymistapa [27], [28]. Kuten molekyyli allekirjoitus eksosomeiksi, proteomiikan sekä transkriptomiikka analyysit on tehty paljastaa kasvaimien syntyyn ja tunnistaa tuumorimarkkeri ehdokkaita [2] - [4], [7], [29]. Täällä tunnistaa miRNA liittyviä kasvaimien syntyyn ja etäpesäkkeiden, suoritimme laajan miRNA analyysi kolmessa solufraktioiden lukien solut, eksosomeiksi ja keskisuurten viljellyistä soluista. Sijoitus tiedot näistä solun sisäinen ja ulkoinen miRNA saatu mikrosiruanalyysillä, huomasimme, että let-7 miRNA perhe on runsaasti kaikissa fraktioissa AZ-P7a soluja, metastaattinen mahasyöpä solulinja, joka tuottaa homogeenista ja kondensoitunut morfologia, ja suurriittopuikko nopeudella exosomal miRNA. Nämä löydökset olivat selvästi muista solulinjoista kuten keuhkosyövän solulinjat (SBC-3, NCI-H69, ja DMS53), peräsuolen syöpä solulinjoja (SW480 ja SW620), ja AZ-521, emosolulinjassa AZ-P7a. Ottaen huomioon, että let-7 miRNA perhejuhlien lähinnä tuumorisuppressorigeeneille [30] kohdistaa onkogeenien kuten RAS
ja suuri liikkuvuus ryhmä A2 ( HMGA2
) [31], ehdotamme, että AZ -P7a solut selektiivisesti erittävät let-7 miRNA solunulkoiseen ympäristöön eksosomeiksi säilyttää tuumorigeenisiä ja metastaattisen taipumukset.

tulokset

eristäminen eksosomeiksi eri syöpäsolulinjasta

eksosomeiksi tuotetaan sisempi solujen solunulkoiseen ympäristöön kautta eksosytoosin kuten polku [1]. Sen lisäksi, että kehon nesteet, kuten seerumi ja plasma perifeerisestä verestä [7], [8], eksosomeiksi löytyy keskipitkällä viljeltyjen solujen [7], mikä helpottaa tunnistamista exosomal molekyylien, kuten proteiinien, mRNA: ita, ja miRNA että tavoitteena niiden kliinistä käyttöä. Profilointi kuten exosomal molekyylejä tuotetaan viljellyissä syöpäsolut ovat johtaneet löytää uusi ehdokas markkeri ja antigeenin syövän diagnostiikassa ja immunoterapiassa [7]. Tässä tutkimuksessa varten profilointi exosomal miRNA, ensin eristetty eksosomeiksi soluviljelymediumeista 46 syöpäsolulinjojen eri kudostyypeissä, jotka sisältävät 8 vatsaan, 16 keuhko-, 5 paksusuolen, 9 haima, 3 eturauhasen ja 5 rintojen. Sen jälkeen, kun soluja kasvatettiin 48 tunnin ajan, eksosomeiksi kerättiin yhdistelmä peräkkäisen sentrifugoinnin ja molekyylipainon cut-off -kalvoja, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Niiden puhtaus exosomal jakeet arvioitiin analyysit lähetyksen elektronimikroskoopilla ja western-blottauksella. Läpäisyelektronimikroskoopilla osoitti pyöreän muotoinen vesicular kalvo rakenne suunnilleen sisällä koko 100 nm halkaisijaltaan. Niistä kolme solulinjat, SBC-3, AZ-521, ja AZ-P7a, se on kiinnostava, että morfologia AZ-P7a soluissa oli homogeeninen ja kondensoitiin kuin muihin soluihin (kuvio 1A). Immunoelektronimikroskopiassa osoitti, että solunulkoinen hiukkaset eristetään viljelyalustasta AZ-P7a soluilla oli immunoreaktiivisuutta vasta-aine CD63, yksi exosomal kalvon proteiineja, on kapselisakkaridi kalvoja (kuvio 1 B). Läsnä ollessa tunnettujen exosomal proteiinit, jotka sisältävät CD29 /β1-integriini, Aip1 /Alix ja kasvaimen alttius geenin 101 (Tsg101) vahvistettiin Western blot -analyysillä, kun taas proteiini lokalisoitu solulimakalvostoon, BIP /Grp78, ei ollut havaittavissa (kuvio 1C). Tämä tulos osoittaa, että saastuminen saadun materiaalin solun muiden osastojen exosomal fraktioissa oli minimaalinen. Saanto exosomal proteiinien AZ-P7a soluissa oli 10 kertaa korkeampi kuin AZ-521-soluissa; ~2.5 Mg proteiinit saatiin 1 x 10 ^{8 AZ-P7a soluissa.}

rikastaminen exosomal johdettuja RNA: ita AZ-P7a solujen

Eristyksen jälkeen exosomal koko RNA: t eristettiin 46 viljellyt solulinjat. Mielenkiintoista on, että RNA: n saannot AZ-P7a solut olivat paljon suurempia kuin ne, muista soluista (kuvio 2A). Jakelun pituus osoitti, että läsnä on suuria määriä pieniä RNA: iden eksosomeiksi (keskiosa, kuvio 2B). On huomattava, että on olemassa merkittävä ero yhteensä eksosomeiksi ja exosomal miRNA tasojen potilailla, joilla on keuhkojen adenokarsinooma ja valvonta [8]. AZ-P7a solulinja perustettiin inokuloidaan toistuvasti emo AZ-521 soluja hiirissä, aiheutti suuren vatsakalvon etäpesäkkeitä potentiaalia [32], [33]. Siten korkea saannot sekä RNA-proteiini sekä morfologisiin ominaisuuksiin AZ-P7a solut voivat johtua korkeasta tuumorigeenisemmiksi ja metastaattisen taipumuksia. Koska miRNA on havaittu soluttomissa ruumiin nesteiden [17] - [20], myös suorittaa suoraan eristämällä kokonais-RNA: iden elatusaineesta ilman menettelyä eristämiseksi eksosomeiksi. Määrät yhteensä RNA: iden elatusaineet olivat yleensä suuremmat kuin eksosomeiksi (kuvio 2A). RNA jakelu pituus osoitti, että miRNA jakeet havaittiin alueella 10-40 nukleotidin pituisia RNA: t valmistettiin viljelyalustasta (oikea paneeli) sekä eksosomeiksi (keskellä paneeli) AZ-P7a soluja (kuvio 2B). Mukaan valmistajan protokollaa Bioanalyzer, huiput kanssa pidempään kuin 40 nukleotidin pituus sisältää muita pieniä RNA: t, mukaan lukien tRNA at 70~90, 5S ribosomi-RNA 100, ja 5.8S ribosomi-RNA 150, jota on havaittu solunsisäinen osa (vasen paneeli) . Nämä tulokset viittaavat siihen, että miRNA voi esiintyä viljelyväliaineeseen ulkopuolella exosomal osa, vaikka RNA: t uskotaan suojattava RNaasit olevan pakattu eksosomeiksi. Erityisesti verrattuna kiinnittyneet solut, lisäys RNA tuotosten oli huomattavan suurempi kelluva soluissa (NCI-H69 ja Lu-135) tai solujen sekoitus populaatiot kelluva ja kiinnittyneitä soluja (Colo205), mikä voi heijastua likaantumisesta RNA: iden irtoa hajotetuista soluista, jotka ovat jatkuvasti jäljellä elatusaineissa.

miRNA profilointi mikrosiruanalyysillä

miRNA profiilit solunsisäinen ja solunulkoinen fraktiot määritettiin mikrosiruanalyysillä seitsemän syöpäsolulinjoissa mukaan lukien AZ- 521, AZ-P7a, SBC-3, NCI-H69, DMS53, SW480 ja SW620. Näytteitä soluviljelymediumeista sekä eksosomeiksi edellyttäen hybridisaatiosignaaleista (kuva 3), mikä olisi osoitus miRNA näissä näytteissä. Tähän mennessä, analysointi microarray tiedot miRNA joukossa näytteitä, mitään selvää menetelmiä on tehty normalisoinnin signaalin intensiteettiä, koska on vaikea löytää sopiva sisäinen standardi materiaali [34]. Siten miRNA microarray tiedot ovat olleet yleensä analysoida ilman normalisointi, olettaen että kokonaismäärät panos RNA: iden ovat vakio joukossa näytteitä [34], [35]. Tässä tutkimuksessa jälkeen keskimäärin miRNA microarray tietoa kahden rinnakkaisnäytteiden me sijoittui miRNA mukaan niiden signaalin intensiteetin. Huomasimme, että let-7 miRNA perheen kuten let-7a, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, let-7f, let-7g, ja anna-7i havaittiin suhteellisen korkea signaalit suurimman solunsisäisen fraktiot seitsemän solulinjoja (taulukko 1, kuvio 3). Kuitenkin vähän tai ei ollenkaan signaalia intensiteetit let-7 miRNA havaittiin solunulkoisen fraktiot paitsi sekä ekstrasellulaarisen fraktioiden AZ-P7a solut ja viljelyväliaine osa NCI-H69-soluja (taulukko 1, kuvio 3). Erityisesti sekä solunulkoisessa fraktioiden AZ-P7a soluissa, kaikki kahdeksan let-7 miRNA havaittiin vaikka sijoitus anna-7 g oli pienempi kuin muut seitsemän let-7 miRNA. Joka perustuu erilliseen malleja let-7 miRNA-tasot kolmen solufraktioiden, me jaettu seitsemään solulinjojen kolmeen ryhmään (kuvio 3) seuraavasti; (1) AZ-P7a, solut, jotka let-7 miRNA havaittiin kaikissa kolmessa jakeet, (2) AZ-521 sekä SBC-3, DMS53, SW480 ja SW620, solut, jotka let-7 miRNA oli yleensä löytyy vain solunsisäisen jakeet, (3) NCI-H69, solut, jotka let-7 miRNA löytyivät solunsisäisten jakeet sekä viljelyväliaineessa jossain määrin.

RT-PCR-analyysit solunsisäisten ja solunulkoisten kirjaimien 7 miRNA perhe

jälkeen suoritettiin kvantitatiivinen RT-PCR kahdeksan let-7 miRNA perheen validoida microarray data. let-7 miRNA havaittiin helposti solunsisäisen ja solunulkoisen fraktioiden AZ-P7a soluissa (kuvio 4A) ja AZ-521-soluja (kuvio 4B). Tasot let-7 miRNA tuloa kohti RNA: t olivat yleensä korkeammat solunulkoisessa fraktioista AZ-P7a soluja kuin AZ-521 soluja. Normalisoimiseksi tasot tavoite miRNA saatiin RT-PCR: llä, U6 snRNA on yleisesti käytetty sisäisenä kontrollina. Havaitsimme läsnäolo U6 snRNA kaikissa kolmessa fraktioiden AZ-P7a solujen ja AZ-521-solut (kuvio 4C) ja verrataan tasoja let-7 miRNA välillä vastaavien fraktioiden näistä kahdesta solulinjoista. Normalisoinnin jälkeen, tasot anna-7 miRNA lukien let-7a, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, ja anna-7i sekä murto eksosomeiksi ja elatusaineet AZ-521-soluja alensi kuin niitä, AZ-P7a soluissa. Päinvastoin, ei ollut suurta eroa tasojen solunsisäinen anna-7 miRNA. Me seuraavaksi verrataan tasoon exosomal let-7a AZ-P7a soluja tarkoin muista syövän solulinjojen SBC-3, NCI-H69, DMS53, SW480 ja SW620, ja totesi, että let-7a tason vain SW620 soluista oli suhteellisen lähellä (0,7 kertaa) tasolle AZ-P7a soluissa (kuvio 4E). On huomattava, että solunsisäinen taso anna-7a päässä SW620 soluista oli noin 3,5 kertaa runsaammin kuin AZ-P7a soluissa. Näiden tulosten perusteella, oletimme lokalisaatio let-7a jakeet solujen ja eksosomeiksi (kuvio 5), ja johdetaan edelleen analysointia. Normalisoitu U6 tasot, laskimme suhteelliset tasot let-7a pakattu eksosomeiksi kohti tasot solun let-7a (kuvio 4F). Tämän seurauksena määrä exosomal let-7a oli paljon suurempi AZ-P7a soluja kuin muut kuusi soluihin, viittaa siihen, että AZ-P7a solut selektiivisesti ja erittyy aktiivisesti let-7 miRNA perheen solunulkoiseen ympäristöön eksosomeiksi.

keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme paljasti, että let-7 miRNA perheen erittyi solunulkoiseen ympäristöön exosomal liikenne, joka oli spesifinen metastaattinen mahasyövän solulinja, AZ-P7a. let-7 miRNA perheen ihmisen koostuu 10 sekvenssien 13 esiasteista [30]. Yleensä anna-7 miRNA toimivat tuumorisuppressorina kohdistamalla onkogeenien kuten RAS
ja HMGA2
ja anna-7 miRNA ovat vaimentua monissa syövissä kiinteiden elinten [31]. AZ-P7a soluilla metastaattinen kyky vatsakalvon levittämistä nude-hiirissä [32], [33]. Niinpä ehdotamme, että exosomal vapautuminen let-7 miRNA solunulkoiseen ympäristöön johtaa väheneminen antituumorigeenistä vaikutus solujen sisällä, mikä johtaa säilyttää onkogeneesiin ja invasiivisuus. Toisaalta, anna-7 miRNA harvemmin pelata onkogeenisessä toiminto, kasvun seurauksena ilmentymisen hypometylaatio klo let-7 lokus [36] tai kohdistaminen kaspaasi-3 mRNA [37]. Tässä tapauksessa exosomal vapauttamaan let-7 miRNA voi aiheuttaa transformaatio kohdesoluissa siirtämällä onkogeeninen ominaisuuksia.

Potilailla, joilla on keuhkosyöpä, koko tasot eksosomeiksi ja niiden miRNA kasvavat verrattuna kontrolleihin [8 ]. On osoitettu, että kasvain eksosomeiksi aiheuttaa immuuni paeta mekanismi syöpien spontaaniin T-solujen apoptoosin [38] - [40]. Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet homogeeninen morfologia ja rikastumista RNA: iden eksosomeiksi peräisin metastaattisen AZ-P7a soluissa. Tämä voi heijastua niiden kasvainten muodostumiseen.

miRNA ovat hyvin stabiileja veren plasmassa ja seerumissa, koska suojattu RNaaseista [17]. Siten se tekee miRNA tasot testataan kliinistä diagnoosia tuumorimerkkiaineiden ja biomarkkereita. Miten se tapahtuu? Chin et al. ovat ehdottaneet kahta hypoteeseja lähde miRNA verenkierrossa verinäytteistä; se voi johtua seurauksena kasvainsolun kuoleman ja liuottava tai vapauttaa tuumorisolujen solunulkoiseen microenvironment verisuonten [19]. Sitä vastoin kiinnittyneet solut, havaitsimme, että määrät koko RNA: iden elatusaineissa oli suhteellisesti suurempi kuin eksosomeiksi varten solujen kelluvien omaisuuden kuten NCI-H69, Lu-135, ja Colo205. Tämä lisäys johti luultavasti saastumiseen RNA: iden kuolleita soluja elatusaineissa.

löytö romaani veren kasvainmerkkiaineet ja biomarkkereita, omiikka lähestymistapoja kuten proteomiikka ja transkriptomiikka tehdään joko suoraan analyysi verinäytteiden tai sovelluksen profiloinnin kudosnäytteistä. On ristiriitaisia ​​raportteja jos onko profiilit miRNA ja mRNA verenkiertoon ovat rinnan kasvain profiilia. Allekirjoitus exosomal miRNA heijastaa että lähettävän kasvainsolujen potilailla, joilla on keuhkojen adenokarsinooma [8] ja rintasyövän [41]. Toisaalta, Skog et ai. ovat osoittaneet, että mikrosiruanalyysi mRNA peräisin glioblastoma-soluissa ja vastaavan eksosomeiksi paljasti mRNA: ita ainoastaan ​​havaittu mikrorakkulat, spekuloidaan, että mRNA: t lokalisoitu tietylle alueelle sytoplasman [3]. Lisäksi, Tanaka et ai. ovat osoittaneet, että taso miR-92a laski veren plasmassa akuutin leukemian, kun taas sen voimakasta ekspressiota havaittiin kudosnäytteistä [24]. Tuloksemme valikoivaa rikastuminen let-7 miRNA perheen AZ-P7a soluista johdettuja eksosomeiksi sovi jälkimmäisessä tapauksessa. Ellei kohde- molekyylit ovat miRNA peräisin verenkierrossa olevia kasvainsoluja, se viittaa siihen, huolellinen tutkiminen tarvitaan käyttää miRNA profiileja kudosnäytteiden havaitseminen seerumissa tai plasmassa näytteitä.

Koska eksosomeiksi tuotetaan hematopoieettiset solut sekä epiteelisoluja , kiertävä veri sisältää eksosomeiksi johdettu sekä tyypin soluja. Yleisesti, tutkittava exosomal profiileja proteiinien, mRNA: iden ja miRNA seerumista ja plasmasta, eksosomeiksi tuumoreista saatuja epiteelin ominaisuudet erotetaan pois lukien hematopoieettiset solut [8], [13]. Tämä suoritetaan käyttämällä affiniteettipuhdistuksen vasta-aineilla molekyylien, kuten EpCAM, jotka ilmentävät pinnan epiteelisolujen. Havaintomme, että oli samalla tasolla let-7 miRNA perheen välillä eksosomeiksi ja kulttuurin median AZ-P7a solut viittaavat siihen, että nämä miRNA tasot voidaan mitata eristämättä eksosomeiksi kliinisistä näytteistä, kuten seerumista ja plasmasta.

Johtopäätöksenä tämä tutkimus osoitti, että let-7 miRNA perhe on runsaasti eksosomeiksi etäispesäkkeellisestä mahasyöpä solulinja, AZ-P7a soluissa. Koska let-7 miRNA osallistuvat sulkuprosessista [31], niiden exosomal eritys voi olla tärkeä rooli kasvainten synnyssä ja etäpesäkkeitä.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

ihmisen mahasyöpä solulinjat (AZ-521, MKN45, KATOIII ja NUGC-3), ihmisen keuhkosyövän solulinjoja (SBC-3, Lu-65, Lu-135, ja KNS-62), ja ihmisen haimasyövän soluja ( suit-2) ostettiin japani Collection of Research Bioresources. Ihmisen mahalaukun syöpäsolut (SNU-1), ihmisen keuhkosyövän solulinjoja (DMS-53, DMS114, NCI-H69, A549, NCI-H1299, NCI-H1155, NCI-H520, NCI-H1560, SK-MES-1, ja HCC827), ihmisen mesoteliooma solut (MSTO-H211), paksu- ja peräsuolisyövän solulinjoissa (SW480, SW620, Colo205, LoVo, ja HCT116 ihmisen haimasyövän solulinjoissa (BxPC-3, AsPC-1, Panc-1, MIAPaca- 2, HPAF-II, PL45, ja Capan-2), ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa (PC-3, SU145, ja LNCaP), ja ihmisen rintasyövän solulinjoissa (T-47D, MCF7, SK-BR-3, BT -474, ja MDA-MB-231) hankittiin American Type Culture Collection. MKN28 (ihmisen mahasyöpä solut) ja PSN-1 (ihmisen haimasyövän soluja) ostettiin Immuno-Biological Laboratories ja European Collection of Cell Culture, vastaavasti . Ihmisen mahasyöpä solulinjat, AZ-P7a [32], [33] ja MKN45P [42] olivat lahja tohtorit. Yutaka Yonemura ja Yoshio Endo. In AZ-521 ja AZ-P7a soluja, ei RT-PCR-tuotteet havaittiin 14 retrovirukset, mukaan lukien HPV 16, EBV, CMV, SV40, HBV, HCV, BKV, JCV, HHV7, HTLV1, HTLV2, HIV1, HIV2, ja ADV tyypin 1 (tietoja ei esitetty), ilman tartuntaa näiden retrovirukset sekä solulinjoissa . Soluja ylläpidettiin RPMI-1640-alustassa (Sigma-Aldrich), jota oli täydennetty 10% lämmöllä inaktivoitua naudan sikiön seerumia (Invitrogen), 100 U /ml penisilliiniä, ja 0,1 mg /ml streptomysiiniä.

tuotanto ja eristäminen ja eksosomeiksi

Adherentit solut ympättiin 150 mm: n annoksia sopiva määrä solujen välillä 3 x 10 ^{6-1 x 10 7 solua per malja, kun taas kelluva solut ympättiin 75 cm 2-pullossa 2~2.5 x 10 7 solua pulloa kohti. Soluja viljeltiin täydellisessä RPMI-1640-alustassa jossa on 25 ml ja 50 ml ruokia ja pullot, vastaavasti, 24 tunnin ajan 37 ° C: ssa ja 5% CO _{2, pestiin kahdesti fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), ja inkuboitiin 48 h fenolipunaista RPMI-1640-alustassa (Sigma-Aldrich), joka sisälsi 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia, joka oli aiemmin köyhdytettyä kontaminoivat mikrovesikkelien yli yön sentrifugoimalla 100.000 x g. Eksosomeiksi eristettiin kokonais-solujen välillä 6 x 10 7-3 x 10 8-soluista, kuten aikaisemmin on kuvattu [29]. Lyhyesti, elatusaine kerättiin ja sentrifugoitiin 800 x g: ssä 5 minuutin ajan ja vielä 2000 x g 10 minuuttia poistamiseksi nostetaan soluihin. Supernatantti tehtiin suodattamalla 0,1 um huokoskoko polyeetterisulfonikalvo suodattimen (Corning) solujätteen poistamiseksi ja suuri rakkulat, mitä seurasi konsentrointi, jota 100000 Mw cut-off-kalvoa (Centriplus-70, Millipore). Tilavuus supernatanttia laskettiin noin 250-500 ml noin 30 ml. Sitten supernatantti ultrasentrifugoitiin 100000 x g 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa käyttäen 70Ti roottoria (Beckman Coulter). Saatu pelletit suspendoitiin uudelleen 6 ml: aan PBS: ää ja ultrasentrifugoitiin 100000 x g 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa käyttäen 100Ti roottoria (Beckman Coulter).}}

Transmissioelektronimikroskopia

pelletoitiin eksosomeiksi sekoitettiin kanssa yhtä suuret määrät vasta valmistettuja 2% glutaarialdehydiä PBS: ssä, inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa, jälkikiinnitettiin 1% osmiumtetroksidilla PBS: ssä 4 ° C: ssa 2 h, ja kuivattu luokiteltujen sarjojen etanolia. Sen jälkeen kuivuminen, näytteet siirrettiin propyleenioksidin ja upotettiin epoksihartsiin Quetol 812 (Nisshin EM). Ultrathin leikkeitä leikattiin Ultracut UCT (LEICA), värjättiin uranyyliasetaatilla ja lyijyn sitraatti, ja havaittu JEM-1230 (JEOL). Immunoelektronimikroskopiassa mikroskooppinen analyysi suoritettiin menetelmällä, ovat kuvanneet Xiao et ai. [43] pienin muutoksin. Lyhyesti, eksosomeiksi sekoitettiin ja inkuboitiin hiiren anti-ihmis-CD63 monoklonaalinen vasta-aine (luettelonro. Sc-51662, Santa Cruz) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Näyte pudotetaan kalvon pinnan kupari mesh (kollodiumiin /hiilellä päällystetty 400 mesh, Nisshin EM) ja inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Pesun jälkeen PBS: llä, immunokulta konjugoitua vuohen anti-hiiri-IgG (luettelo no. EM.GMHL15, BBInternational) laimennettiin 1:20 tiputettiin kalvo. Kuparin mesh oli kellui pisarat sen kalvon pintaan liikahdellut huoneenlämmössä 30 minuuttia. Pesun jälkeen PBS: llä, uranyyliasetaatilla tippaa otettiin kiinni kupariverkolla pinnan ja värjättiin huoneenlämmössä 30 s. Eksosomeiksi musta kolloidinen kulta hiukkasia kapselipussin kalvot merkitty positiivinen alla transmissioelektronimikroskoopilla.

Western blot-analyysi

Solut ja exosomal fraktiot pestiin, suspendoitiin uudelleen lyysipuskuriin [7,5 M ureaa (Sigma-Aldrich), 2,5 M tioureaa (Sigma-Aldrich), 12,5% glyserolia (Wako), 50 mM Tris, 2,5% n-oktyyli-beeta-D-glukosidi (Sigma-Aldrich), 6,25 mM Tris (2- karboksietyyli) fosfiini-hydrokloridi (Sigma-Aldrich), 1,25 mM proteaasinestäjä (luettelonro. P2714, Sigma-Aldrich)], ja inkuboitiin 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa käyttäen Pyöritin RT-50 (TAITEC). Kun oli sentrifugoitu 14000 x g: ssä 60 minuutin ajan 4 ° C: ssa, supernatantti otettiin talteen ja proteiinipitoisuus määritettiin Bradfordin Protein Assay Kit (Bio-Rad). Osa proteiinien (10 ug) denaturoitiin keittämällä Laemmli-näytepuskuriin, ajettiin 10% SDS-polyakryyliamidigeeleillä ja siirrettiin Immobilon-P PVDF-kalvoille (0,45 um huokoskoko, Millipore). Blotit blokattiin 1 tunnin ajan 5% rasvatonta maitoa Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa, joka sisälsi Tween 20: tä (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl ja 0,01% Tween 20). Blokkauksen jälkeen kalvoja inkuboitiin kunkin primaarisen vasta-aineen tai antiseerumia, kuten kanin anti-Tsg101 seerumia (luettelonro. T5951, Sigma-Aldrich), vuohen anti-Aip1 /Alix seerumin (luettelonro. Sc-49268, Santa Cruz), hiiren monoklonaalisella anti-CD29 /β1-integriini (luettelonro. sc-610468, BD Biosciences) ja hiiren monoklonaalinen anti-BIP /Grp78 (luettelonro. 610979, BD Biosciences) laimennoksena 1:200 1 h huoneen lämpötilassa. Blotteja inkuboitiin sitten vastaavan anti-IgG sekundääristä vasta-ainetta, joka oli konjugoitu piparjuuriperoksidaasiin (Jackson Laboratories) laimennoksena 1:2,000 1 h huoneen lämpötilassa. Erityisiä proteiinit visualisoitiin käyttäen ECL-järjestelmää (GE Healthcare) ja FUJIFILM Luminescent Image Analyzer LAS3000 (Fuji Film). Proteiini molekyylipaino on päätelty käyttäen Precision Plus Protein Standards (Bio-Rad Laboratories).

RNA: n eristäminen

RNA: n eristämistä elatusaineesta, solut ympättiin, kuten yllä on kuvattu. 48 h jälkeen kasvanut, viljelyalusta kerättiin talteen ja sentrifugoitiin 800 x g: ssä 5 minuutin ajan ja vielä 2000 x g 10 minuuttia. Supernatantti tehtiin suodattamalla 0,22 um: n huokoskoko polyeetterisulfonikalvo suodattimen (Corning), jota seurasi konsentrointi, jossa on 5000 Mw cut-off-kalvoa (Centricon Plus-70, Millipore). Lopullinen tilavuus supernatanttia oli noin 10-20 ml: n alkuperäisestä tilavuudesta 250-500 ml. Supernatantti sekoitettiin yhtä suuren tilavuuden QIAzol Lysis Reagent (Qiagen), ja sen jälkeen menettely RNA: n eristämistä kuvataan alla. Kokonais-RNA eristettiin soluista, eksosomeiksi tai viljelyalustat käyttäen miRNeasy Mini Kit (Qiagen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Poistaa genomista DNA: ta, 40 ug solun kokonais-RNA: ta inkuboitiin 40 yksikköä RQ1 RNase-free DNase (Promega) 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan, kun läsnä oli 40 yksikköä RNasiinia Plus RNase Inhibitor (Promega). Täydellistä RNA eksosomeiksi ja elatusaineet, kaikki määrät Raa'at tuotteet käsiteltiin samalla tavalla, mutta ilman käytön 5 U DNaasia. RNA puhdistettiin käyttämällä Rneasy MinElute uudelleenjärjestäminen Kit (Qiagen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. RNA Näytteet kvantifioitiin NanoDrop spektrofotometrillä (Thermo Fisher Scientific) ja arvioitiin käyttäen Agilent Small RNA Kit ja Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies).

mikrosiruanalyysi

miRNA profilointia, 100 ng ja 20 ng solu- ja ekstrasellulaarisen yhteensä RNA: t, vastaavasti, olivat fluoresenssileimattuja käyttäen miRNA Complete Labeling Reagent ja Hyb Kit (Agilent Technologies) mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti (Agilent miRNA mikrosiruja versio 2.2). Kattava miRNA analyysi suoritettiin käyttäen Human miRNA Microarray Kit (8 x 15 K) Ver.3.0 (Agilent). Hybridisaatiosignaaleja havaittiin DNA Microarray Scanner (Agilent Technologies). Skannatut kuvat analysoitiin käyttämällä Agilent Feature Extraction ohjelmisto ja data-analyysi suoritettiin käyttäen GeneSpring GX -ohjelma (Agilent Technologies). Tiedot käsitellään tässä käsikirjoitus on talletettu NCBI: n Gene Expression Omnibus (GEO) ja ovat käytettävissä GEO Sarjan hakunumero GSE21350: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc = GSE21350).

käänteistranskriptio (RT) ja kvantitatiivinen RT-PCR miRNA analyysiä

Quantitative miRNA tasot määritettiin käyttäen reaaliaikaista RT-PCR: llä Applied Biosystems 7900 HT Sequence Detection System (Applied Biosystems), TaqMan® Gene Expression Assay (Applied Biosystems) ihmisen let-7a (määritys ID 000377), let-7b (määritys ID 002619), let-7c (määritys ID 000379), let-7d (määritys ID 002283 ), let-7e (määritys ID 002406), let-7f (määritys ID 000382), let-7 g (määritys ID 002282), let-7i (määritys ID 002221), ja U6 snRNA (määritys ID 001973) kuin endogeeninen kontrolli . Kymmenen ng kokonais-RNA alistettiin käänteistranskriptiolle kanssa TaqMan® Universal PCR Master Mix Ei AmpErase (Applied Biosystems) ja vastaava TaqMan® reagenssit kohdegeenien. RT-PCR suoritettiin kokonaistilavuudessa 20 ui reaktioseosta mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Monistus suoritettiin seuraavasti: 95 ° C: ssa 10 minuutin ajan, 40 sykliä 95 ° C 15 s ja 60 ° C: ssa 60 s. Näytteet analysoitiin kolmena kappaleena biologisina toisinto tai neljänä teknisenä jäljitellä. Mirna tasot määriteltiin työkierron kynnys (Ct), vertailevaa Ct menetelmällä, ja normalisointi jonka taso U6 snRNA kussakin näytteessä. Kertainen kasvaa tai vähenee kullakin miRNA tasolla testatuista solulinjoista määritettiin viittaamalla taso AZ-P7a solulinjassa.

Kiitokset

Kiitämme jäseniä Shizuoka Cancer Center Research Institute niiden monia hyödyllisiä ehdotuksia. Kiitämme myös Drs. Yutaka Yonemura ja Yoshio Endo lahja AZ-P7a ja MKN45P solulinjoissa.

• PLoS ONE: geeniekspressiovektoria allekirjoitus Hankitut Chemoresistance sisplatiinin ja Fluorouracil Yhdistelmä kemoterapian mahasyöpäpotilaista
• PLoS ONE: Hypoksia-indusoituva tekijä 1α Määrää mahasyövän Kemosensitiivisyys kautta modulaatio p53 ja NF-KB