PLoS ONE: CEACAM6 Bevordert maagkanker en metastase door inductie-mesenchymale transitie via PI3K /AKT Signalering Pathway

Abstract

overexpressie CEACAM6 in tumorweefsels speelt een belangrijke rol in de invasie, metastase en anoikis weerstand in een verscheidenheid humane kankers. We hebben onlangs gemeld dat CEACAM6 expressie opgereguleerd bij maagkanker (GC) weefsels en bevorderd GC metastase. Hier vermelden wij dat CEACAM6 bevordert peritoneale metastasen in
vivo Kopen en negatief gecorreleerd met E-cadherine in GC weefsels. CEACAM6 overexpressie geïnduceerde epitheliale-mesenchymale transitie (EMT) in GC, als toename in het EMT markers N-cadherine, vimentine en Slug terwijl E-cadherine werd afgenomen CEACAM6 overexpressie GC cellen; tegengestelde resultaten werden waargenomen in-CEACAM6 zwijgen opgelegd cellen. Voorts werd E-cadherine negatief gecorreleerd met diepte van tumorinvasie, lymfeklier en TNM GC weefsels. Bovendien kan CEACAM6 verhoogde matrix metalloproteïnase-9 (MMP-9) -activiteit in GC en anti-MMP-9 antilichaam toenemende invasie en migratie geïnduceerd door CEACAM6 keren. CEACAM6 ook verhoogde niveaus van gefosforyleerd AKT, dat betrokken is bij de progressie van een verscheidenheid van menselijke tumoren. Verder hebben we geconstateerd dat LY294002, een PI3K remmer, kan CEACAM6-geïnduceerde EMT reverse via mesenchymale-epitheliale transitie. Deze bevindingen suggereren dat CEACAM6 verbetert invasie en metastase in GC door bevordering EMT via de PI3K /AKT signaling pathway

Citation:. Zang M, Zhang B, Zhang Y, Li J, Su L, Z Zhu, et al . (2014) CEACAM6 Bevordert maagkanker en metastase door inductie-mesenchymale transitie via PI3K /AKT signaleringsroute. PLoS ONE 9 (11): e112908. doi: 10.1371 /journal.pone.0112908

Editor: Chun-Ming Wong, Universiteit van Hong Kong, Hong Kong

Ontvangen: 7 augustus 2014; Aanvaard: 16 oktober 2014; Gepubliceerd: 14 november 2014

Copyright: © 2014 Zang et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Data Availability:. De auteurs bevestigen dat alle gegevens waarop de bevindingen zijn volledig beschikbaar zonder beperking. Alle relevante gegevens zijn binnen het papier

Financiering:. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (nr 81172324, nr 91229106, nr 81272749, en nr 81372231) en Key Project van Shanghai Onderwijs Commissie (nr 12ZZ105 en No.12ZZ102) en Wetenschap en Technologie Commissie van Shanghai gemeente (nr 13ZR1425600). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

GC is een van de meest voorkomende kwaadaardige tumoren en een belangrijk wereldwijd gezondheidsprobleem, met name in Aziatische landen zoals Japan, Korea, China, waar het de tweede oorzaak van kanker-gerelateerde sterfte [1] - [3]. Carcino-antigeen gerelateerde celadhesie molecuul 6 (CEACAM6) een glycosylfosfatidylinositol (GPI) -gebonden immunoglobuline superfamilie lid dat tot overexpressie wordt gebracht in een verscheidenheid aan menselijke kankers, vooral maagdarmkanker [4], en functioneert als een intercellulair adhesiemolecuul [4] - [6]. Hoewel CEACAM6 is een GPI-verankerd celoppervlak glycoproteïne ontbreekt een transmembraan of intracellulair domein, maar kan beïnvloeden intracellulaire signaleringsgebeurtenissen en speelt een belangrijke rol bij spijsverteringskanker progressie [4], [6] - [8]. GPI-verankerde moleculen worden vaak samen gelokaliseerd kleine membraan microdomeinen in het plasmamembraan [9], die stroomafwaartse signalering cascades activeert zoals integrine signaleringsroute [10]. CEACAM6 fungeert als een oncogen in tumoren en kanker bevordert invasie, metastase, anoikis weerstand en chemoresistance en remt differentiatie [7], [8], [11]. We hebben onlangs gemeld dat CEACAM6 expressie opgereguleerd en gekoppeld aan lymfeknoop metastase in GC weefsels [12]. De mechanismen waardoor CEACAM6 invloeden intracellulaire signaaltransductie in GC nog worden vastgesteld.

-mesenchymale transitie (EMT) is niet alleen een fysiologisch proces tijdens de embryonale ontwikkeling of weefselregeneratie, maar ook een pathologische element kankervooruitgang, waarbij tumormetastase, apoptose en senescentie resistentie [13] - [15]. EMT geeft altijd een slechte klinische prognose in menselijke kankers. Een aantal mechanismen relevant EMT inleiding zijn beschreven, waaronder TGF-β, IL-6, PI3K /AKT, RAF /MAPK en SRC paden [15] - [18]. In onze vorige studie, zagen we CEACAM6-geïnduceerde SRC activatie in GC cellen [12], en de waargenomen verhoogde aantallen spoelvormige-CEACAM6 overexpressie cellen vergeleken met controle cellen. Daarom waren we zeer geïnteresseerd in het bepalen van de relatie tussen CEACAM6 en EMT in GC cellen. Hoewel de negatieve correlatie tussen CEACAM6 en EMT is opgenomen in de pancreas carcinomen [19], de mechanismen waarmee CEACAM6 reguleert EMT zijn slecht begrepen.

In deze studie hebben we verder onderzocht de effecten en de mogelijke paden van CEACAM6 in GC invasie en metastase, en onderzochten de correlatie met EMT.

Materialen en methoden

Ethics Verklaring

Geschreven informed consent in de studie is verkregen van alle deelnemers. De studie protocol werd goedgekeurd door de ethische commissie van Ruijin Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Dierlijke procedures werden volgens een protocol door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) in Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, China goedgekeurd uitgevoerd.

cellijnen en weefselmonsters

Het menselijk GC cellijnen SGC-7901, MKN-45 en MKN-28 werden aangekocht van Shanghai Institutes voor Biologische Wetenschappen, de Chinese Academy of Sciences. Cellen werden gekweekt bij 37 ° C in 5% CO _{2 en verzadiging vochtigheid in RPMI-1640 medium dat 10% foetaal runderserum.}

maagtumor en naburige niet-tumorweefsel werden verkregen van 93 patiënten met GC die curatieve operatie van 2010 tot 2013. De patiënten ondergingen in Shanghai Jiaotong University School of Medicine Affiliated Hospital Ruijin bestond uit 69 mannen en 24 vrouwen met een gemiddelde leeftijd van 62,1 jaar (range, 30-85 jaar). Geen van de patiënten had radiotherapie of chemotherapie kregen voorafgaande aan operatie. Clinicopathologische gegevens werden verzameld en pathologische stagering werd bepaald volgens de UICC TNM. Histologische typering werd uitgevoerd door ten minste twee ervaren pathologen zelfstandig werken in een dubbel-blinde manier. Deze studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van Shanghai Ruijin Hospital, en alle patiënten waren volledig op de hoogte van de experimentele procedures.

Vector bouw en transfectie

Full-length CEACAM6 cDNA werd verkregen door RT- PCR van totaal RNA geëxtraheerd uit monsters GC. De primer sequenties waren 5'-CCGGAATTCCCATGGGACCCCCCTCAGCCC-3 '(voorwaarts) en 5'-TCCCCCGGGGCTATATCAGAGCCACCCTGG-3' (omgekeerde). We verzamelde een pIRES2-eGFP-CEACAM6 construeren door CEACAM6 cDNA te voegen in pIRES2-eGFP vector. We vervolgens getransfecteerd pIRES2-eGFP-CEACAM6 of pIRES2-eGFP vector in SGC-7901 en MKN-45 cellen met behulp van Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, USA) volgens het protocol van de fabrikant. Stabiele klonen werden geselecteerd door continue behandeling met G418 (1,2 mg /ml; Gibco, New York, USA)

Lentivirale vector constructie

De ergonomisch CEACAM6 gen data, een paar oligonucleotide sequenties. en negatieve controle sequenties werden ontworpen en gesynthetiseerd door Shanghai Novobio Scientific Co., Ltd. shRNA sequenties waren als volgt: CEACAM6, 5'-CACCGCCGGACAGTTCCATGTATACGAATATACATGGAACTGTCCGG-3 '(voorwaarts) en 5'-AAAACCGGACAGTTCCATGTATATTCGTATACATGGAACTGTCCGGC-3' (omgekeerde); control, 5'-CACCGCTACACAAATCAGCGATTTCGAAAAATCGCTGATTTGTGTAG-3 '(voorwaarts) en 5'-AAAACTACACAAATCAGCGATTTTTCGAAATCGCTGATTTGTGTAGC-3' (omgekeerde). CEACAM6 shRNA werd gesubkloneerd in PL /shRNA /F lentivirale vector een PL /shRNA /SHR-CEACAM6 construct te verkrijgen. Dan PL /shRNA /SHR-CEACAM6 of controle lentivirale vectoren werden getransfecteerd in MKN-28 GC cellen. Stabiel getransfecteerde cellen werden geselecteerd door behandeling met 5 ug /ml blasticidine en werden gebruikt voor de identificatie en verder onderzoek.

Western blotting

De cellen werden geoogst en gelyseerd met behulp van RIPA buffer (Solarbio, Beijing, China ) bevattende 1% PMSF proteaseremmers. Een BCA assay kit (Pierce, Rockford, USA) werd gebruikt om de totale eiwitconcentratie te meten. Equivalente hoeveelheden eiwit werden gescheiden door 10% SDS-PAGE, en de opgeloste eiwitten overgebracht op PVDF-membranen. De membranen werden geblokkeerd met 5% magere melk gedurende 2 uur en vervolgens geïncubeerd met primaire antilichamen gedurende de nacht bij 4 ° C. Primaire antilichamen waren als volgt: CEACAM6 (1:500; Abcam, USA), E-cadherine (1:500; Cell Signaling Technology (CST), USA), N-cadherine (1:500, CST, USA), Vimentin ( 1:1000, CST, USA), Slug (1:500, CST, USA), p-AKT (Ser 473) (1:1000, CST, USA), de totale AKT (1:1000, CST, USA) en GAPDH ( 1:10000; Abcam, USA). Membranen werden vervolgens geïncubeerd met secundair antilichaam gedurende 2 uur bij kamertemperatuur en werden gevisualiseerd onder toepassing van een versterkte chemiluminescentie detectiesysteem (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ, USA) volgens het protocol van de fabrikant.

immunofluorescentiekleuring

De cellen werden gekweekt op dekglaasjes gedurende 24 uur en daarna gefixeerd met 4% paraformaldehyde gedurende 15 min. Cellen werden gewassen met PBS, vervolgens doorlaatbaar gemaakt met 0,5% Triton X-100 gedurende 20 min en geblokkeerd met 5% BSA gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. We vervolgens gekleurd de cellen met CEACAM6 antilichaam (1:50; Abcam) bij 37 ° C gedurende 2 uur, gevolgd door incubatie met fluorescerende secundair antilichaam gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. De kernen werden gekleurd met DAPI. Rhodamine phalloidin antilichaam (1:150; cytoskelet) werd gebruikt om de cytoskelet GC cellen te visualiseren. Dia's werden geanalyseerd en afgebeeld op een fluorescentiemicroscoop.

Immunohistochemie

Delen van 4 urn dikke werden uit paraffine-ingebed weefsel blokken gesneden en vervolgens paraffine ontdaan en gerehydrateerd. Immunohistochemische kleuring van secties werd uitgevoerd volgens het protocol DAKO behulp muizen anti-CEACAM6 (1:100, Abcam) en E-cadherine (1:100; CST) bij 4 ° C overnacht. Objectglaasjes werden vervolgens geïncubeerd met HRP-gelabeld secundair antilichaam en gevisualiseerd met diaminobenzidine. Twee pathologen die werden verblind aan elke patiënt gegevens onafhankelijk worden geëvalueerd en scoorde de secties. Immunohistochemie vlek score = positieve cel score + kleuring intensiteit score. (; 75% >) 0 (10%), 1 (10-25%), 2 (26-50%), 3 (51-75%) en 4: het percentage positieve cellen werd als volgt gewaardeerd. 0 (geen kleuring), 1 (zwakke kleuring), 2 (bruine verkleuring) en 3 (donkerbruin kleuring): immunohistochemische kleuring intensiteit werd als volgt beoordeeld. De totale scores van ≥3 werden gedefinieerd als positief data-analyse te vereenvoudigen. De correlatie tussen CEACAM6 en E-cadherine, Image-Pro Plus versie 6.0 geanalyseerd (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, USA) werd gebruikt om de expressie van CEACAM6 en E-cadherine kwantificeren 20 monsters.

gelatine zymografie

Voor MMP-9-activiteit te onderzoeken, werd zymografie uitgevoerd middels 10% SDS-PAGE gels die 1 mg /ml gelatine (Sigma). Kort samengevat, GC cellen werden gekweekt in serumvrij RPMI 1640-medium gedurende 24 uur en het supernatant werd daarna verzameld en gecentrifugeerd bij 1000 rpm gedurende 5 min. De gelen werden tweemaal in renaturatie buffer gewassen (2,5% Triton X-100) gedurende 30 min elke keer om SDS te verwijderen na elektroforese en vervolgens geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 24 h in een reactiebuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM CaCl2, 150 mM NaCl). We vervolgens de gels gekleurd met 0,5% Coomassie brilliant blue R-250 voor 2 uur en ontkleurd de gels in buffer (30% methanol, 10% azijnzuur). Helder transparant bands in de achtergrond van blauwe vlekken vertegenwoordigde de gelatinase activiteiten.

Cell migratie en invasie assays

Voor cel migratie en invasie assays, een totaal van 1 × 10 ^{5 cellen gesuspendeerd in serumvrij RPMI-1640 met of zonder MMP-9 antilichaam (Abcam, 2 ug /200 ul) en uitgeplaat in transwell kamers (8 um voor 24-wells plaat, Corning Costar, NY, USA) met of zonder Matrigel ( BD Bioscience, CA, USA) volgens de protocollen van de fabrikant. Voor beide testen werd medium met 10% FBS aan de onderste kamer als een chemoattractant toegevoegd. Na 24 uur kweken werden de cellen gefixeerd met 10% formaline en gekleurd met 0,5% kristalviolet. Tot slot, de cellen in de onderste kamer werden gefotografeerd en geteld door omgekeerde microscopie.}

Naakt muis xenograft model

Vier weken oude mannelijke BALB /c naakt muizen (Institute of Zoology, China Academy of Sciences) werden gebruikt om de rol van CEACAM6 in peritoneale verspreiden in
vivo
evalueren. Naakt muizen werden ondergebracht op een specifieke pathogeen-vrije omgeving in de Animal Laboratory Unit, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, China. Muizen kregen humane zorg en het onderzoek protocollen zijn volgens een protocol door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) in Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, China goedgekeurd uitgevoerd. Een totaal van 2 x 10 ^{6 SGC-7901-CEACAM6 of SGC-7901-NC-cellen werden geïnjecteerd in vijf muizen buikholte van elke groep (randomisatie). Muizen werden gedood op de 30e dag na de injectie, en de abdominale massa zijn afgebeeld en gefotografeerd. Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de officiële aanbevelingen van de Chinese dier gemeenschap.}

Statistieken

Studenten t
-test werd gebruikt om de statistische verschillen tussen de twee groepen te onderzoeken . Correlaties tussen E-cadherine in GC weefsels en clinicopathologische parameters en CEACAM6 expressie werden geanalyseerd door chi-kwadraat of exacte toets van Fisher of Pearson correlatiecoëfficiënt analyse. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD. P Restaurant < 0,05 en P
. ≪ 0,01 werd beschouwd als statistisch significant en zeer significant, respectievelijk

Resultaten

CEACAM6 beïnvloedt cel morfologie en de cytoskelet

Onze eerdere resultaten impliceerde dat MKN-28 GC cellen inherent hoge niveaus van CEACAM6 te drukken, terwijl SGC-7901 en MKN-45 GC cellen brengen lage niveaus [12]. Overexpressie van CEACAM6 in SGC-7901 en MKN-45 GC cellen en verzwakking van CEACAM6 expressie in MKN-28 GC cellen door pL /shRNA /SHR-CEACAM6 lentivirale vectoren werden bevestigd op eiwitniveau door Western blot-analyse (Fig. 1A). Immunofluorescentie assays toonde altijd dat SGC-7901-CEACAM6 cellen brachten meer CEACAM6 eiwitten dan SGC-7901-NC-cellen (Fig. 1B).

Interessant, werd celmorfologie veranderd volgende CEACAM6 demping en overexpressie. In vergelijking met de controlecellen, SGC-7901-CEACAM6 en MKN-45-CEACAM6 cellen vertoonden een mesenchymale morfologie en waren spindle- en spoelvormige vorm (fig. 1C). Omgekeerd typische overgang van mesenchymale aan epitheliale morfologie gedetecteerd in MKN-28-SH cellen tegen MKN-28-nc cellen (fig. 1C). Het was echter onduidelijk of CEACAM6 overexpressie een effect op het cytoskelet, waardoor immunofluorescentie kleuring van F-actine kleuring werd uitgevoerd had. Interessant is dat van grotere hoeveelheden spoelvormige-vormige cellen waargenomen voor MKN-45-CEACAM6 en SGC-7901-CEACAM6 lijnen vergelijking met de controle cellen (Fig. 1D).

CEACAM6 negatief geassocieerd met E-cadherine in GC weefsels

immunohistochemische analyse werd gebruikt om de niveaus van E-cadherine-expressie in kankerweefsel en gepaarde naburige niet-tumor weefsels te bepalen. Immunohistochemische kleuring toonde aan E-cadherine lager in tumorweefsels dan in aangrenzende niet- tumoreuze weefsel, waaruit bleek dat E-cadherine hoofdzakelijk ligt in het cytomembrane van epitheelcellen (fig. 2D, E, F). Vervolgens onderzochten we het verband tussen E-cadherine en clinicopathologische kenmerken van GC, en vond dat downgereguleerd E-cadherine werd geassocieerd met invasiediepte ( P
= 0,046), lymfeklier ( P
= 0,013), en TNM stadium ( P
= 0,035), maar niet met andere klinische en pathologische factoren zoals geslacht, leeftijd, of differentiatie (tabel 1). Bovendien CEACAM6 negatief gecorreleerd met EMT in pancreascarcinomen [19] en CEACAM6 onderdrukking kan E-cadherine promoteractiviteit in colorectale kanker [20] te verhogen.

Verder onderzochten we het verband tussen E-cadherine en expressie CEACAM6 in GC door seriële sectie immunohistochemie (20 monsters). CEACAM6 expressie in tumorweefsels was hoger dan die in gelijke niet-tumor weefsels (fig. 2A, B, C), consistent met onze eerdere resultaten [12]. Interessant, vonden we dat CEACAM6 expressie negatief gecorreleerd met E-cadherine-expressie in weefsels door GC Pearson correlatiecoëfficiënt analyse ( P
< 0,01; fig. 2G).

CEACAM6 induceert EMT GC cellen

EMT-gerelateerde eiwitten in GC cellen werden geëvalueerd door Western blotanalyse. We zagen dat de N-cadherine, vimentine en Slug eiwitniveaus verhoogd, terwijl de E-cadherine werd afgenomen CEACAM6-overexpressie cellen in vergelijking met hun respectievelijke controlecellen (fig. 3A, B). Converse resultaten werden verkregen na CEACAM6 in MKN-28 cellen werd geslagen (fig. 3C, D). Deze resultaten suggereerden een functionele rol bij het reguleren CEACAM6 EMT GC cellen. Bovendien zijn deze opmerkingen GC-cellen waren vergelijkbaar met de bevindingen van GC weefsel.

CEACAM6 verhoogt de activiteit van MMP-9 in GC cellen

Het is algemeen bekend dat de hechting, afbraak en migratie belangrijke kwesties in uitzaaiing van kanker. Gelatine zymografie werd uitgevoerd om de effecten van CEACAM6 op de activiteit van MMP-9, wat belangrijk is bij ECM afbraak te onderzoeken. MMP-9-activiteit in SGC-7901-CEACAM6 en MKN-45-CEACAM6 cellen werd verhoogd ten opzichte van hun controle groepen (Fig. 4A, B). Vervolgens onderzochten we of de verhoogde activiteit van MMP-9 geïnduceerd door CEACAM6 GC cellen resulteerde in een echte toename in het aantal binnendringende en migrerende cellen. We onderzochten derhalve de bijdrage van werkzame anti-MMP-9 antilichaam of PBS CEACAM6 overexpressie GC cellen. Zoals verwacht, waren er significante verschillen in het aantal binnendringende en migrerende cellen in met antilichaam behandelde cellen in vergelijking met PBS-behandelde cellen ( P
< 0,01; fig. 4C, D, E, F).

CEACAM6 upregulates gefosforyleerd AKT in GC cellen

We hebben eerder opgemerkt dat SRC-activiteit werd geïnduceerd door CEACAM6 in SGC-7901 GC cellen. AKT is een downstream-eiwit van SRC en dramatisch geassocieerd met EMT, invasie en metastase in de progressie van de tumor. We hebben daarom onderzocht AKT activiteit in CEACAM6-overexpressie GC cellen. Western blotting toonde aan dat AKT fosforylatie op serine 473 in CEACAM6 aanzienlijk tot overexpressie GC-cellen toegenomen in vergelijking met de controlegroepen (Fig. 5A, B). Om te onderzoeken of EMT veranderingen werden geïnduceerd door CEACAM6 via de PI3K /AKT-route werden SGC-7901-CEACAM6 en MKN-45-CEACAM6 cellen behandeld met 100 nM LY294002 voor 24 uur. Interessant is dat E-cadherine toegenomen en N-cadherine werd verlaagd-LY294002 behandelde CEACAM6 overexpressie cellen vergeleken met de controles, zoals gemeten door Western blot-analyse (Fig. 5C, D).

CEACAM6 bevordert peritoneale verspreiding in vivo

Tot slot hebben we de effecten van CEACAM6 overexpressie peritoneale verspreiden en metastase in
vivo
onderzocht. We geïnjecteerd SGC-7901-CEACAM6 en SGC-7901-NC-cellen in de buik van naakt muizen. Uitgebreide peritoneale smeersel werd waargenomen in het SGC-7901-CEACAM6 groep vergeleken met SGC-7901 NC-groep (Fig. 6A). Er waren significant meer zichtbaar peritoneale knobbeltjes in de SGC-7901-CEACAM6 groep dan in de controlegroep (5.400 ± 0.510 vs
1,400 ± 0,245, P
. ≪ 0.01; fig. 6B ). Bovendien, overexpressie van CEACAM6 verbeteren metastase in
vivo
is ook gemeld bij alvleesklierkanker [19].

Discussie

GC is de tweede oorzaak van kanker-gerelateerde sterfgevallen wereldwijd [1]. Toenemende aanwijzingen dat CEACAM6 speelt een belangrijke rol bij spijsverteringskanker progressie [7], [20] - [22], en CEACAM6 wordt wijder verspreid dan CEA (CEACAM5) in normale weefsels, met significante expressie in vele epithelia [4]. CEACAM6 invloeden intracellulaire signalering evenementen via homofiele en heterofiele hechting met andere CEACAMs of integrinen [23], [24]. was het doel van deze studie om de bijdragen van GPI-verankerde eiwit CEACAM6 GC progressie onderzoeken.

Interessant namen wij waar dat celmorfologie en cytoskelet structuur werd veranderd door stabiele opwaartse regulatie en neerwaartse regulatie CEACAM6 GC cellen. -CEACAM6 overexpressie cellen waren mesenchymale-achtige en vertoonde een spil en spoelvorm en meer actine stressvezels gedetecteerd vergeleken met de controlegroepen, in een proces verstaan ​​EMT. De mesenchymale fenotype verleent cellen met meer trekkende en invasieve eigenschappen [15]. Deze waarneming was in overeenstemming met de in
vivo
resultaten waarbij CEACAM6 geïnduceerde uitgebreide peritoneale verspreiden in naakt muizen. BMO werd waargenomen volgende silencing van CEACAM6 in GC cellen. Deze waarnemingen toonden aan dat CEACAM6 betrokken kunnen zijn bij het induceren EMT in GC. We vervolgens onderzocht de correlatie tussen CEACAM6 en E-cadherine, een marker van EMT, in GC weefsels door immunohistochemische kleuring. Zoals verwacht werd significant negatieve correlatie gevonden tussen CEACAM6 en E-cadherine, en E-cadherine werd geassocieerd met de diepte van de tumor invasie, lymfekliermetastasen en TNM fase in GC weefsels. Daarnaast CEACAM6 bevorderd lymfeklier metastase ( P
= 0.001) in 98 GC weefsels in onze vorige studie [12]. Vorige resultaten toonden aan dat CEACAM6 demping toegenomen E-cadherine promoteractiviteit in colorectale kanker [20]. Uitgaande van deze bevindingen hebben we gepostuleerd dat CEACAM6 bevorderd GC invasie en metastase door inductie van EMT en kan dienen als mesenchymale merker.

Metastase is de belangrijkste oorzaak van kanker-geassocieerde dood, maar is moeilijk te bestuderen omdat geweest omvat een reeks van zeldzame, stochastische gebeurtenissen. Een aantal potentiële signaalwegen kanker metastase relevant zijn geïllustreerd, inclusief de PI3K /AKT, MAPK /ERK, FAK-SRC, JAK /STAT, NF-kβ en MMPs paden [25] - [27]. In deze studie overexpressie van CEACAM6 verhoogde MMP-9-activiteit en anti-MMP-9 antilichaam Het toenemende invasieve en migrerende eigenschappen geïnduceerd door CEACAM6 keren. EMT initiatie significant gecorreleerd met kanker metastase, en induceert stamcel eigenschappen, voorkomt apoptose en senescentie, en draagt ​​bij aan immunosuppressie bij progressie van kanker [15]. EMT kan worden geïnduceerd door stimulatie van PI3K /AKT signaling pathway [28], [29]. CEACAM6 functioneert als intercellulaire adhesie molecuul en kunnen grotere rafts vormen door wisselwerking met zichzelf of andere CEACAMs, waardoor het activeren van de stroomafwaartse signaaltransductie cascades, zoals integrine en PI3K /AKT routes [10], [30]. Daarom onderzochten we de effecten van CEACAM6 overexpressie op het niveau van AKT fosforylering in cellen GC. Gefosforyleerde AKT niveaus waren verhoogd in CEACAM6 overexpressie cellen, in overeenstemming met eerdere resultaten vermeld in pancreascarcinomen [8], [11]. Volgens deze waarnemingen, stellen wij een hypothese waarbij-CEACAM6 geïnduceerde EMT ontstaat door activering van de PI3K /AKT signaling cascade in GC. Bovendien-CEACAM6 overexpressie cellen behandeld met LY294002, een PI3K remmer, onderging een omkering van EMT via BMO. Derhalve concluderen wij dat CEACAM6 EMT induceert door activering van de PI3K /AKT signaling pathway in GC en kunnen dienen als een potentieel doelwit in tumorbehandeling.

Concluderend, hebben wij aangetoond dat CEACAM6 fungeert als een oncogen door het bevorderen EMT via PI3K /AKT activatie in GC. Bovendien wordt E-cadherine beduidend downregulated GC weefsels dan gepaard naburige niet-tumor weefsels. CEACAM6 bevordert de invasie en metastase in
vitro Kopen en in
vivo
, en kan een potentiële nieuwe diagnostische en prognostische marker en nieuwe doelstelling voor GC zijn therapie.

Ondersteunende informatie
Checklist S1.
KOMEN richtlijnen. Alle in vivo-experimenten in onze manuscript werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen KOMEN
doi:. 10.1371 /journal.pone.0112908.s001
(DOC)

Dankwoord

We wil Xuehua Chen en Zhang Jianian bedanken voor technische bijstand, om Beiqin Yu voor haar materiële ondersteuning.

• PLoS ONE: RABEX-5 opgereguleerd en speelt een Oncogene rol bij maagkanker Development door het activeren van de VEGF-signaleringsroute
• PLoS ONE: Is Vroege orale voeding na maagkanker Surgery Haalbaar? Een systematische review en meta-analyse van gerandomiseerde gecontroleerde studies