PLoS ONE: MicroRNA Tegul-7f slopina auglio invazija ir metastazes nukreipiant MYH9 žmogiškųjų skrandžio vėžio

Anotacija

Fonas

mikro RNR (miRNAs) yra svarbūs reguliatoriai, kurie vaidina pagrindinius vaidmenis Tumorigenesis ir naviko progresavimas. Ankstesnis ataskaita parodė, kad tegul-7 šeimos nariai, gali veikti kaip naviko slopintuvai daugelyje vėžio. Per Mirna masyvas, mes nustatėme, kad tegul-7f buvo downregulated į labai metastazavusiu potencialių skrandžio vėžio ląstelių linijų GC9811-P ir SGC7901-M, lyginant su jų tėvų ląstelių linijų, GC9811 ir SGC7901 nm; Tačiau šis mechanizmas nebuvo aišku. Šiame tyrime mes ištirti, ar leisti-7F veikia kaip naviko slopintuvas slopinti invazija ir metastazes skrandžio vėžio.

Metodologija /Pagrindiniai

Realaus laiko PGR parodė sumažėjęs atvangos 7f išraiška skrandžio vėžiui audinių ir ląstelių linijų, kurios yra potencialiai labai metastazavusiu. Mobilusis invazija ir migracija buvo žymiai sutrikęs GC9811-P ir SGC7901 M ląstelių linijas po transfekciją su let-7f-imituoja. Nude peles su ksenografiniuose modelių skrandžio vėžio patvirtino, kad tegul-7f gali slopinti skrandžio vėžio metastazių in vivo po transfekciją kurį lentivirus pGCsil-GFP- atvangos 7f. Liuciferazės Reporter tyrimai parodė, kad tegul-7F tiesiogiai jungiasi prie MYH9 3'UTR srities, kuri kodai myosin IIA, ir realiu laiku sugeriamojo toliau nurodytą PGR ir Vakarų, kad tegul-7f downregulated į myosin IIA išraišką tuo mRNR ir baltymų koncentracijos .

Išvados /Reikšmė

Mūsų tyrimas parodė, kad padidėjusią atvangos 7f skrandžio vėžio gali slopinti invazija ir migracijos skrandžio vėžio ląsteles per tiesiogiai skirta naviko metastazės susijusių genų MYH9. Šie duomenys rodo, kad tegul-7f gali būti romanas terapinis kandidatas skrandžio vėžiu, nes jos gebėjimas sumažinti ląstelių invaziją ir metastazes

nurodomoji dalis:. Liang S Jis L Zhao X Miao Y Gu Y guo C, ir kt. (2011) MicroRNA Tegul-7F slopina auglio invazija ir metastazių nukreipiant MYH9 žmogiškųjų skrandžio vėžio. PLoS ONE 6 (4): e18409. Doi: 10,1371 /journal.pone.0018409

redaktorius: Donaldas Gullberg universiteto Bergenas, Norvegija

Įstojo rugsėjo 27, 2010; Priėmė: Kovo 7, 2011 m Paskelbta: Balandžio 18, 2011

Visos teisės saugomos: © 2011 Liang et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis tyrimas parėmė Nacionalinės Gamtos mokslo fondo Kinijos (Nr 30801330, Nr 30871143, Nr 81.030.044)) ir Nacionalinės pagrindinių mokslinių tyrimų programą Kinijos (Nr 2010CB529300, Nr 2010CB529306). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys (GC) yra labiausiai paplitusi iš virškinimo trakto piktybinių navikų Rytų Azijoje, Rytų Europoje, ir dalių Centrinėje ir Pietų Amerikoje, ir yra antra pagrindinė priežastis, dėl vėžio mirčių [1]. Paplitęs metastazės buvo pagrindinė priežastis, dėl niūrus rezultatus GC pacientams. Metastazės yra sudėtingas, daugiapakopis procesas, kurio vėžinės ląstelės migruoja iš pirminės navikas į tolimą [2] vietos. Procesas prasideda, kai pirminio naviko ląstelės įsiveržti greta audinį, po to ląstelės įvežamų į kraują (intravasation) translocating per kraujagyslėse, išeinant iš kraujagyslių (ekstravazacija) į aplinkinius audinius parenchimos, inicijuojant mikrometastazių ir galiausiai plinta formuoti makroskopinis vidurinė navikai [3]. Vienas svarbiausių reguliavimo, kad dalyvauti šiame procese yra MicroRNA (Mirna) [4].

mikro RNR (miRNAs) yra endogeninių ir mažų ne kodavimo reguliavimo RNR, kurios reguliuoja genus ne atraminiam klasė transkripcijos lygio [5]. Brandaus miRNAs galima perrašyti RNR polimerazės II ir yra generuojami iš eilės perdirbimo pirminių Mirna nuorašai pagal Drosha ir Kauliukų žaidimai; tada jie tarnauja kaip posttranscriptional reguliatoriai genų ekspresiją per papildomą bazinę Kergimas Messenger RNR [6]. Daugelis ataskaitos rodo, kad miRNAs vaidina pagrindinius vaidmenis įvairių biologinių procesų, įskaitant ląstelių diferenciacijos, dauginimosi, apoptozės, atsparumas stresui, riebalų metabolizmo, Tumorigenesis ir naviko metastazių [7], [8], [9].

tegul-7 šeima yra užkonservuotas šeimos miRNAs. Tegul-7 pradžių buvo pastebėta nematodas Caenorhabditis elegans [10], ir keturiolika prisijungę buvo nustatyta iki šiol [11]. Neseniai buvo nustatyta, kad ekspresijos lygis daugelio leisti-7-šeimos narius, į kuriuos sumažintos vėžio įvairovė. Pavyzdžiui, leisti-7 yra downregulated plaučių vėžio, melanomos, ir galvos ir kaklo plokščiųjų karcinoma, o raiška iš leisti-7 gali slopinti vėžio ląstelių augimą [12], [13], [14], [15], [16 ], [17], [18]. Keli Onkogeny, pavyzdžiui, anksčiau Myc ir HMGA2, yra tiesioginiai tikslai tegul-7 [19], [20], [21]. Tegul-7f yra vienas narys Let-7 šeimos. Ankstesni tyrimai parodė, kad tegul-7f yra iki reguliuojama pirminėje krūties vėžio ir skatina angiogenezę [22]; downregulation PAH [23] buvo sukeltas lėtinės hipoksijos ar monocrotaline žiurkių, o lygis sumažėjo plazmos pūslelių NSLPV sergantiems pacientams [24]. Be to, leiskite-7f gali turėti įtakos ląstelių proliferaciją nukreipiant kalikreino susijusius peptidazes (KLKs), iš serino proteazės, kad buvo įrodyta, kad būti dysregulated keliose piktybinių navikų šeimą, įskaitant kiaušidžių vėžio [25].

Mūsų Lab anksčiau nustatė keletą skirtingai išreikštas miRNAs tarp GC9811 ir GC9811-P ląstelių grupę per aukšto lygio MicroRNA lustas analizuoja, kuriuose tegul-7f [26]. Per tolesnį apibūdinimo atvangos 7f įvairių vėžio ląstelių linijas, mes nustatėme, kad tegul-7F funkcijas kaip metastazių slopintuvas. Patobulinta išraiška atvangos 7f gali slopinti GC ląstelių invaziją ir migracijos in vitro ir in vivo. Iki bioinformatikos analizę, nustatėme, kad MYH9, kuris koduoja Miozinas IIA sunkiąją grandinę, susijusį su vėžinių ląstelių migraciją arba invazijos skatinimo, kaip spėjamą tegul-7f taikinį. Tolesni eksperimentai patvirtino, kad tegul-7f gali downregulate Miozinas IIA išraišką nukreipiant į MYH9 3'UTR, kuri suteikia galimą tikslą GC gydymą.

Medžiagos ir metodai

Audinių kolekcija

Jei pirminis skrandžio navikų audiniuose, gretimų ne naviko skrandžio audiniai ir tolimi metastaziniai skrandžio audiniai buvo gauti iš pacientų, kuriems buvo atlikta operacija tuo Xijing ligoninės virškinimo sistemos ligos Sianas, Kinija. Visi mėginiai buvo kliniškai ir patologiškai įrodyta, kad būti tinkamai paženklinti. Pacientai, siūlančių mėginius tyrime pasirašė informuoto asmens sutikimą formas.

Mobilusis kultūra

žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijas GC9811, GC9811-p, SGC7901-NM, SGC7901 M buvo užkonservuoti mūsų pačių laboratorija ir buvo auginamos RPMI1640 (HyClone), po to papildomai su 10% vaisiaus galvijų serumo. (FBS; Gibco), 100 vienetų /ml penicilino, ir 0,1 mg /ml streptomicino 37 ° C temperatūroje drėgnoje 5% anglies dioksido inkubatoriuje

RNR gavybos ir realaus laiko PGR

KRL-PGR buvo atliekama siekiant nustatyti raiškos lygius potencialių tegul-7F tikslinių genų. Iš viso RNR buvo išskirta iš audinių ar išaugintų ląstelių naudojant TRIZOL reagento (INVITROGEN Life Technologies). Papildo DNR (cDNR) buvo sukurtas naudojant TaqMan atvirkštinę transkripciją rinkinį (Applied Biosystems). Realaus laiko PGR tyrimai buvo atliekami su TaqMan Mikro RNR prabavimo Kit (Applied Biosystems). Gruntas ir tegul-7f buvo įsigytas iš Ambion (MI0000437). Gruntas ir MYH9 seka buvo sukurta naudojant Primer Express Programinė įranga (versija 1.5). Gruntas-MYH9 seka: (pirmyn) 5'AGAGCTCACGTGCCTCAACG3 "(atgal) 5'TGACCACACAGAACAGGCCTG3'.All protokolai buvo atliekamas pagal gamintojo nurodymus. Sąvoka lygis tegul-7f buvo normalizuotas 5S (pirmyn: 5'GATTGAATCGAGCACCAGTTAC3 "; ​​

Reversas: 5'GTCTACGGCCATACCACCCTGAAC3). Sąvoka lygis MYH9 normalizavosi to18S (pirmyn: 5'CGGCTACCACATCCAAGGAA3 ";

Reversas: 5'GCTGGAATATCCGCGGCT3") PGR ir duomenų rinkimas buvo atliekamas ant iCycler (Bio-Rad).. Kiekvienas mėginys buvo paleisti trimis egzemplioriais

Vector konstruktai ir lentivirus gamybos

pri-tegul-7f seka buvo pastatytas taip:. (Pirmyn) HSA-tegul-7f-1-Xho JEI GGGCCCGCTCTAGACTCGAGATATTTGCATGTCGCTATGTG (Grįžtamieji) HSA-tegul-7F-1- BamH IR CGCGGCCGCCTAATGGATCCAAAAAAGGCACAGTCGAGGCTGATC. Seka buvo išplėstos ir klonuotas į pGCsil-GFP Vector (GENECHEM) generuoti pGCsil-GFP- tegul-7f. Neigiama kontrolė buvo PGC FU RNRi-NC-LT. Virusas pakuotės buvo atliktas HEK 293T ląstelių po 20 mikrogramų pGCsil-GFP-tegul-7f vektoriaus kontransfekcijai 15 mikrogramų, kad pakuočių plazmidžių pHelper 1.0 Vector ir 10 mikrogramų voko plazmidžių pHelper 2,0 Vektorius naudojant Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Virusai buvo surinktos 48 val po transfekciją ir buvo pasiryžę virusinės titrai.

oligonukleidų statybos

tegul-7f imituoja, tegul-7f inhibitorius ir neigiama kontrolės siRNA oligonukleotidai buvo chemosynthesized (Šanchajus GenePhama Co Ltd "). Naudojami šiuose tyrimuose oligonukleotidai buvo jau let-7F imituoja: 5'UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU3'and 5'CUAUACAAUCUACCUCAUU3 ";

imituoja neigiama kontrolė: 5'UUCUCCGAACGUGUCACGUT3'and5'ACGUGACACGUUCGGAGAATT3", turi let-7F inhibitorių: 5'AACUAUACAAUCUACUACCUCA3 ". MircoRNA inhibitoriais neigiamą kontrolę: 5'CAGUACUUUUGUGUAGUACAA3 "

Mobilusis transfekcija

Ląstelės buvo auginamos 80% iki 90% santakoje po to, kai pasėjamos į 6-duobučių lėkštelėse ir buvo pernešta su Lipofectamine 2000 (Invitrogen. , Karlovi Varai, Kalifornija), pagal gamintojo instrukcijas. Trumpalaikiam transfekciją, ląstelių kiekvienai 6 šulinėlių plokštelės duobutę buvo pernešta su 12,5 iL Mirna inhibitoriumi arba 7,5 iL Mirna mimikos oligonukleotidų. Po 48 h transfekcijos, ląstelės buvo paruošta eksperimentuojama toliau. Dėl stabiliai perkeltų ląstelių, ląstelės buvo pernešta su lentiviruso 30% -50% susiliejimo. Tikslinės ląstelės (1 × 10 ^{4), įskaitant GC 9811-P ir SGC7901 M ląsteles, buvo užsikrėtę 1 × 10 6 rekombinantinės lentivirus-transdukciją vienetai 6 mikrogramai /ml polibrenui akivaizdoje (GENECHEM) .}

invazija tyrimas

invazinės gebėjimas ląstelių buvo tiriami naudojant Transwells (8-mkm porų dydis, Corning "Costar Corp"). Į Transwells buvo įdėti į 24-duobučių lėkštelėse. Pirma, 0,1 ml Matrigel (50 mikrogramų /ml, BD BioSciences) buvo pridėta ant plokštės paviršiaus ir inkubuojami 2 h, ir tada supernatantas buvo pašalintas. Šviežiai tripsinizuojamos ir plauti ląstelės (GC9811, GC9811-p, SGC7901 nm, SGC7901-M), buvo sustabdytas RPMI1640 sudėtyje yra 1% vaisiaus galvijų serumo. Tada 100 pL ląstelių suspensijos (1 × 10 ^{5 ląstelių) buvo pridėta prie viršutinės kameros kiekvieno įdėklu, kuris buvo padengtas su Matrigel. Be to, 450 pL RPMI1640, turinčio 10% vaisiaus jaučio serumo buvo įtraukta į apatinį skyrių, ir ląstelės buvo leista įsiveržti už 24 val-48 h 37 ° C temperatūroje, 5% CO _{2 sudrėkintas inkubatorių. Po inkubacijos ląstelės buvo nustatytas su 95% absoliučiojo alkoholio ir nudažomi su violetinei. Ląstelės ant viršutinio paviršiaus filtro buvo pašalintas su medvilnės tamponu ir ląstelės, kad įsiveržė į apatinio paviršiaus filtro buvo skaičiuojamas ir nufotografuotas pagal apversto mikroskopu ( "Olympus Corp Tokijas, Japonija) ne × 200 priartinimas per dešimties atsitiktinių laukai kiekvieną šulinėlį. Kiekvienas eksperimentas buvo pakartotas tris kartus.}}

Mobilusis migracija

iš GC9811, GC9811-P, SGC7901-nm, o SGC7901 M ląstelių sugebėjimas migruoti buvo aptiktas naudojant Transwells [8-mkm porų dydis, Corning "Costar Corp"]. Į Transwells buvo įdėti į 24-duobučių lėkštelėse. Šviežiai tripsinizuojamos ir plauti ląstelės buvo sustabdytas RPMI1640 sudėtyje yra 1% vaisiaus galvijų serumo. 5 × 10 ^{4 ląstelių /gerai buvo dedamas į viršų kameroje kiekvieno įdėklo (BD Biosciences, NJ), su nedengtų membranos. 450 pL RPMI1640, turinčio 10% vaisiaus jaučio serumo buvo įtraukta į apatines kamerose. Po to, kai inkubavimą 24 h-48 h 37 ° C temperatūroje, 5% CO _{2 temperatūroje drėgnoje inkubatoriuje, ląstelės buvo nustatyti su 95% absoliučiojo alkoholio ir nudažomi su violetinei. Vidiniame rūmų ląstelės buvo pašalintas su vatos tamponu ir prie apatinės pusės membrana ląstelės buvo skaičiuojami ir Nuimti pagal apverstos mikroskopu ( "Olympus Corp Tokijas, Japonija) ne × 200 priartinimas daugiau nei dešimt atsitiktinių laukų kiekvieną duobutę , Kiekvienas eksperimentas buvo pakartotas tris kartus.}}

In vivo metastazių bandymo

in vivo metastazės tyrimus, stabilios ląstelių linijos GC9811-P ir SGC7901-M buvo surinktos iš audinių kultūros kolbose po transfekciją su lentivirus pGCsil-GFP- tegul-7f ir kontroliuoti pGCsil-GFP naudojant tripsino ir tris kartus plaunamos PBS. Tada 2 × 10 ^{6 ląstelės buvo sustabdytos 0,2 ml serumo neturinčioje RPMI1640 kiekvienam pelės (šešių kiekvienoje grupėje, Fale gavimui BALB /c-nu /nu, 6-8 savaičių amžiaus), ir ląstelės buvo suleidžiamas į uodegos venos. Po keturių savaičių po injekcijos, pelės buvo paaukotos. Kepenų audinys buvo pastebėtas su plika akimi, ir buvo suskaičiuotos matomų navikų kepenų paviršiaus numeris. Kepenų audiniai buvo suskirstyti į serijinių skyriuose, fiksuotų su fosfato buferinis neutralioje formalino, tamsintas hematoksilinu ir eozinu ir ištiriami histologiškai. Nude pelėms buvo manipuliuojama ir slaugomi pagal NIH gyvūnų globos ir vaistų komiteto gaires eksperimente Gyvūnų centras ketvirtosios Karo medicinos universiteto (Xi'an, Šansi provincijoje, Kinija).}

liuciferazės Žurnalistė Analizės

Jei ištirti, ar MYH9 išraiška buvo reglamentuojama atvangos 7f, dual-liuciferazė reporterio testą buvo atliktas. 3 "UTR ir MYH9, kuriame tegul-7f privalomą svetainėje sustiprino PGR. Stiprinimas MYH9 naudoti šiuos pradmenis: (pirmyn) XhoIF: 5'CCGctcgagGCCTCTTCTCCTGCAGCCTG 3 "(atgal) NotIR: 5'ATAAGAATgcggccgcTCGTAGCACATGGTTCTCTTTATTG 3"

Kaip neigiamos kontrolės, mutavęs privalomą svetainėje 3'-UTR seka (naudojant atvirkštinio komplektą privalomą svetainėje) buvo papildyta naudojant pradmenis: (pirmyn) mutlet7MYH9F: 5'TTGCAATCACACGTGGTGTGGAGTCACACCTCTGCCCCTTGG3 "(atgal) mutlet7MYH9R: 5'CCAAGGGGCAGAGGTGTGACTCCACACCACGTGTGATTGCAA 3". Produktai buvo regeneruota per agarozės gelio elektroforezės ir klonuotas į liuciferazės reporteris PsiCHECK vektoriaus (Promega, Madison, WI). Visi konstruktai buvo patikrintas sekos. Prisijungti fazės GC9811-P ląstelės buvo pasėjamos į 24-duobučių lėkštelėse ir cotransfected su Tegul-7F inhibitoriais arba kontrolės ir liuciferazės žurnalistais naudojant Lipofectamine ™ 2000 (INVITROGEN), vadovaudamiesi instrukcijomis. Po 48 h inkubacijos, Firefly ir Renilla liuciferazė veikla buvo matuojamas dvejopo liuciferazės reporterio testą sistemos (Promega).

Vakarų dėmė

Ląstelės buvo du kartus plaunamas ledinio PBS ir mėšlą išmeta į Ripa buferio (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1% (v /v) Triton X-100, 1 mM EDTA, 1 mM leupeptiną, 1 mM fenilmetilsulfonilfluoridą fluorido, 10 mM NaF, 1 mM Na3VO4) su šviežiai pridėtinės proteazės inhibitorius kokteilis (Roche) 15 min ant ledo, tada centrifuguojamas 13,000 apsisukimų per minutę 10 min ir supernatantų, buvo surinkti. Dešimt mikrogramų kiekvieno mėginio buvo išspręsta naudojant 6% SDS-PAGE ir perkelti ant nitroceliuliozinio membrana (Bio-Rad, Heraklis, Kalifornija). Juostos buvo inkubuojamos su 10% Nonfat sauso pieno tri-buferiniame valgomosios druskos tirpale-0,1% Tween-20 blokuoti Nespecifinis prisiriSimo vietas ir inkubuojamos su pirminiais antikūnais: triušis polikloninis anti-žmogaus Miozinas IIA (praskiestas 1:500; Mobilusis signalines technologijos ) per naktį 4 ° C temperatūroje. Po to, kai rewarming ir pakartotino plovimo tris kartus, 15 min kiekvienai iš jų, membranos buvo inkubuojamos su krienų-peroksidazės-konjuguoto anti-triušio antrinio antikūno (Santa Cruz Biotechnology), praskiestas 1:2000 dvi valandas kambario temperatūroje. Juostos buvo aptikta naudojant sustiprintą chemiliuminescencine sistemą (Amersham biomokslų).

imunohistocheminis

Du audinio matricas buvo įsigytas iš Shanxi CHAOYING biotechnologijų CO., LTD. Vienas buvo skrandžio naviko audinyje ir suderinti gretimuose normaliuose skrandžio audinio, o kitas buvo skrandžio vėžys audinio ir suderinti limfmazgių metastazės .Tissue matricos buvo devaškuoti 60 ° C temperatūroje 2 val, aukštos temperatūros antigenas atkūrimo 10 min, rehidrataciją, inkubuojami 10% normalus ožkos serumas 1H, tada, inkubuotuose su triušio polikloninio anti-žmogaus miozino II A (praskiestas 1:100; Cell Signaling technologija) per naktį 4 ° C temperatūroje. Skaidres buvo plaunamos PBS tris kartus su kiekvienu 5 min. Audiniai buvo inkubuojamos ožkos anti-triušio serumu (DAKO) 1 valandą, o, praplaunamas PBS. Skyriai buvo aptikta naudojant DAB ir counterstained hematoksilinu. Dažymo intensyvumas pelnytas naudojant keturių lygių schema (0, 1+, 2+, arba 3+), o teigiamų ląstelių procentas buvo apskaičiuota pagal trijų skirtingų patologams (0 = Nėra, 1 = < 1%, 2 = 1 -10%, 3 = 10-30%, 4 = 30-70%, 5 = > 70% naviko ląstelių). tada bendra vidutinė balai buvo suskirstyti į keturias kategorijas: neigiamas (neaptinkama dažymo, kai vertinama, lyginant su nespecifinio fono dėmių, silpnas (+), vidutinio sunkumo (++) arba stipri (+++) ir, palyginti naudojant Mann-Whitney testą

Statistinė analizė

Stjudento t-testas (du-tailed), ANOVA ir Mann-Whitney testas dirbo analizuoti in vitro ir in vivo duomenimis, naudojant SPSS 12.0 programinę įrangą (Čikaga, IL , JAV) P vertę. < 0,05 buvo apibrėžtas kaip statistiškai reikšmingas * P
. < 0,05; ** P
. < 0,01

rezultatai

iš tegul-7f išraiškos lygis dažnai sumažėjo žmonių GC metastazavusiu ląstelių linijų ir audinių

mes išnagrinėjome iRNR raiškos lygius atvangos 7f dviem poromis žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijų, GC9811, GC9811 -P ir SGC7901 nm, SGC7901 M. Kaip parodyta 1a paveiksle, išraiškos atvangos 7f buvo mažesnis GC ląstelių, GC9811-P ir SGC7901-M, su dideliu metastazavusiu potencialo, o leiskite-7f buvo labiau išreikštas į GC ląsteles, GC9811 ir SGC7901 nm, su mažu metastazavusiu potencialą. Siekiant dar labiau patvirtina, kad tegul-7f skrandžio vėžio ląstelių metastazės vaidmenį, mes palyginti ekspresijos lygį atvangos 7f šviežia žmogaus skrandžio vėžio audinių bandinių su metastazėmis iš aštuonių asmenų (lentelė S1), iki normalių skrandžio audinių (GD), pradinio skrandžio vėžio audiniuose (GC) ir tolimi skrandžio vėžiui audiniai (MC), atitinkamai, realaus laiko PGR. Įdomu, ten buvo puikus downregulation iš atvangos 7f į MC ir GC, palyginti su leiskite-7f išraišką GD (1b pav.) Matėme, kad arba praradimo ar sumažėjo išraiška atvangos 7f navikuose ir jų metastazių audiniai lėmė glaudesnio metastazių skrandžio vėžio audiniuose. Visi rezultatai rodo, kad tegul-7f išraiška buvo neigiamai labai glaudžiai koreliuoja su sumažėjusiu metastazių GC ir gali vaidinti svarbų vaidmenį patologinių procesų. Taigi mes pateikėme klinikinius ir ląstelių konceptualų įrodymų metastazavusiu jungiklis vėžio išsivystymo, kuriais teigiama, pagrindinį vaidmenį už atvangos 7f išraiškos vėžio vystymąsi.

Tegul-7f slopino invazinės ir metastazavusiu gebėjimus GC ląstelių in vitro

Kadangi tegul-7f tarpininkauja invazijos ir metastazavusiu procesų maišytuvu, mes ištirti poveikį ir sumažėjo tegul-7F apie mažiau metastazavusiu ląstelių linijas ir padidino tegul-7F į daugiau metastazių ląstelių linijų. Norėdami atlikti šį, trumpa kištis RNR (siRNA) oligonukleotidai apie leiskite-7f buvo pastatytas ir įleidžiamos į GC9811 ląstelių ir SGC7901 -NM ląstelėmis metastazės tyrimus in vitro, kaip GC9811 let-7f-siRNA ląsteles, SGC7901-NM-tegul-7f -siRNA ląstelės ir kontrolės ląstelės. Kartu, mimikos let-7F ir neigiami kontroliniai oligonukleotidai taip pat buvo pastatytas ir pristatytas į GC9811-P ląstelių ir SGC7901 M ląstelėmis metastazės tyrimus in vitro, kaip GC9811-P-tegul-7f-mimikos ląsteles, SGC7901 N-jau tegul -7f-mimikos ląstelės ir kontrolės ląstelės. Išeikvojimas tegul-7F žymiai sumažėjusi dėl GC9811 ląstelių gebėjimą migruoti ir įsiveržti per Matrigel dengtos membranų ar ne Matrigel dengtos membranų link (2a paveikslėlis) serumo sudėtyje yra vidutinio modifikuotu Boyden kameros metodu. Padidėjęs išraiška tegul-7F reikšmingai slopino apie GC9811-P ląstelių gebėjimą migruoti ir įsiveržti per Matrigel dengtos membranų ar ne Matrigel dengtos membranų link terpe modifikuoto Boyden kamerinės tyrime (2B pav), serumo sudėtyje lyginant su kontrolės ląstelės. Panašūs rezultatai buvo rasti SGC7901 nm ląstelių (3A pav) ir SGC7901 M ląstelių (3b pav), o tegul-7f nokautas GC ląstelių linijas lėmė didesnes invazija ir migracijos normos.

Tegul-7F slopina naviko invazija ir metastazės į nuogas pelės ksenografiniuose modelio

GC9811-p arba SGC7901-M naviko ląstelės perkeltų su lentivirus pGCsil-GFP- tegul-7f arba neigiamos kontrolės pGCsil-GFP buvo švirkščiamas į nuogas pelių ir pelių buvo paaukota keturias savaites po skiepų. Išplitusiam Nodi skaičius buvo žymiai sumažintas nuogas pelių švirkščiamas su pGCsil-GFP- tegul-7F perkeltų ląstelių, lyginant su neigiamos kontrolės (pav 4A, 4B). Šie duomenys pateikti svarių įrodymų, kad leisti-7f gali slopinti auglio invazija ir metastazes in vivo.

Tegul-7f downregulates Miozinas TIS išraiška tiesiogiai nukreipti savo 3 "UTR

Jei toliau tirti mechanizmą kuri leidžia-7f slopina GC invazija ir metastazių, mes išanalizavo galimas tolesnis naviko metastazių susijusių tikslinių genų silikochromatas. Aptarėme tegul-7F tikslinių genų, ypač tuos genus, kurie buvo migracija ir /arba invazija susijusių ir nustatė, kad Miozinas TIS, dalyvauja vėžio ląstelių migraciją arba invazijos skatinimo, gali būti tikslinė genas tegul-7f. Siekdama nustatyti, ar Miozinas TIS reglamentuoja tegul-7F per tiesioginio privalomas jos 3 "UTR, mes pastatytas pilnametražis laukinio tipo ir mutantas fragmentus MYH9 iRNR 3" UTR, ir įterpė juos į regioną, esančią liuciferazės genas reporteris (5A pav). Vėliau, jau-7F mimikos oligos buvo bendrai perkeltų su skirtingų liuciferazės 3 "UTR stato į GC9811-P ląstelėse. Mes nustatėme, kad tegul-7f sumažėjo santykinė liuciferazės veiklą laukinio tipo 3 "UTR ir MYH9 (5b pav.) Tačiau liuciferazė veikla nenukrito smarkiai per UTRs su mutantas jungimosi vietų, lyginant su Mut tipo kolegomis (5c pav). Šie duomenys patvirtina, kad MYH9 yra tiesioginis tikslas tegul-7F.

AT-PGR parodė, kad MYH9 išraiška GC9811 ląstelių ir SGC7901 nm ląstelių transfektuotose tegul-7F-imituoja yra downregulated palyginti su šių ląstelių perkeltų su kontrolės konstruktų (5d pav). Imunoblotingo rezultatai parodė išraišką myosin IIA į GC9811 ir SGC7901-NM ląstelės transfektuotose tegul-7f-imituoja žemyn reguliuojama palyginti su tais, perkeltų su neigiamos kontrolės (5E pav.) Furthmore, Realaus laiko PGR rodo, kad iRNR santykinė išraiška MYH9 GC audinių ir tolimoje metastazavusiu audinio žemyn reguliuojama palyginti su jų normaliais gretimų nevėžinės egzempliorių (6a pav.) Imunohistocheminis parodė, kad miozino IIA išraiška GC limfmazgių metastazių yra iki reguliuojama palyginti su pirmine GC audinio (2 lentelė; 6C, skaičių; S1B pav), ir jis yra iki-reguliuojami GC audinio, lyginant su jam prilygstantį gretimuose normaliuose skrandžio audinių (1 lentelė; 6b pav; S1A paveikslas) .Šios duomenys rodo, kad tegul-7f gali žemyn reguliuoti iRNR išraišką MYH9 ir ​​gali slopinti baltymų vertimą jį

Diskusijos

. Šis tyrimas, mes parodė, kad leisti-7f išraišką metastazavusiu GC ląstelių linijų buvo downregulated lyginant leisti-7F išraišką nemetastazavusį GC ląsteles. Negimdinis išraiška ir siRNR nokdaunas ir tegul-7f patvirtino savo invazija sulaiko aktyvumas in vitro ir in vivo. Be to, mes parodome, kad MYH9 yra tiesioginis tikslas atvangos 7f ir tai tegul-7f tarpininkaujant slopinimas MYH9 priklauso nuo jo 3'-UTR. Todėl šie rezultatai pabrėžti tegul-7f kaip naviko slopintuvas ląstelių invazija ir metastazių nukreipiant MYH9 skrandžio vėžio reikšmę.

Neseniai atlikti tyrimai rodo, kad miRNAs gali veikti kaip aktyvatoriai ar inhibitoriais naviko metastazių [27] , Pavyzdžiui, MicroRNA-10b [28], PPN-373 ir Pasaulis-520C [29], [30] skatina vėžinių ląstelių migraciją ir invazija į krūties vėžio. Be to, PPN-155, gali skatinti navikų invazijos ir metastazes krūties vėžio downregulating savo tikslą, RhoA [31] ir skatinti naviko invazija ir metastazes į kasos latakų karcinoma iki represuoti į TP53INP1 išraišką [32]. Mirna-200 šeimos (Mirna-200A, Mirna-200B, Mirna-200c, Mirna-141 ir Mirna-429) gali slopinti auglio invazija ir metastazes reguliuojant EMT [33]. MiR-126 buvo nustatyta, kad slopina ląstelių sukibimą, migraciją ir invazija iš dalies per Crk slopinimo in vitro modelio nesmulkiųjų ląstelių plaučių karcinoma [34]. Įrodyta, kad Pasaulis-29c yra žymiai sumažinta, labai invazinės ir metastazavusiu nosiaryklės karcinomą [35]. MIR-218 slopina invazija ir metastazes skrandžio vėžio nukreipiant Robo1 receptorių [26]. Nors daugelis tyrimų buvo atlikta siekiant ištirti Mirna ir naviko metastazių mechanizmą, mechanizmas nebuvo aišku. Svarbiausia, keletas tyrimų buvo atlikta dėl GC metastazių reglamento dėl MicroRNA mechanizmus.

tegul-7f genas yra įsikūręs 9q22.3 ir dalyvauja daugelyje fiziologinių ir patologinių procesų įvairovę, įskaitant angiogenezę [36], Immunocyt diferenciacija [37], replikacijos senatvė [38], augimo sustojimas [39], plaučių arterinė hipertenzija ir Kancerogeninis [23]. Tegul-7f yra downregulated keliose piktybinių navikų. Labai besiskiriantis pavyzdys yra inkstų ląstelių karcinoma, kuriame tegul-7F downregulation leido žymiai sumažėjusios kalikreino (KLK) išraiška [40]. KLKs taip pat gali būti skirta iki atvangos 7f kiaušidžių vėžio [25]. Be papilinio skydliaukės vėžiu, sumažino išraišką atvangos 7f gali būti esminė molekulinės renginys RET /PTC piktybinę transformaciją [41]. Pirminės krūties vėžio atveju, tačiau, tegul-7f buvo aktyvinama, kai, palyginti su įprastais gretimų navikų audiniuose [22]. Mūsų tyrime mes parodė, kad tegul-7f taip pat downregulated MC audinių ir ląstelių linijų GC su dideliu metastazavusiu potencialo, ir mes toliau nagrinėti mechanizmą, kuris leidžia-7f sumažinti naviko invazija ir metastazės.

MYH9 yra už neraumeninio Miozinas sunkiosios grandinės IIA (NMHCIIA), kurio mutacijos yra atsakingas už tam tikrą sudėtingas sutrikimas pavadintas MYH9 susijusios ligos, kuriai būdingas įvairių fenotipo savybėmis, sąlygos [42] kartu genas. NMMHC-IIa, 1960 aminorūgščių grandinės seką, su išverstą molekulinė masė yra 220 kDa, yra įprastinis, ne-sarcomeric Miozinas išreikštas daugelyje ląstelių ir audinių. Jo funkcijos apima vaidmenis citokinezė, ląstelių judrumą ir priežiūra ląstelių formos [43]. Daugelis tyrimų rodo, kad MYH9 /NMHC-TIS turi atlikti pagrindinį vaidmenį naviko ląstelės invazinių behavior.For Pavyzdžiui, EGF priklauso nuo fosforilinimo iš Miozinas-IIA sunkiosios grandinės turi tiesioginį vaidmenį tarpininkauti judrumą ir chemotaksį į MDA-MB-231 žmogaus krūties vėžio ląstelės [44]. Myosin TIS atrodo, kad pagrindinis ląstelinis tikslas mts1 [45], mažas kalcio surišantis baltymas metastasin-1, ir bendrai localizes su mts1 į priekinio krašto migruoja vėžines ląsteles [46]; mts1 įtakoja tiek surinkimas elgsena myosin IIA ir jos fosforilinimo [47], [48]. Neseniai paskelbtame pranešime kaltinamas MYH9 (NMHC-IIa), kaip SRF tikslą, kuris padeda invazija ir metastazių krūties vėžio [49]. Mūsų duomenys rodo, kad MYH9 yra tiesioginis tikslas leisti-7f, kuris "išjungti invazija ir metastazes, prisijungdamas iš MYH9 3'UTR, kuri atvedė į Miozinas IIA išraiškos downregulation.

Taigi, mūsų tyrimai rodo, kad tegul-7f gali slopinti invazija ir metastazes skrandžio vėžiu tiesiogiai privalomi apie MYH9 3'UTR, savo tikslą. Nors yra dar daug išmokti apie atvangos 7f skrandžio vėžio Tumorigenesis vaidmenį, tegul-7f suteikia mums naujų potencialių tikslo skrandžio vėžio gydymo.

Pagalbinė informacija
S1 paveiksle.
į MYH9 išraišką skrandžio naviko egzempliorių. (A), išraiška MYH9 pirminėje skrandžio vėžio (Ca) ir jos gretimuose normaliuose skrandžio audinyje (N) pagal IHC. (B), išraiška MYH9 pirminėje skrandžio vėžio (Ca) ir jos atitiko limfmazgių metastazės audinių (M), IHC
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0018409.s001
(TIF)
lentelė S1.
Clinicopathologic funkcijos 8 šviežių skrandžio navikų mėginiuose.
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0018409.s002
(DOC)

Padėka

Esame dėkingi Zheng Chen puikios gairės eksperimento metu

• PLoS ONE: onkogeniniam CagA Skatina skrandžio vėžio riziką per aktyvinti ERK signalo perdavimo kelių: įdėtos atvejo-kontrolės Study
• PLoS ONE: WNT /β-kateninai Signalizacijos Pagerina ciklooksigenazę-2 (COX2) transkripcijos veikla Skrandžio vėžio ląsteles