PLOS ONE: microARN Laissez-7f inhibitions Invasion tumorale et les métastases en ciblant MYH9 dans le cancer gastrique humain

Résumé

Contexte

microARN (miARN) sont des régulateurs importants qui jouent un rôle clé dans la tumorigenèse et la progression tumorale. Un rapport précédent a montré que les membres de let-7 familles peuvent agir comme suppresseurs de tumeur dans de nombreux cancers. Grâce tableau miRNA, nous avons constaté que let-7F a été downregulated dans les lignées cellulaires de cancer gastrique potentiels hautement métastatiques GC9811-P et SGC7901-M, par rapport à leurs lignées cellulaires parentales, GC9811 et SGC7901-NM; cependant, le mécanisme n'a pas été clair. Dans cette étude, nous examinons les actes que let-7f comme un suppresseur de tumeur pour inhiber l'invasion et les métastases dans les cancers gastriques.

Méthodologie /Principales

PCR en temps réel a montré une diminution des niveaux de laisser-7f l'expression dans les tissus de cancer métastatique de l'estomac et des lignées cellulaires qui sont potentiellement hautement métastatique. invasion cellulaire et la migration ont été significativement altérées dans des lignées cellulaires SGC7901-M GC9811-P et après transfection avec let-7F-mime. souris Nude avec des modèles de xénogreffe de cancer de l'estomac a confirmé que let-7f pourrait inhiber les métastases de cancer gastrique in vivo après la transfection par le lentivirus pGCsil-GFP let-7f. dosages de rapporteur luciférase ont démontré que let-7F se lie directement à la 3'UTR de MYH9, qui code pour la myosine IIA et PCR en temps réel et Western blot en outre indiqué que let-7f downregulated l'expression de la myosine IIA au niveau des ARNm et de protéines .

Conclusions /importance

Notre étude a démontré que la surexpression de laisser-7f dans le cancer gastrique pourrait inhiber l'invasion et la migration des cellules de cancer gastrique en ciblant directement l'MYH9 gène tumeur métastase associée. Ces données suggèrent que let-7f peut être candidat thérapeutique pour le cancer gastrique, compte tenu de sa capacité à réduire l'invasion cellulaire et la métastase

Citation:. Liang S, Il L, Zhao X, Miao Y, Gu Y, C Guo et al. (2011) microARN Laissez-7f inhibitions Invasion tumorale et les métastases en ciblant MYH9 dans le cancer gastrique humain. PLoS ONE 6 (4): e18409. doi: 10.1371 /journal.pone.0018409

Editeur: Donald Gullberg, Université de Bergen, Norvège

Reçu le 27 Septembre 2010; Accepté: Mars 7, 2011; Publié le 18 Avril, 2011

Droit d'auteur: © 2011 Liang et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Cette étude a été soutenu par la national science Foundation naturel de la Chine (n ° 30801330, n ° 30871143, n ° 81030044)) et le Programme national de recherche fondamentale de la Chine (n ° 2010CB529300, n ° 2010CB529306). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

le cancer gastrique (GC) est le cancer gastro-intestinal le plus fréquent en Asie de l'est, Europe de l'est, et certaines parties de l'Amérique centrale et du Sud, et est la deuxième principale cause de décès liés au cancer [1]. métastase généralisée a été une des principales raisons pour le résultat lamentable des patients du GC. Métastase est un processus complexe en plusieurs étapes dans lequel les cellules cancéreuses migrent de la tumeur primaire à un endroit éloigné [2]. Le processus commence lorsque les cellules tumorales primaires envahissent les tissus adjacents, suivie par les cellules qui entrent dans le flux sanguin (intravasculaire), translocation à travers la vasculature, sortant des vaisseaux sanguins (extravasation) dans le parenchyme tissu environnant, initiant micrométastases et proliférant finalement pour former macroscopique secondaire tumeurs [3]. L'un des régulateurs critiques impliqués dans ce processus est un microARN (miARN) [4].

Les microARN (miARN) sont une classe d'ARN endogènes et petits non codantes réglementaires, qui régulent les gènes au post niveau de la transcription [5]. miARN mature peut être transcrit par l'ARN polymérase II et sont générés à partir du traitement séquentiel des primaires transcriptions de miARN par Drosha et Dicer; ils servent alors les régulateurs comme post-transcriptionnels de l'expression des gènes par appariement de bases complémentaire à ARN messagers [6]. De nombreux rapports indiquent que les miARN jouent un rôle clé dans divers processus biologiques, y compris la différenciation cellulaire, la prolifération, l'apoptose, la résistance au stress, le métabolisme des lipides, la tumorigenèse et les métastases tumorales [7], [8], [9].

La famille let-7 est une famille conservée de miARN. Laissez-7 a été initialement observée dans les elegans nématode Caenorhabditis [10], et quatorze membres ont été trouvés à ce jour [11]. Récemment, les niveaux de nombreux membres de let-7-famille expression se sont avérés être réduits dans une variété de cancers. Par exemple, disons-7 est downregulated dans le cancer du poumon, le mélanome, et de la tête et du cou carcinome malpighien, tandis que la surexpression de let-7 peut inhiber la croissance des cellules cancéreuses [12], [13], [14], [15], [16 ], [17], [18]. Plusieurs oncogènes, tels que RAS, MYC et HMGA2, sont des cibles directes de let-7 [19], [20], [21]. Laissez-7f est un membre de la famille let-7. Des études antérieures ont montré que let-7f est régulée à la hausse dans le cancer du sein primaire et favorise l'angiogenèse [22]; la régulation négative de l'HTAP [23] a été provoquée par une hypoxie chronique ou de monocrotaline chez le rat, et le niveau a été réduit dans des vésicules de plasma de patients atteints de NSCLC [24]. De plus, laissez-7f peut affecter la prolifération cellulaire en ciblant peptidases kallicréine liées (KLKs), une famille de sérine protéases qui ont été montrés pour être dérégulée dans plusieurs tumeurs malignes, y compris le cancer de l'ovaire [25].

Notre laboratoire ont déjà identifié un groupe de miARN exprimés de manière différentielle entre GC9811 et GC9811 cellules-P par le biais de haut-profil microRNA puce analyses qui contiennent let-7f [26]. Au cours de la caractérisation plus poussée de let-7f dans diverses lignées de cellules cancéreuses, on a trouvé que les fonctions de let-7f comme suppresseur de métastases. L'expression accrue de laisser-7f peut supprimer l'invasion des cellules GC et la migration in vitro et in vivo. Par l'analyse bioinformatique, nous avons constaté que MYH9, qui code pour une chaîne lourde de la myosine IIA impliquée dans la promotion de la migration des cellules cancéreuses ou d'invasion, comme une cible de let-7f putatif. Des expériences ultérieures ont confirmé que let-7f peut réguler négativement l'expression de myosine IIA en ciblant la 3'UTR de MYH9, qui fournit une cible possible pour le traitement de la GC.

collection de tissus
Matériels et Méthodes

tissus tumoraux gastriques primaires, les tissus gastriques non tumorales adjacentes et les tissus gastriques métastatiques éloignés ont été obtenus chez des patients ayant subi une chirurgie à l'hôpital Xijing de maladies digestives à Xi'an, en Chine. Tous les échantillons ont été cliniquement et pathologiquement révélés être correctement étiquetés. Les patients qui offrent des échantillons pour l'étude ont signé des formulaires de consentement éclairé.

culture
Cell

Les lignées cellulaires de cancer gastriques humaines GC9811, GC9811-P, SGC7901-NM, SGC7901-M ont été conservées dans notre propre laboratoire et ont été cultivées dans du RPMI1640 (Hyclone), complémenté avec 10% de sérum bovin foetal. (FBS; Gibco), 100 unités /ml de pénicilline et 0,1 mg /ml de streptomycine à 37 ° C dans un humidifiée à 5% de dioxyde de carbone incubateur

extraction de l'ARN et en temps réel
PCR

qRT-PCR a été effectuée pour déterminer les niveaux de gènes potentiels cibles laissez-7F expression. L'ARN total a été extrait à partir de tissus ou de cellules cultivées en utilisant le réactif TRIZOL (Invitrogen Life Technologies). ADN complémentaire (ADNc) a été généré en utilisant un kit de transcription inverse TaqMan (Applied Biosystems). Des analyses PCR en temps réel ont été effectuées avec un kit TaqMan micro-ARN Assay (Applied Biosystems). Primer de let-7F a été acheté chez Ambion (MI0000437). Primer de la séquence MYH9 a été conçu à l'aide du logiciel Primer Express (version 1.5). La séquence de l'amorce-MYH9: (Forward) 5'AGAGCTCACGTGCCTCAACG3 'protocoles (marche arrière) 5'TGACCACACAGAACAGGCCTG3'.All ont été effectués selon les instructions du fabricant. Le niveau de 7f let-expression a été normalisée à 5S (Forward: 5'GATTGAATCGAGCACCAGTTAC3 ';

Reverse: 5'GTCTACGGCCATACCACCCTGAAC3'). Le niveau de MYH9 d'expression était to18S normalisés (Forward: 5'CGGCTACCACATCCAAGGAA3 ';

Reverse: 5'GCTGGAATATCCGCGGCT3') PCR et de collecte de données ont été effectuées sur un iCycler (Bio-Rad).. Chaque échantillon a été exécuté en triple

constructions vectorielles et

La séquence-let-7f pri a été construit comme suit de Lentivirus Production:. (Forward) hsa-let-7F-1-Xho IF GGGCCCGCTCTAGACTCGAGATATTTGCATGTCGCTATGTG , (marche arrière) hsa-let-7F-1- BamH IR CGCGGCCGCCTAATGGATCCAAAAAAGGCACAGTCGAGGCTGATC. La séquence a été amplifié et clone dans le vecteur GFP-pGCsil (Genechem) pour générer pGCsil-GFP let-7f. Contrôle négatif était pGC FU-RNAi-NC-LV. l'emballage du virus a été réalisée dans des cellules HEK 293T après la co-transfection de 20 ug pGCsil-GFP-let-7f vecteur avec 15 pg de l'emballage plasmide pHelper 1,0 vecteur et 10 ng du plasmide d'enveloppe pHelper 2,0 vecteur en utilisant la Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Les virus ont été récoltées 48 h après la transfection, et les titres viraux ont été déterminés.

Construction de Oligonucleotide

let-7f imite, laissez-7f inhibiteur et oligonucléotides siARN de contrôle négatif ont été chemosynthesized (Shanghai GenePhama Co., Ltd). Les oligonucléotides utilisés dans ces études étaient mime a-let-7F: 5'UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU3'and 5'CUAUACAAUCUACCUCAUU3 ';

Mimics contrôle négatif: 5'UUCUCCGAACGUGUCACGUT3'and5'ACGUGACACGUUCGGAGAATT3', a 7f-let inhibiteur: 5'AACUAUACAAUCUACUACCUCA3 '. MircoRNA inhibiteur contrôle négatif: 5'CAGUACUUUUGUGUAGUACAA3 '

Cellule transfection

Les cellules ont été cultivées à 80% à 90% de confluence après avoir été ensemencées dans des plaques 6 puits et ont été transfectées avec Lipofectamine 2000 (Invitrogen. , Carlsbad, CA) selon les instructions du fabricant. Pour la transfection transitoire, les cellules dans chaque puits d'une plaque de 6 puits ont été transfectées avec un inhibiteur de miARN 12,5 pi ou 7,5 pi miRNA oligonucléotides imiter. Après 48 heures de transfection, les cellules ont été récoltées pour une expérimentation ultérieure. Pour les cellules transfectées de façon stable, les cellules ont été transfectées avec des lentivirus à 30% -50% de confluence. Les cellules cibles (1 x 10 ^{4), comprenant GC 9811-P et les cellules SGC7901-M, ont été infectés avec 1 x 10 6 unités de lentivirus transduire recombinant en présence de 6 pg /ml de polybrène (Genechem) .}

test d'invasion

La capacité invasive des cellules a été testée en utilisant Transwell (taille des pores de 8 um de Corning Costar Corp.). Les Transwells ont été mis dans les plaques à 24 puits. Tout d'abord, 0,1 ml de Matrigel (50 ug /ml, BD Biosciences) a été ajouté sur la surface de la plaque et mises en incubation pendant 2 h, puis le surnageant a été éliminé. cellules fraîchement trypsinisées et lavées (GC9811, GC9811-p, SGC7901-NM, SGC7901-M) ont été suspendues en RPMI1640 contenant 1% de sérum fœtal bovin. Ensuite, 100 ul de la suspension de cellules (1 x 10 ^{5 cellules) ont été ajoutés à la chambre supérieure de chaque pièce rapportée qui a été revêtue avec du Matrigel. Ensuite, 450 pi de RPMI 1640 contenant 10% de sérum de veau fœtal a été ajouté dans le compartiment inférieur, et les cellules ont été autorisées à envahir pendant 24 h-48 h à 37 ° C dans un CO à 5% _{2 incubateur humidifié. Après incubation, les cellules ont été fixées avec de l'alcool absolu à 95% et colorées avec du cristal violet. Les cellules sur la surface supérieure du filtre ont été éliminés avec le coton-tige et les cellules qui avaient envahi dans la surface inférieure du filtre ont été comptées et imagées sous un microscope inversé (Olympus Corp., Tokyo, Japon) à × 200 grossissement sur dix aléatoire champs dans chaque puits. Chaque expérience a été réalisée en triple.}}

La migration cellulaire

La capacité des GC9811, GC9811-P, SGC7901-NM, et les cellules SGC7901-M à migrer a été détectée en utilisant Transwells [8 pm pore taille, Corning Costar Corp]. Les Transwells ont été mis dans les plaques à 24 puits. Fraîchement trypsinisées et cellules lavées en suspension dans RPMI 1640 contenant 1% de sérum bovin foetal. 5 × 10 ^{4 cellules /puits ont été placés dans la chambre supérieure de chaque insert (BD Biosciences, NJ), avec la membrane non revêtue. 450 pi de RPMI 1640 contenant 10% de sérum de veau fœtal ont été ajoutés dans les chambres inférieures. Après incubation pendant 24 h-48 h à 37 ° C dans un 5% de CO _{2 incubateur humidifié, les cellules ont été fixées avec de l'alcool absolu à 95% et colorées avec du cristal violet. Les cellules dans la chambre intérieure ont été enlevées avec un coton-tige et les cellules fixées à la face inférieure de la membrane ont été comptées et imagée sous un microscope inversé (Olympus Corp., Tokyo, Japon) à × 200 grandissement plus de dix champs au hasard dans chaque puits . Chaque expérience a été réalisée en trois exemplaires.}}

in vivo les métastases dosage

Pour les essais in vivo les métastases, les lignées cellulaires stables GC9811-P et SGC7901-M ont été récoltées à partir de flacons de culture tissulaire après transfection avec le lentivirus pGCsil-let-7f GFP et le contrôle pGCsil-GFP en utilisant de la trypsine et lavées trois fois avec du PBS. Puis 2 x 10 ^{6 cellules ont été mises en suspension dans 0,2 ml de RPMI 1640 sans sérum pour chaque souris (six dans chaque groupe, Fale BALB /c-nu /nu, 6-8 semaines d'âge), et les cellules ont été injectées dans le veine de la queue. Au bout de quatre semaines après l'injection, les souris ont été sacrifiées. Le tissu hépatique a été observée à l'oeil nu, et le nombre de tumeurs visibles dans la surface du foie a été compté. Les tissus du foie ont été divisés en des sections en série, fixées avec de la formaline neutre tamponnée au phosphate, colorées à l'hématoxyline et à l'éosine et examinés histologiquement. Les souris nues ont été manipulés et pris en charge selon les NIH et soin des animaux Utilisation Comité des lignes directrices dans l'expérience Animal Center de la quatrième université médicale militaire (Xi'an, province du Shanxi, République populaire de Chine).}

Luciferase Reporter Assay

Afin de déterminer si l'expression de MYH9 était réglementée par let-7f, un essai à double luciférase journaliste a été effectuée. 3 'UTR de MYH9 contenant let-7f site de liaison a été amplifié par PCR. Amplification de MYH9 utilisé les amorces suivantes: (Forward) XhoIF: 5'CCGctcgagGCCTCTTCTCCTGCAGCCTG 3 '(marche arrière) NotIR: 5'ATAAGAATgcggccgcTCGTAGCACATGGTTCTCTTTATTG 3'

En tant que témoin négatif, le site de liaison mutée de la séquence 3 'UTR (en utilisant le complément inverse du site de liaison) a été amplifié en utilisant les amorces: (Forward) mutlet7MYH9F: 5'TTGCAATCACACGTGGTGTGGAGTCACACCTCTGCCCCTTGG3 '(marche arrière) mutlet7MYH9R: 5'CCAAGGGGCAGAGGTGTGACTCCACACCACGTGTGATTGCAA 3'. Les produits ont été récupérés par électrophorèse sur gel d'agarose et clones dans le vecteur rapporteur PsiCHECK luciférase (Promega, Madison, WI). Toutes les constructions ont été vérifiées par séquençage. Se connecter cellules en phase GC9811-P ont été ensemencées dans des plaques à 24 puits et cotransfectées avec des inhibiteurs de Let-7f ou le contrôle, et les reporters de luciférase en utilisant Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen), en suivant les instructions. Après 48 heures d'incubation, luciole et la luciférase de Renilla a été mesurée avec le système de dosage de rapporteur de luciférase double (Promega).

Western Blot

Les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS glacé et gratté en un tampon RIPA (50 mM de Tris-HCl pH 7,4, 1% (v /v) de Triton X-100, 1 mM d'EDTA mM, leupeptine 1, fluorure de phénylméthylsulfonyle 1 mM, NaF 10, 1 mM Na3VO4) fraîchement ajouté cocktail inhibiteur de protease (Roche) pendant 15 minutes sur de la glace, puis on centrifuge à 13 000 tpm pendant 10 minutes et les surnageants ont été recueillis. Dix microgrammes de chaque échantillon ont été résolus en utilisant 6% de SDS-PAGE et transférés sur une membrane de nitrocellulose (Bio-Rad, Hercules, CA). Les bandes ont été incubées avec 10% de lait écrémé sec dans du tampon Tris-solution saline 0,1% de Tween-20 pour bloquer les sites de liaison non spécifiques et incubées avec un anticorps primaire: polyclonal de lapin anti-humain de la myosine II (dilué 1:500; Cell Signaling Technology ) pendant la nuit à 4 ° C. Après le réchauffement et le lavage répété trois fois, 15 minutes pour chacun, les membranes ont été incubées avec un anticorps anti-lapin secondaire raifort conjuguée à la peroxydase (Santa Cruz Biotechnology), dilué 1:2000 pendant deux heures à la température ambiante. Les bandes ont été détectées en utilisant un système de chimioluminescence amélioré (Amersham Biosciences).

immunohistochimie

Deux tableaux de tissus ont été achetés chez SHANXI Chaoying BIOTECHNOLOGIE CO., LTD. L'un était un tissu de cancer de l'estomac et des tissus appariés de l'estomac normal adjacent, l'autre tissu de cancer gastrique et identifié des ganglions lymphatiques métastatiques matrices .Tissue ont été déparaffinée à 60 ° C pendant 2 h, la récupération de l'antigène à haute température pendant 10 minutes, réhydratés, mises en incubation dans 10% sérum de chèvre normal pendant 1 h, puis incubés avec le lapin polyclonaux anti-humain myosine II A (dilué 1:100; Cell Signaling Technology) pendant la nuit à 4 ° C. Les lames ont été lavées dans du PBS trois fois pendant 5 minutes chacune. Les tissus ont été incubées dans un anticorps de chèvre anti-sérum de lapin (DAKO) pendant 1 h, on rince avec du PBS. Les sections ont été détectées en utilisant DAB et de contraste avec l'hématoxyline. L'intensité de la coloration a été marqué en utilisant une échelle en quatre étapes (0, 1+, 2+ ou 3+) et le pourcentage de cellules positives a été estimé par trois pathologistes différents (0 = Aucun, 1 = < 1%, 2 = 1 -10% 3 = 10 à 30%, 4 = 30 à 70%, 5 = > 70% des cellules tumorales). Total des scores moyens ont ensuite été regroupées en quatre catégories: négatif (aucune coloration détectable lorsqu'il est évalué par rapport à la coloration de fond non spécifique, faible (+), modérée (++) ou forte (+++) et comparés en utilisant le test de Mann-Whitney

Analyse statistique

test t de Student (bilatéral), One-way ANOVA et test de Mann-Whitney ont été utilisées pour analyser in vitro et in vivo en utilisant le logiciel SPSS 12.0 (Chicago, IL , États-Unis) P valeur <. 0,05 a été définie comme étant statistiquement significative * P
<. 0,05; ** P
<. 0,01

Résultats

Le niveau d'expression let-7F a souvent diminué en GC humaine des lignées de cellules métastatiques et les tissus

Nous avons examiné les niveaux de laisser-7f d'expression de l'ARNm dans deux paires de lignées cellulaires de cancer gastrique humain, GC9811, GC9811 -P et SGC7901-NM, SGC7901-M. Comme le montre la figure 1A, l'expression de let-7f était plus faible dans les cellules du GC, GC9811-P et SGC7901-M, avec un potentiel métastatique élevé, alors laissez-7F a été plus fortement exprimé dans les cellules du GC, GC9811 et SGC7901-NM, avec un faible potentiel métastatique. Afin de valider le rôle de laisser-7f dans gastrique cellules cancéreuses métastases, nous avons comparé les niveaux d'expression de laisser-7f dans des échantillons gastriques humains frais de tissus cancéreux avec métastases à partir de huit personnes (tableau S1), aux tissus gastriques normaux (NG), primaire tissus gastriques cancéreuses (GC) et des tissus éloignés métastases cancéreuses gastriques (MC), respectivement, par PCR en temps réel. Curieusement, il a été remarquable régulation négative de laisser-7f dans MC et GC, par rapport à let-7f expression dans NG (figure 1B). Nous avons observé que soit la perte ou diminution de l'expression de laisser-7f dans les tumeurs et les tissus métastatiques ont abouti à une meilleure métastases dans les tissus de cancer gastrique. Les résultats suggèrent tous que l'expression de 7f let a été négativement corrélé étroitement avec métastases GC a diminué et pourrait jouer un rôle essentiel dans les processus pathologiques. Nous avons donc fourni des preuves conceptuelle clinique et cellulaire pour un commutateur métastatique dans le développement du cancer qui suggère un rôle clé pour l'expression de laisser-7f dans le développement du cancer.

Laissez-7F a inhibé les capacités invasives et métastatiques de cellules GC in vitro

Parce que let-7f agit comme un agitateur dans l'invasion et les processus métastatiques, nous avons étudié les effets de la diminution de laissez-7f sur des lignées cellulaires moins métastatiques et l'augmentation de laissez-7f sur des lignées cellulaires plus métastatiques. Pour ce faire, petit ARN interférent (siRNA) oligonucléotides de let-7f ont été construits et introduits dans les cellules GC9811 et les cellules SGC7901 -nm pour les essais de métastases in vitro, comme GC9811-let-7f-siRNA cellules, SGC7901-NM-let-7f -siRNA des cellules et des cellules de contrôle. Parallèlement, synoptique permettent-7F oligonucleotides témoins et négatifs ont également été construits et introduits dans les cellules GC9811-P et les cellules SGC7901-M pour les essais de métastases in vitro, comme GC9811-P-let-7F-miment cellules, SGC7901-N-a laissé et des cellules de contrôle -7f-mimétique. Déplétion de let-7f significativement atteinte à la capacité des cellules à migrer et GC9811 envahir à travers les membranes revêtues matrigel ou des membranes non revêtue de Matrigel dans un dosage vers la chambre de Boyden modifiée milieu contenant du sérum (figure 2A). Une expression accrue de let-7f supprimée de manière significative la capacité des cellules GC9811-P à migrer et à envahir à travers des membranes matrigel enrobées ou des membranes non matrigel revêtues vers un milieu contenant du sérum dans une chambre de dosage de Boyden modifiée (figure 2B), par rapport à les cellules témoins. Des résultats similaires ont été trouvés dans les cellules SGC7901-NM (figure 3A) et les cellules SGC7901-M (figure 3B), alors laissez-7f KO dans des lignées cellulaires de GC a entraîné une hausse invasion et de migration des taux.

inhibe Laissez-7F invasion tumorale et les métastases dans un modèle de xénogreffe de souris nude

GC9811-P ou les cellules tumorales SGC7901-M transfectées avec le lentivirus pGCsil-GFP contrôle let-7f ou négative pGCsil-GFP ont été injectées dans des souris nues et les souris ont été sacrifiés quatre semaines après les inoculations. Le nombre de métastases nodi a été considérablement réduite dans les souris nude injectées avec des cellules transfectées let-7f pGCsil-GFP, par rapport aux témoins négatifs (figure 4A, 4B). Ces données fournissent des preuves solides que let-7f peut inhiber l'invasion tumorale et les métastases in vivo.

Laissez-7f myosine IIA expression entraîne la régulation négative en ciblant directement son
3 'UTR

Pour explorer davantage le mécanisme par qui nous-7f supprime l'invasion de GC et les métastases, nous avons analysé la tumeur en aval des gènes cibles liées métastases potentielles in silico. Nous nous sommes concentrés sur les gènes cibles laissez-7F, en particulier les gènes qui étaient la migration et /ou liées à l'invasion, et a constaté que la myosine IIA, impliqué dans la promotion de la migration des cellules cancéreuses ou d'invasion, pourrait être le gène cible de 7f let. Dans un effort pour déterminer si la myosine IIA est réglementée par let-7f par liaison directe à son extrémité 3 'UTR, nous avons construit pleine longueur de type sauvage et des fragments mutants de MYH9 ARNm 3' UTR, et inséré dans la région immédiatement en aval de un gène rapporteur de la luciférase (figure 5A). Par la suite, oligos miment let-7f ont construit co-transfectées avec la luciférase différente 3 'UTR en cellules GC9811-P. Nous avons constaté que let-7F a diminué l'activité de la luciférase par rapport au type sauvage 3 'UTR de MYH9 (figure 5B). Cependant, l'activité de la luciférase n'a pas laissé tomber brusquement dans les UTR avec des sites de liaison de mutants, par rapport aux contreparties de type mut (Figure 5C). Ces données confirment que MYH9 est la cible directe de laisser-7f.

RT-PCR a montré que l'expression de MYH9 dans les cellules GC9811 et les cellules SGC7901-NM transfectées avec let-7F-mime est downregulated par rapport à ces cellules transfectées avec des constructions de commande (figure 5D). résultats de Western blot ont montré l'expression de la myosine IIA dans GC9811 et les cellules SGC7901-NM transfectées avec let-7F-mimétiques sont régulés à la baisse par rapport à celles transfectées avec un contrôle négatif (Figure 5E). Furthmore, la PCR en temps réel montre que l'expression d'ARNm relative de MYH9 dans les tissus et les tissus GC métastases à distance est régulée à la baisse par rapport à leurs échantillons non cancéreux adjacents normaux (figure 6A). L'immunohistochimie a montré que l'expression de la myosine II dans GC métastases ganglionnaires est régulée à la hausse par rapport à son tissu primaire GC (tableau 2; figure 6C; figure S1B) et elle est régulée à la hausse dans les tissus GC par rapport à son estomac normal adjacent apparié tissus (tableau 1; Figure 6B; Figure S1A) .Ces données démontrent que let-7f peut réguler à la baisse l'expression de l'ARNm de MYH9 et peut réprimer la traduction de celui-ci de la protéine

Discussion

. la présente étude, nous avons démontré que l'expression let-7f dans des lignées cellulaires de GC métastatique a été régulée à la baisse par rapport à let-7f expression dans les cellules GC non métastatiques. L'expression ectopique et siRNA knockdown de let-7F a confirmé son activité d'invasion de suppression in vitro et in vivo. De plus, nous montrons que MYH9 est une cible directe de let-7f et cette suppression let-7f médiée MYH9 dépend de son extrémité 3 'UTR. Par conséquent, ces résultats mettent en évidence l'importance de laisser-7f comme un suppresseur de tumeur dans l'invasion cellulaire et la métastase en ciblant MYH9 dans le cancer gastrique.

Des études récentes montrent que les miARN peuvent agir comme activateurs ou inhibiteurs de métastases tumorales [27] . Par exemple, les microARN-10b [28], miR-373 et miR-520c [29], [30] ont stimulé la migration des cellules cancéreuses et l'invasion du cancer du sein. En outre, miR-155 peut favoriser l'invasion tumorale et les métastases dans le cancer du sein par la régulation négative de sa cible, RhoA [31] et de favoriser l'invasion tumorale et les métastases dans le cancer du pancréas conduit en réprimant l'expression de TP53INP1 [32]. Le miARN-200 famille (miRNA-200a, miRNA-200b, miRNA-200c, miRNA-141 et miARN-429) peut inhiber l'invasion tumorale et les métastases en régulant l'EMT [33]. MiR-126 a été trouvée pour inhiber l'adhésion cellulaire, la migration et l'invasion partiellement par la suppression de CRK dans un modèle in vitro de carcinome pulmonaire non à petites cellules [34]. Il a été démontré que miR-29c est significativement réduite dans le carcinome nasopharyngé très invasive et métastatique [35]. MiR-218 inhibe l'invasion et les métastases du cancer gastrique en ciblant le récepteur Robo1 [26]. Bien que de nombreuses études ont été réalisées pour étudier le mécanisme des miARN et des métastases de la tumeur, le mécanisme n'a pas été clair. Plus important encore, peu d'études ont été faites sur les mécanismes de régulation GC métastase par microARN.

Le gène let-7f est situé à 9q22.3, et est impliqué dans une variété de processus physiologiques et pathologiques, y compris l'angiogenèse [36], immunocytes différenciation [37], sénescence réplicative [38], arrêt de la croissance [39], l'hypertension artérielle pulmonaire et la carcinogenèse [23]. Laissez-7f est downregulated dans plusieurs tumeurs malignes. Un exemple très caractérisé est le carcinome à cellules rénales, dans lequel laissez-7f downregulation conduit à une diminution significative de la kallicréine (KLK) expression [40]. KLKs peut également être ciblée par let-7f dans le cancer de l'ovaire [25]. Dans le cancer papillaire de la thyroïde, une expression réduite de let-7f pourrait être un événement moléculaire essentiel dans RET /PTC transformation maligne [41]. Dans le cas du cancer primaire du sein, toutefois, let-7f a été régulée à la hausse par rapport aux tissus adjacents normaux tumorales [22]. Dans notre étude, nous avons démontré que let-7f est également downregulated dans les tissus MC et des lignées cellulaires GC avec un potentiel métastatique élevé, et nous avons exploré davantage le mécanisme par lequel let-7f invasion tumorale réduite et les métastases.

MYH9 est le gène de la myosine non musculaire chaîne lourde IIA (NMHCIIA), dont les mutations sont responsables d'un trouble complexe appelé maladie MYH9 liée, caractérisé par une combinaison de différentes caractéristiques phénotypiques [42]. NMMHC-AII, un polypeptide de 1960 acides aminés, avec un poids moléculaire de 220 kDa traduit, est un myosine classique, non-sarcomérique exprimée dans la plupart des cellules et des tissus. Ses fonctions incluent des rôles dans la cytokinèse, la motilité cellulaire, et le maintien de la forme des cellules [43]. De nombreuses études suggèrent que MYH9 /NMHC-IIA a un rôle clé dans la cellule tumorale invasive behavior.For exemple, la phosphorylation de EGF dépendante de la chaîne lourde de la myosine IIA a un rôle direct dans la médiation de la motilité et la chimiotaxie dans MDA-MB-231 humaine cellules de cancer du sein [44]. Myosine II semble être une cible cellulaire majeur de MTS1 [45], la petite protéine de liaison du calcium metastasin-1 et co-localise avec MTS1 au bord d'attaque de la migration des cellules cancéreuses [46]; MTS1 influences à la fois le comportement de l'ensemble de la myosine IIA et sa phosphorylation [47], [48]. Un rapport récent implique MYH9 (NMHC-IIA) comme une cible de SRF, ce qui contribue à l'invasion et les métastases dans le cancer du sein [49]. Nos données montrent que MYH9 est la cible directe de laisser-7F, qui inhibe l'invasion et les métastases en liant le 3'UTR de MYH9, qui a abouti à la régulation négative de l'expression de la myosine IIA.

En conclusion, notre étude démontre que let-7f peut supprimer l'invasion et la métastase du cancer gastrique par lie directement la 3'UTR de MYH9, sa cible. Bien qu'il y ait encore beaucoup à apprendre sur le rôle de laisser-7f dans la tumorigenèse du cancer gastrique, laissez-7f nous offre une nouvelle cible potentielle pour le traitement du cancer gastrique.

Informations complémentaires
Figure S1.
L'expression de MYH9 dans des échantillons de tumeurs gastriques. (A) Expression de MYH9 dans le cancer gastrique primaire (Ca) et le tissu de l'estomac normal adjacent (N) par IHC. (B) Expression de MYH9 dans le cancer gastrique primaire (Ca) et son lymphe appariés métastases ganglionnaires tissu (M) par IHC
doi:. 10.1371 /journal.pone.0018409.s001
(TIF)
Table S1.
clinicopathologique dispose dans 8 échantillons frais de tumeurs gastriques.
doi:. 10.1371 /journal.pone.0018409.s002
(DOC)

Remerciements

Nous sommes reconnaissants à Zheng Chen pour d'excellents conseils pendant l'expérience

• PLOS ONE: oncogènes CagA Favorise gastrique risque de cancer via Activation ERK voies de signalisation: emboîtée Case-Control Study
• PLOS ONE: Wnt /β-caténine Signaling Améliore Cyclooxygenase-2 (COX2) transcriptionnelle L'activité dans le cancer gastrique Cells