PLoS ONE: Histono deacetilazės HDAC4 Skatina skrandžio vėžio SGC-7901 ląstelių vystymąsi per p21 represijų

Anotacija

Skrandžio vėžys (GC) yra viena iš pagrindinių priežasčių, vėžio mirties pasaulyje. buvo nustatyta iš Histonas deacetilazės 4 (HDAC4) konkrečiose ląstelių ir audinių tipų vaidmuo. Tačiau jos biologiniai vaidmenis skrandžio vėžio vystymąsi daugiausia lieka neištirta. Kiekybinis realaus laiko PGR (KRL-PGR) ir Vakarų dėmė buvo naudojami analizuoti HDAC4 išraišką klinikiniuose mėginiuose. siRNR ir padidėjusią HDAC4 ir siRNA p21 buvo naudojami tyrimo funkcinių pasekmes kitoje platinimu, kolonija susiformavimo, adenozino 5'-trifosfato (ATP) tyrimas ir reaktyviųjų deguonies formų (ROS) karta, ląstelės ciklo, ląstelių Apoptozė normos ir autofagija tyrimai. HDAC4 buvo iki reguliuojama skrandžio vėžio audiniuose ir kelių skrandžio vėžio ląstelių linijas. Platinimas, kolonija formavimas sugebėjimas ir ATP lygis buvo sustiprintas HDAC4 raiška SGC-7901 ląstelių, bet slopinamas HDAC4 triuškinantis SGC-7901 ląstelių. HDAC4 nokdaunas buvo G0 /G1 fazės ląstelių suėmimo ir sukėlė apoptozę ir ROS padidėjimą. Be to, HDAC4 buvo nustatyta, kad slopina P21 išraišką skrandžio vėžio SGC-7901 ląstelių. P21 nokdaunas gerokai susilpnintas ląstelių proliferaciją slopinimas, ląstelinio ciklo suėmimą, ląstelių apoptozę skatinimo ir autofagija iki-reglamento HDAC4-siRNA SGC-7901 ląstelių. Mes parodė, kad HDAC4 skatina skrandžio vėžio ląstelių progresavimą tarpininkauja p21 represijų. Mūsų rezultatai pateikti eksperimentinį pagrindą suprasti PRO-naviko mechanizmą HDAC4 gydyti skrandžio vėžio

nurodomoji dalis:. Kanas Z O Wang, C-Y Zhang W L Zhang J-T juanių, C-O Zhao P-W ir kt. (2014) Histono deacetilazės HDAC4 Skatina skrandžio vėžio SGC-7901 ląstelių vystymąsi per p21 represijų. PLoS ONE 9 (6): e98894. Doi: 10,1371 /journal.pone.0098894

redaktorius: Wei Guo Zhu, Pekino universiteto Sveikatos mokslų centras, Kinija

Įstojo: Vasario 12, 2014; Priėmė 8 Gegužė 2014 m Paskelbta: Birželis 4, 2014

Visos teisės saugomos: © 2014 Kang et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis darbas parėmė dotacijos iš sveikatos departamento Jilin provincijoje (Nr 2012z119). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys (GC) yra ketvirtoji dažniausia piktybinių navikų ir antroji pagrindinė priežastis, dėl vėžio mirties visame pasaulyje [1]. Azijos ir Pietų Amerikos šalys turi didesnę sergamumo GC nei Jungtinėse Valstijose ir Vakarų Europoje [2]. Dauguma tikslinės terapijos dėmesio kraujagyslių endotelio augimo faktoriaus (VEGF) ir epidermio augimo faktoriaus receptoriaus (EGFR) Susiję nuorodų Išplėstinė GC. Junginiai prieš naujų užduotis, pavyzdžiui, mTOR [3], c-Met (hepatocitų augimo faktoriaus receptoriaus) [4], ir HDACs, yra taip pat pagal tyrimą.

Histono deacetilazės 4 (HDAC4), kuris yra klasės IIa HDAC, yra žinoma, kad egzistuoja skirtingi transkripcijos corepressor kompleksų. HDAC4 yra kritinis komponentas atsako DNR pažeidimai keliu, kuris veikia per 53BP1 [5]. HDAC4 malšina, kad ciklino priklausoma kinazės inhibitorius p21 (taip pat žinomas kaip p21WAF1 /CIP1) žmogaus vėžinių ląstelių išraiška per SP1 priklauso, p53 nepriklausomas mechanizmas [6]. HDAC4 skatina storosios žarnos vėžinių ląstelių augimą per represijas p21 [7]. Nukenksminimą HDAC4 pagal sirnr ar HDAC inhibitorių slopina neuronų ląstelių mirtį [8].

iš HDAC4 į specifinių ląstelių (HeLa (gimdos kaklelio vėžio), U373 (glioma), ovčar (kiaušidžių), T98G vaidmuo ( gliomos), HCT116 (tiesiosios žarnos), Nha (astrocitų) ir SKBR3 (krūtų)) ​​ir audiniai (smegenų žievės, sėklidžių, prostatos, o epidermio sluoksnis iš odos) tampa vis labiau aišku, [9]. Tačiau, pastarosios reakcijos tikslus mechanizmas HDAC4 skrandžio vėžio nebuvo nustatytas. Todėl, šio tyrimo tikslas buvo pirmiausia įvertinti ekspresijos lygį HDAC4 į žmogaus skrandžio vėžio audiniai ir ląstelių linijos. Antra, HDAC4 poveikis skrandžio vėžio ląstelių linijų buvo tiriama naudojant raiška ir triuškinantis. Galiausiai, mes ištirti, ar HDAC4 turėjo santykius su p21 skrandžio vėžio ląsteles. Kartu, mūsų tikslas buvo rasti ar HDAC4 turi biologinį vaidmenį GC plėtros ir išsiaiškinti, sukeliančiam mechanizmui.

Medžiagos ir metodai

Audinių mėginiai

Dvidešimt devyni suporuotas pirminės skrandžio karcinomos audiniai ir tolimi normalus skrandžio audiniai buvo renkami iš pacientų (amžius: 58.46 ± 9.17 metų) atliekant įprastinius terapinio chirurgijos departamento virškinimo trakto operacija, Pirmosios ligoninės Jilin universitetas. Visi mėginiai buvo gauti informuoto asmens sutikimą pagal Helsinkio deklaraciją ir žmogaus etikos komiteto Pirmosios ligoninės Jilin universiteto ir Jilin universitetas, Kinija patvirtintas. Parašė informuotas sutikimas buvo gautas iš visų dalyvių.

Mobilaus ryšio linijų ir kultūra

žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijas SGC-7901, AGS, ir BGC-823 ir normalus skrandžio epitelio ląstelių linija GES buvo gauti iš Amerikos tipinių kultūrų kolekcijoje (Manassas, VA) ir kultivuojamos RPMI 1640 vidutinės su 10% vaisiaus galvijų serumo temperatūroje drėgnoje atmosferoje 5% CO _{2 37 ° C temperatūroje.}

Stabilus transfekuota ląstelių linijos ir trumpalaikis transfekcija

pilnametražis HDAC4 fragmentas sustiprino atvirkštinės transkripcijos PGR iš GES ląstelių naudojant specifinius pradmenis, kaip aprašyta anksčiau [10] ir įdėta į BamH I ir Hind III vietų pcDNA3.1 (+ ) (Klontex Hampshire, Jungtinė Karalystė). PcDNA3.1 (+) - HDAC4 plazmidė buvo patikrinti sekos analizės patvirtinti, kad mutacijų nebuvimą. SGC-7901 ląstelės buvo pasėjamos į 6-duobučių lėkštelėse ir transfekuota pcDNA3.1 (+) - HDAC4 ir pcDNA3.1 (+) - vektoriai, atitinkamai, naudojant Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) pagal instrukcijas su sąlyga, pagal pasiūlymo 24 h be antibiotikų atrankos gamintojo. Tada ląstelės buvo auginamos terpėje, kuriame yra 400 mikrogramų /ml, G418 ( "Sigma, St Louis, MO), kol visi iš ne-perkeltų valdymo kultūra žuvo ląsteles.

SGC-7901 ląstelės buvo pasėjamos apie 6-duobučių lėkštelėse ir tada perkeltų su ne orientacijos siRNA ar siRNA nukreipta prieš žmogaus HDAC4 ar p21 (Santa Cruz), naudojant Lipofectamine 2000 pagal gamintojo pateiktų instrukcijų. Įtempiamos eksperimentai buvo atliekami ląsteles 48 arba 72 h po transfekciją.

RNR išskyrimas ir kiekybinė realaus laiko PGR (KRL-PGR)

Viso RNR buvo išskirta iš audinių ar ląstelių pagal TRIzol reagento ( Invitrogen) ir atvirkštinės transkripcijos buvo atliekama naudojant TAKARA RNR PGR rinkinys (Takara, Dalian, Kinija) pagal gamintojo instrukcijas. Kiekybinė PGR buvo atliekama naudojant SYBR Green Pašaro Ex Taq (TAKARA, Japonija) į realaus laiko PGR sistema (Eppendorf, Vokietija). Santykinis išraiška santykis kiekvieno prijungto naviko ir ne naviko audinyje buvo apskaičiuojamas 2 ^{-ΔΔCT metodu.}

Mobilusis skaičiavimo rinkinys-8 (CCK-8) Analizės

dauginimasis iš SGC-7901 ląstelių buvo vertinami naudojant CCK-8 tyrimą (Beyotime, Jiangsu, Kinija) pagal protokolą yra rekomendavęs gamintojas. Trumpai, ląstelės buvo kultivuojamos 96-šulinėlių plokštelės esant 2000 ląstelių viename gerai koncentraciją. 0, 1, 2 ir 3 dienas po to, kai transfekciją, ląstelių proliferacijos tyrimu buvo atlikta iki 10 pL CCK8 tirpalo į kiekvieną šulinėlį Be to, po to inkubacijos 37 ° C temperatūroje 2 val. Optinių buvo matuojamas ELISA skaitytuvu, esant 450 nm bangos ilgiui.

kolonija formavimas tyrimas

Trumpai tariant, HDAC4-ekspresija ir -knockdown SGC-7901 ląstelės buvo sėklomis trimis egzemplioriais (1000 ląsteles per 60 mm kultūra indų) ir inkubuojama 37 ° C temperatūroje dvi savaites, kad susidarytų klonai. Ląstelės buvo išplauti su PBS, fiksuoto su 4% paraformaldehido 15 min, ir nudažomi su violetinei (0,5% violetinei, 1% paraformaldehido ir 20% metanolio PBS) 30 min. Kolonijos ant kiekvienos plokštelės buvo suskaičiuoti ir ląstelių išlikimas buvo išreikštas dėl išlikusių kolonijų Nr kontrolinėse lėkštelėse, procentais.

Mobilaus ryšio ciklo analizė

ląstelės buvo nuimta ir švelniai sumaišymo į vieniši ląstelių suspensijos fluorescencijos aktyvuotos ląstelių rūšiavimo (FACS) buferis (PBS su 2% FBS). Ląstelės buvo plaunamas PBS du kartus ir fiksuoto šaltame 70% etanolio per naktį. tada ląstelės buvo plaunama du kartus šalto PBS, resuspenduojamos RNaze Tirpalas ir inkubuojami 30 min, esant 4 ° C temperatūroje. Suspensiją pridėta mg iki 0,05 mg /ml propidiumo jodido (Beyotime), po to inkubacijos esant 4 ° C temperatūroje 30 min ir analizę, naudojant FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA).

Mobilusis apoptozę tyrimas

Propidiumiodide (PI, 1 g /ml) ir prie aneksino V-FITC (1 mikrogramai /ml) buvo naudojamas ląstelių apoptozės nustatymo. Trumpai, ląstelės buvo tripsinizuojamos ir inkubuojami su PI ir aneksino V-FITC 15 min 37 ° C temperatūroje. Mėginiai buvo aptikta naudojant FACS Calibur srautą citometre. Visi eksperimentai buvo atliekami tris kartus.

Ląstelės viduje adenozino 5'-trifosfato (ATP) lygiai tyrimas

ląstelėse ATP koncentracija buvo tiriami naudojant Bioluminescence [11]. Trumpai, ląstelės buvo lizuojamos ir centrifuguojamas maždaug 15000 g 10 min, esant 4 ° C temperatūroje. tada supernatantų, buvo sumaišytas su ATP tyrimo mišinys, darbinio tirpalo (Sigma), ir skleidžiamos šviesos suma iš karto buvo matuojamas su luminometer (Thermo Scientific Luminoskan Ascent, Walthan, MA). Į liuminescensinės duomenys buvo normalūs pavyzdys baltymų kiekiais (matuojamas BCA tyrimą).

reaktyvių deguonies formų (ROS) matavimo

generavimas ląstelėje ROS buvo tiriama naudojant 6-karboksi-2 " , 7'-dichlorfluoresceino diacetatas (H _{2DCFDA). Trumpai tariant, 5 × 10 ^{4 ląstelės buvo padengtas į 60-mm patiekalų ir leidžiama pridėti naktį. Ląstelės buvo nudažomi su 5 pM H 2DCFDA 30 min 37 ° C temperatūroje ir po to surinkti, ir fluorescencijos buvo analizuojami su fluorescencijos spektrometras (Flex StationII 384, molekuliniai įrenginiai) kamb 485 nm bangos ilgiui (sužadinimo) ir 538 nm ( emisija). Mobilieji oksidantas koncentracija, išreikšta santykine DCF fluorescencijos per atrankinius baltymų kiekiais (BCA metodas). Kai eksperimentų, ląstelės buvo išvalytos su 10 mm N.
-acetylcysteine ​​(NAC) prieš ROS susidarymo analizė.}}

Vakarų dėmė analizė

Ląstelės buvo lizuoti IP lizės buferio (Beyotime), denatūruotas 10 min 95 ° C temperatūroje, šlyties jėgos, su insulino švirkštą, ir išspręstas SDS /puslapio geliai. Po to, kai munoblotingu, membranos buvo užblokuotas ir inkubuojami su pirminiais antikUnais PBS /0,1% Tween-20 su 5% Nonfat sauso pieno. Antikūnai prieš HDAC4, p21, LC3, Beclin 1, ATG 7, kaspazės 3, 9, BCL-2, Bax ir anti-beta-aktino visi buvo įsigytas iš Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz). Cheminės liuminescencijos aptikimo buvo tiriami naudojant ECL aptikimo rinkinį (Pierce, Rockford, IL, JAV). Rezultatai buvo analizuojami naudojant kiekį One "programinę įrangą gauti optinis tankis santykis tikslinės baltymų beta-aktino.

Imunofluorescentinis

ląstelės buvo padengtas ant coverslips, fiksuojamas 4% paraformaldehido (Sigma- aldrich) 10 min ir laidžiomis su 0,1% Triton X-100 /PBS. Ląstelės buvo blokuotos 1% BSA 1 valandą, o, po inkubuojant per naktį 4 ° C su anti-LC3 antikūno, ir tada ląstelės buvo inkubuojamos su FITC konjuguoto antrinio antikūno (Beyotime) 1 val. Branduolys buvo tamsintas su 4,6-diamidino 2-fenilindolo (DAPI; Sigma). Fluorescencijos vaizdo buvo ryškinamos naudojant confocal lazerio skenavimo mikroskopą (Carl Zeiss, Oberkochen, Vokietija).

Statistinė analizė

Visi duomenys yra būdingos bent trijų nepriklausomų eksperimentų. Duomenys pateikiami kaip priemonėmis ± S.E.M. Statistinis reikšmingumas buvo apskaičiuojamas vieną pusę dispersinė analizė (ANOVA) arba Stjudento t-testą tarp dviejų grupių, naudojant GraphPad PRISM 5 statistinę programinę įrangą. P
vertės. ≪ 0,05 buvo laikomas svarbiu

Rezultatai

HDAC4 išraiška buvo iki reguliuojama skrandžio vėžio audinių ir ląstelių linijų

Pirmiausia, mes analizuojami HDAC4 išraiška dvidešimt devynių suporuotas skrandžio vėžiu ir gretimų ne naviko audiniuose KRL-PGR analizės ir Vakarų dėmė. Mes nustatėme, kad HDAC4 buvo gerokai iki reguliuojama skrandžio karcinoma audinio (skaičiais 1A, B ir C, ** p
< 0,01 *** P
< 0,001). Be to, keletas skrandžio vėžio ląstelių linijas, taip pat buvo analizuojami. Mes pastebėjo didesnį išraišką HDAC4 trimis skrandžio vėžio ląstelių linijų (MAA, bgc-823 ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901), palyginti su įprastu skrandžio epitelio ląstelių linijos (GES) (skaičiais 1D ir E, * P,
<0,05 ** p
< 0,01). Todėl, mūsų rezultatai parodė, kad HDAC4 išraiška buvo iki reguliuojama abiejose skrandžio vėžio audinių ir ląstelių linijų.

Apie HDAC4 išraiška buvo sėkmingai žemyn, galima arba iki-reguliuojami SGC-7901 ląstelių

pcDNA3.1 (+) ekspresijos vektorius buvo naudojamas superekspresuotų HDAC4 į SGC-7901 ląstelių siekiant išnagrinėti jo veiksmingumą kaip augimo reguliatorių. Po stabilaus transfekciją, kad HDAC4 mRNR lygio išraiška buvo gausiai į pcDNA3.1 (+) - HDAC4 ląstelės nei ne perkeltų ląstelių arba neigiamos kontrolės (NK) SGC-7901 ląstelių (2a pav ** * p
. < 0,001), kuris buvo suderintas su rezultatas Vakarų dėmė analizė (2b pav)

Jei įvertinti genų slopinimo veiksmingumą žmogaus HDAC4-siRNA, kad HDAC4 baltymų raiškos apimtis buvo matuojamas po HDAC4-siRNA transfekciją ir 48 h inkubacijos laikotarpiu žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijos SGC-7901. Realaus laiko PGR analizė parodė, kad HDAC4 siRNR infekcija lėmė 36,3% triuškinantis iš HDAC4 mRNR lygių (2c pav *** P
< 0,001). Vakarų dėmė analizė parodė, kad HDAC4 baltymas gerokai sumažintas (2D brėžinį), suderinamas su jo iRNR mažinimo. Kartu paėmus, šie duomenys rodo, kad HDAC4 siRNR gali žymiai slopinti endogeninio HDAC4 išraiška.

HDAC4 skatinamas ląstelių proliferaciją ir kolonijų susidarymą

Be to, mes išnagrinėjo HDAC4 poveikį ląstelių augimą. Ląstelių proliferacija buvo tiriama naudojant Mobilusis skaičiavimas komplektas-8 (CCK-8) tuo metu, kiekis 24, 48 ir 72 val. Augimo kreivės parodė, kad, kai HDAC4 buvo ekspresija SGC-7901 ląstelių, ląstelių augimas padidėjo 1,5 karto, palyginti su kontroline grupe dėl 3 dieną (3A pav, * P
< 0,05, ∧∧P
< 0,01). Be to, kolonija formavimas tyrimas rodomas staigiai padidinti 2 kartus kolonijas skaičius, kai SGC-7901 ląstelės buvo transfekuota pcDNA3.1 (+) - HDAC4, palyginti su NC grupės (Duomenys 3B ir C, ** p
< 0,01)

Mes taip pat išnagrinėjo HDAC4 poveikį žemyn reguliavimo SGC-7901 ląstelių.. CCK-8 tyrimas ir kolonija formavimas tyrimas parodė, kad HDAC4 žemyn reguliavimas slopino platinimo galimybes (3D figūra, ∧P
< 0,05) ir kolonijos formavimo numeriai SGC-7901 ląstelių (Skaičiai 3E ir F ** p
< 0,01). Apibendrinant, šie duomenys rodo, kad HDAC4 gali būti augimas promotorius SGC-7901 ląstelių.

HDAC4 padidino ATP lygį ir sumažėjo ROS susidarymą

ATP lygio padidėjimas HDAC4 ekspresija ląstelių buvo Pastebėjus, palyginti su NC SGC-7901 ląstelių (3G pav * P,
< 0,05). Be to, ATP lygis sumažėjo HDAC4 triuškinantis ląstelių (3H pav * P,
< 0,05).

Kadangi ląstelėje ROS karta gali būti susijęs su mitochondrijų disfunkciją, mes toliau nagrinėjo, ar HDAC4 galėtų paskatinti ROS susidarymą SGC-7901 ląstelių. Rezultatai rodo, kad reikšmingai sumažėjo su ROS kartos buvo pastebėtas pcDNA3.1 (+) - HDAC4 SGC-7901 ląstelių, lyginant su NC SGC-7901 ląstelių (3G pav ∧P
< 0,05). Tuo tarpu, triukšmo slopinimo ir HDAC4 tvirtai aktyvuota ROS susidarymą SGC-7901 ląstelių (pav 3H ** p
< 0,01). Blokavimo ROS gamybą naudojant antioksidantas NAC smarkiai slopino ROS karta (3H pav ∧P
< 0,05). Šis ROS kartos blokavimas apdirbant ląstelių su NAC taip pat gerokai sutrukdė ATP nuostolių HDAC4-siRNA SGC-7901 ląstelių (3H figūra, ∧P
< 0,05).

žemyn -regulated HDAC4 išraiška suimtas ląsteles G0 /G1 fazės

žemyn reguliavimas HDAC4 eksponuojami aiškų padidėjimą ląstelių G0 /G1 fazės proporcingai (78,74%, palyginti su 49.92% į NC-siRNA grupė). Taip pat buvo atitinkamai nesumažinant ląstelių S stadijoje skaičius (12,94%, palyginti su 34.61% į NC-siRNA grupės) (4a paveiksle). Į quantitate ląstelės ciklo skirstymo rezultatai parodė, kad HDAC4 triuškinantis žymiai sukeltas SGC-7901 ląsteles G0 /G1 arešto ir S fago slopinimo (4B pav * P,
< 0,05 ** p
< 0,01). Taigi, šie duomenys rodo, kad HDAC4 lygis galėtų reguliuoti ląstelinį ciklą.

Žemyn reguliuojama HDAC4 išraiška sukeltos apoptozės ir autofagija

Jei studijuoti ar žemyn reguliuojama HDAC4 sukelta ląstelių augimo slopinimo buvo susijęs su ląstelių apoptozę, kad žemyn reguliuojama HDAC4 poveikis ląstelių apoptozės buvo įvertintas tėkmės citometrijos naudojant aneksinu-FITC /PI dvigubą dažymo. Buvo pastebėta, kad apoptozės žymiai padidėjusi HDAC4-siRNR SGC-7901 ląstelių, palyginti su NC-siRNA grupės (4C pav). Mes dar kartą patvirtino apoptozės indukcija per kaspazės-3 ir 9 aktyvavimo Western Blot. Analizė parodė, kad žemyn reguliuojama HDAC4 padidėjo skilimo kaspazių-3 ir 9, palyginti su NC-siRNA grupei. Antistoksinis-apoptozės baltymų Bcl-2 ir proapoptozinis baltymų Bax sąvoka taip pat buvo kiekybiškai. Bax /BCL-2 santykis buvo gerokai padidėjo HDAC4-siRNA SGC-7901 ląstelių, lyginant su NC-siRNA grupės (5d pav.)

Jei ištirti, ar žemyn reguliuojama HDAC4 sukeltas autofagija į SGC-7901 ląstelės, mes pirmiausia išnagrinėjo ląstelėje lokalizacijos LC3 į HDAC4-siRNA SGC-7901 ląstelių imunofluorescenciniam analizė naudojant liuminescencines antikūnus LC3. Konkretus taškinis platinimas endogeninio LC3 buvo pastebėtas kaip taškinis taškų žalios fluorescencijos į HDAC4-siRNA SGC-7901 ląstelių, palyginti su NC-siRNA grupės (4e pav), nurodant, kad autofagija buvo sukeltas kaip išlikimo priemonėmis. Pavienių ląstelių tyri- mas platinimas LC3 buvo žymiai slopinamas autofagija konkrečių inhibitorių 3-MA į HDAC4-siRNA SGC-7901 ląstelių (4e pav). Tada į autofagija susiję baltymai Atg7, Beclin 1 ir LC3-II santykis LC3-man buvo analizuojami Vakarų dėmė. Matėme, kad sąvoka lygiai Atg7, Beclin 1 LC3-II visi buvo gerokai padidėjo HDAC4-siRNA SGC-7901 ląstelių, lyginant su NC-siRNA grupės (4F pav.) Atg7, Beclin 1 ir LC3-II santykis LC3-Aš labai sumažėjo HDAC4-siRNA SGC-7901 ląstelių, kurios buvo gydomi 3-MA palyginti su NC-siRNA grupės (4F pav.)

žemyn reguliuojama HDAC4 išraiška slopino ląstelių augimą per p21 up-reguliavimo

Kadangi žmogaus vėžinių ląstelių su HDAC inhibitorius nuosekliai veda prie up-reguliavimo p21 išraiškos, ciklinų priklausoma kinazės inhibitorius, kuris yra nusistovėjęs tikslas HDAC inhibitorių [6], [7], [12], siekėme nustatyti, ar raiškos ar triuškinantis iš HDAC4 gali paveikti P21 reguliavimą ir spėlioti apie HDAC4 tarpininkaujant augimo skatinimo mechanizmą skrandžio vėžio ląsteles.

Kaip parodyta 5A paveiksle, up-reguliavimas HDAC4 dramatiškai lėmė sumažėjęs P21 baltymo ekspresiją. Priešingai, HDAC4 žemyn reguliavimo lėmė padidėjusios p21 išraiškos (5a pav.) Mes tada patikrino, ar P21 nokdaunas gali turėti įtakos ląstelių augimą ir apoptozę SGC-7901 ląstelių, kurioje HDAC4 buvo ištrintas. Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 ląstelės buvo bendrai perkeltų su siRNA HDAC4 ir siRNA p21. P21 iRNR lygis buvo žymiai sumažėjo HDAC4-siRNA SGC-7901 ląstelių po P21 triuškinantis (5b pav ** p
< 0,01 *** P
< 0,001). P21 nokdaunas gerokai susilpninta ląstelių proliferacija slopinimas HDAC4-siRNA SGC-7901 ląstelių (5C pav * P,
< 0,05, ∧∧ P
< 0,01). ATP lygis padidėjo, tačiau ląstelėje ROS kartos sumažėjo siRNR-P21-HDAC4 grupėje, lyginant su siRNR HDAC4 grupės (5d figūra, , * p
< 0,05 ** p
< 0,01). P21 žemyn reguliavimo gerokai susilpnintas G0 /G1 arešto ir S fago slopinimo HDAC4-siRNA SGC-7901 ląstelių (skaičiais 5E ir F * P,
< 0,05). Imunoblotas parodė, kad BCL-2 kiekis buvo reikšmingai didesnis, bet Bax buvo mažesnis siRNR-P21-HDAC4 ląstelių (5G pav). Ląstelių apoptozė ženkliai sumažėjo siRNR-P21-HDAC4 SGC-7901 ląstelių, lyginant su siRNR HDAC4 grupės (5H pav.) Taip pat buvo pastebėta, kad P21 nokdaunas gali išgelbėti padidėjusį autofagija pertraukdavo liuminescencines dėmės (5I paveikslas) ir ATG 7, Beclin 1 ir LC3II baltymų ekspresiją SGC-7901 ląstelių, kurias sukelia siRNA HDAC4 (5J pav.) Bendrai, šie duomenys rodo, kad žemyn reguliavimas p21 gali imituoti HDAC4 raiškos poveikį ir gali būti svarbus tarpininkas HDAC4 tarpininkaujant SGC-7901 ląstelių augimo skatinimo.

Diskusijos

Daugelis HDAC inhibitoriai, kurie slopina proliferaciją ir indukuoja apoptozę diferenciacijos ar naviko ląstelėse, yra klinikiniuose tyrimuose arba kaip priešvėžinių agentų arba kartu su kitais gydymo [13]. Aukštos raiškos HDAC1 /2 buvo nustatyta skrandžio karcinoma audiniuose [14]. Mūsų tyrimo duomenimis, mes parodėme, kad HDAC4 išraiška buvo iki reguliuojama skrandžio vėžio audinių ir ląstelių linijų in vitro
. HDAC4 žemyn reguliavimas SGC-7901 ląstelių slopino ląstelių proliferaciją ir kolonijos formavimo numerius, suimti ląstelių ciklą ir sukeliama ląstelių apoptozę priklausomas nuo ir 9 kaspazių 3 aktyvavimo, kuri yra suderinama su antiproliferacinis ir proapoptotic poveikio HDAC inhibitorių žmogaus vėžio ląstelių linijos [15], ir su anksčiau pranešė pastebėjimu, kad HDAC4 žemyn reglamentavimas mažina clonogenic išlikimą ir indukuoja apoptozę HeLa [5]. Proproliferative poveikis HDAC4 skrandžio vėžio ląstelių yra suderinama su anksčiau pranešė už I klasės HDACs, HDAC1, -2 ir -3 [16]. Taigi, orientacija į HDAC4 veiklos slopinimas gali būti potencialus terapinis metodas gydyti skrandžio vėžiu.

autofagija iš esmės yra baltymų degradacija sistema ląstelių nuosavų lizosomas. Streso signalus, pavyzdžiui, maistinių medžiagų bado ar gydymo įvairių vaistais nuo vėžio įvairovė, stimuliuoja autofagija procesą [17]. Autofagija paprastai yra būdinga tai, kad autophagosomes buvimą ir skilimu LC3 [18] padidėjimas. Iš autofagija vaidmuo ląstelių mirties proceso prieštaringas, tačiau ji buvo patvirtinta, kad Šķērsruna tarp apoptozės ir autofagija yra būtinas programuota ląstelių mirtis [19]. Mūsų tyrime autofagija indukcija HDAC4-siRNA SGC-7901 ląstelių buvo liudija skyrybos modelio LC3 imunodažymu ir biocheminių Hallmark baltymų autofagija (Atg7, Beclin 1 ir LC3) Pagal Vakarų dėmė analizė kaupimosi. Autofagija slopinimo inhibitorius 3-MA ardo tą autofagija indukcijos HDAC4-siRNA SGC-7901 ląstelių. Taigi, mes spėliojo autofagija įvyko gali apsaugoti SGC-7901 vėžinės ląstelės apoptozę sukeltas HDAC4 triuškinantis.

P21 baltymas, taip pat žinomas kaip cikloniniai priklausoma kinazės (LIL) inhibitorius 1, reguliuoja G1 fazės progresavimą ląstelės ciklo , P21 yra dažnai neteisingai-reguliuojami žmogaus vėžio, ir ji gali veikti kaip auglio slopinamojo arba kaip onkogeno [20]. Tie, su P21-teigiamas ir p53-neigiamas vėžio turi žymiai didesnes išgyvenimo kreives skrandžio karcinoma [21], o p21 išraiška nuostoliai kartu su padidėjusia p53 aptikimo asocijuojasi su prastos prognozės ir sumažėjęs bendras išgyvenamumas skrandžio vėžio [22]. Nuoseklus todėl P21 baltymas žemyn reguliuojama skrandžio vėžio audiniuose [23], mes nustatėme, kad HDAC4 skatina skrandžio vėžio ląstelių proliferaciją ir augimą tarpininkaujant su p21 skrandžio vėžio ląstelių represijų ir lydi padidinimo ATP lygiai ir represijos ROS susidarymo. Todėl mes ištirti, ar P21 buvo svarbus tarpininkas už HDAC4 tarpininkaujant SGC-7901 ląstelių augimo skatinimo. Šiame tyrime HDAC4 nokdaunas gerokai paskatino didesnį išraišką p21 baltymo, o HDAC4 raiška žymiai sumažino p21 baltymo ekspresiją SGC-7901 ląstelių. Šie duomenys leido suprasti, kad P21 gali būti tolesnis tikslas HDAC4. Funkciniai tyrimai parodė žemyn reguliavimą p21 gali imituoti HDAC4 raiškos poveikį SGC-7901 ląstelių augimo skatinimo. Kartu paėmus, šie rezultatai rodo, kad HDAC4 žemyn reguliavimo galėtų skatinti SGC-7901 ląstelių apoptozę iki reguliavimo p21 išraiška. P21 gali būti auglio slopinamojo kuriant ir progresavimo skrandžio vėžio, kurio išraiška gali padėti kontroliuoti piktybinių elgesio skrandžio vėžio įvairovė. Tačiau, galimas aktualumas HDAC4 reguliavimo p21 išraiškos taip pat turi būti peržiūrėtas atsižvelgiant į kontekstą, kad yra daug pagrindiniai veiksniai ir būdai, kurie potencialiai moduliuoti į p21 skrandžio vėžiu išraiška.

Kartu paėmus, mūsų išvados yra atskleidė svarbų vaidmenį HDAC4 kontroliuojant žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijos SGC-7901 vystymąsi per reguliavimo p21, o tai rodo, kad HDAC4 žodžio ir /ar veiklos pakeitimą gali būti svarbus įvykis metu skrandžio vėžys. Taigi, šie duomenys nustatyti HDAC4 kaip svarbų reguliatorius platinimu skrandžio vėžio per represijas p21 in vitro pervežimas.

• PLoS One: Cirkuliacinis vėžinių ląstelių (CTCs) aptiktas RT-PGR ir jos prognostinio vaidmuo skrandžio vėžys: meta-analizė Paskelbta Literature
• PLoS ONE: MUC5AC Upstream Kompleksiniai Pasikartojančios Regionas Ilgis Polimorfizmas yra susiję su jautrumu ir klinikinės etapo Skrandžio Cancer