PLoS ONE: histondeacetylase HDAC4 Fremmer Gastric Cancer SGC-7901 Cells Progression via p21 Undertrykkelse

Abstrakt

mavekræft (GC) er en af ​​de førende årsager til kræft dødsfald i verden. Rolle histon deacetylase 4 (HDAC4) i specifikke celle- og vævstyper er blevet identificeret. Men dens biologiske roller i udviklingen af ​​gastrisk cancer forbliver stort set uudforsket. Kvantitativ real time PCR (QRT-PCR) og western blot blev anvendt til at analysere ekspressionen af ​​HDAC4 i de kliniske prøver. siRNA og overekspression af HDAC4 og siRNA p21 blev brugt til at studere funktionelle virkninger på en spredning, en koloni dannelse, en adenosin 5'-trifosfat (ATP) assay og reaktive ilt arter (ROS) generation, cellecyklus, celle apoptose satser, og autofagi assays. HDAC4 blev opreguleret i mavekræft væv og flere gastrisk cancer cellelinjer. Spredningen, kolonidannelse evne og ATP-niveau blev forbedret i HDAC4 overekspression SGC-7901 celler, men hæmmet i HDAC4 knockdown SGC-7901 celler. HDAC4 knockdown førte til G0 /G1 fasen celle anholdelse og forårsagede apoptose og ROS stigning. Desuden blev HDAC4 sig at inhibere p21 ekspression i gastrisk cancer SGC-7901 celler. p21 knockdown dramatisk svækket celleproliferation hæmning, cellecyklusstop, celle apoptose fremme og autophagy opregulering i HDAC4-siRNA SGC-7901 celler. Vi viste, at HDAC4 fremmer mavekræft celle progression medieret gennem undertrykkelse af p21. Vores resultater giver en eksperimentel basis for at forstå den pro-tumor mekanisme HDAC4 som behandling for mavekræft

Henvisning:. Kang Z-H, Wang C-Y, Zhang W-L, Zhang J-T, Yuan C-H, Zhao P-W, et al. (2014) histondeacetylase HDAC4 Fremmer Gastric Cancer SGC-7901 Cells Progression via p21 Undertrykkelse. PLoS ONE 9 (6): e98894. doi: 10,1371 /journal.pone.0098894

Redaktør: Wei-Guo Zhu, Peking University Health Science Center, Kina

Modtaget: 12. februar 2014 Accepteret: 8. maj 2014 Udgivet: 4 Jun 2014

Copyright: © 2014 Kang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra Health Department of Jilin provinsen (nr 2012z119). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft (GC) er den fjerde mest almindelige malignitet og den anden hyppigste årsag til kræft død på verdensplan [1]. Asiatiske og sydamerikanske lande har en højere forekomst af GC end USA og Vesteuropa [2]. Mest målrettede behandlinger fokuserer på vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) og epidermal vækstfaktorreceptor (EGFR) relaterede indikationer i avanceret GC. Forbindelser mod nye targets, såsom mTOR [3], c-Met (hepatocytvækstfaktor receptor) [4], og HDAC, er også omfattet af undersøgelsen.

histon deacetylase 4 (HDAC4), som er en klasse IIa HDAC, vides at eksistere i særskilte transkriptionelle co-repressorkomplekset komplekser. HDAC4 er en kritisk komponent i DNA beskadigelse respons pathway, der virker gennem 53BP1 [5]. HDAC4 undertrykker ekspressionen af ​​cyclin-afhængige kinase inhibitor p21 (også kendt som p21WAF1 /Cip1) i humane cancerceller gennem en Sp1-afhængig p53-uafhængig mekanisme [6]. HDAC4 fremmer væksten af ​​colon cancerceller via undertrykkelse af p21 [7]. Inaktivering af HDAC4 af små interfererende RNA eller HDAC-inhibitorer undertrykker neuronal celledød [8].

rolle HDAC4 i specifikke celler (HeLa (livmoderhalskræft), U373 (gliom), OVCAR (ovarie), T98G ( gliom), HCT116 (colorektal), NHA (astrocytisk) og SKBR3 (bryst)) og væv (cerebral cortex, testis, prostata og det epidermale lag af huden) bliver mere klart [9]. Men den nøjagtige mekanisme af HDAC4 i mavekræft ikke er blevet bestemt,. Derfor er formålet med denne undersøgelse var først at evaluere ekspressionsniveauerne af HDAC4 i human gastrisk cancer væv og cellelinier. For det andet blev virkningen af ​​HDAC4 på gastrisk kræft cellelinjer undersøgt ved hjælp af overekspression og knockdown. Endelig har vi undersøgt, om HDAC4 havde et forhold til p21 i mavens kræftceller. Sammen vores mål var at finde, om HDAC4 har en biologisk rolle i GC udvikling og for at belyse den underliggende mekanisme.

Materialer og metoder

Vævsprøver

Tyve-ni parret primære gastrisk karcinom væv og fjerne normale gastriske væv blev indsamlet fra patienter (alder: 58,46 ± 9,17 år) under rutinemæssig terapeutisk kirurgi i Department of Gastrointestinal Surgery, det første hospital i Jilin Universitet. Alle prøver blev opnået med informeret samtykke i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen og godkendt af Human etiske komité for Første Hospital i Jilin Universitet og Jilin Universitet, PR China. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle deltagere.

cellelinjer og kultur

De humane mavekræft cellelinjer SGC-7901, AGS, og BGC-823 og den normale gastriske epitel celle linje GES var opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA) og dyrket i RPMI 1640 medium med 10% føtalt bovint serum i en fugtet atmosfære af 5% CO _{2 ved 37 ° C.}

Stald transficeret cellelinie og transient transfektion

HDAC4 fragment i fuld længde blev amplificeret ved revers transkription-PCR fra GES-celler under anvendelse af de specifikke primere, som tidligere beskrevet [10] og indsat i BamHI og Hind III-stederne i pcDNA3.1 (+ ) (Ciontech, Hampshire, UK). PcDNA3.1 (+) - HDAC4 plasmid blev verificeret ved sekvensanalyse for at bekræfte fravær af mutationer. SGC-7901-celler blev podet i plader med 6 brønde og transficeret ved pcDNA3.1 (+) - HDAC4 og pcDNA3.1 (+) - vektorer henholdsvis anvendelse af lipofectamin 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge instruktionerne tilvejebragt af fabrikanten for 24 timer uden antibiotisk selektion. Derefter blev cellerne dyrket i medium indeholdende 400 ug /ml G418 (Sigma, St. Louis, MO), indtil alle celler i ikke-transficerede kontrolkultur blev dræbt.

SGC-7901-celler blev podet på plader med 6 brønde og derefter transficeret med ikke-targeting siRNA eller siRNA rettet mod humant HDAC4 eller p21 (Santa Cruz) ved hjælp af lipofectamin 2000 i henhold til instruktionerne fra producenten. Stretch blev udført på celler 48 eller 72 timer efter transfektion.

RNA-isolering og kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR)

Totalt RNA blev isoleret fra væv eller celler ved TRIzol-reagens ( Invitrogen), og reverse transskriptioner blev udført under anvendelse af Takara RNA PCR kit (Takara, Dalian, Kina) ifølge producentens instruktioner. Kvantitativ PCR blev udført under anvendelse af en SYBR Green Premix Ex Taq (Takara, Japan) i en real-time PCR-system (Eppendorf, Tyskland). Den relative ekspression forhold i hver sammenkoblet tumor- og ikke-tumorvæv blev beregnet af 2 ^{-ΔΔCT metode.}

Celletælling kit-8 (CCK-8) assay

proliferationer af SGC-7901 celler blev vurderet ved hjælp af en CCK-8 assay (Beyotime, Jiangsu, Kina) i overensstemmelse med protokollen anbefalet af producenten. Kort beskrevet blev cellerne dyrket i en 96-brønds plade ved en koncentration på 2000 celler pr. Ved 0, 1, 2 og 3 dage efter transfektion, celleproliferationen blev udført ved tilsætning af 10 pi CCK8 opløsning til hver brønd, efterfulgt af inkubation ved 37 ° C i 2 timer. Absorbansen blev målt ved en ELISA-læser ved en bølgelængde på 450 nm.

Colony dannelse assay

Kort fortalt blev HDAC4-overudtrykkende og -knockdown SGC-7901 celler podet i tre eksemplarer (1.000 celler pr 60 mm dyrkningsskål) og inkuberet ved 37 ° C i to uger for at danne kloner. Cellerne blev vasket med PBS, fikseret med 4% paraformaldehyd i 15 minutter, og farvet med krystalviolet (0,5% krystalviolet, 1% paraformaldehyd og 20% ​​methanol i PBS) i 30 min. De kolonier på hver plade blev talt, og celleoverlevelse blev udtrykt som en procentdel af antallet af overlevende kolonier på kontrolpladerne.

Cellecyklusanalyse

Cellerne blev høstet og forsigtigt resuspenderet i enkeltcellesuspensioner i fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) buffer (PBS indeholdende 2% FBS). Cellerne blev vasket med PBS to gange og fikseret i kold 70% ethanol natten over. Celler blev derefter vasket to gange med kold PBS, resuspenderet i RNase A opløsning og inkuberet i 30 minutter ved 4 ° C. Suspensionen blev tilsat til 0,05 mg /ml propidiumiodid (Beyotime) efterfulgt af inkubation ved 4 ° C i 30 minutter og analyse ved anvendelse FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA).

Cell apoptose assay

Propidiumiodide (PI, 1 ug /ml) og Annexin V-FITC (1 ug /ml) blev anvendt til bestemmelse af celleapoptose. Kort beskrevet blev cellerne trypsiniseret og inkuberet med PI og Annexin V-FITC i 15 minutter ved 37 ° C. Prøverne blev påvist under anvendelse af et FACS Calibur flowcytometer. Alle eksperimenter blev udført tredobbelt.

Intracellulær adenosin-5'-triphosphat (ATP) niveauer assay

intracellulære ATP-niveauer blev analyseret under anvendelse af bioluminescens [11]. Kort fortalt blev cellerne lyseret og centrifugeret ved ca. 15.000 g i 10 minutter ved 4 ° C. Supernatanterne blev derefter blandet med en ATP assay mix arbejdsopløsning (Sigma), og mængden af ​​lys, der udsendes blev straks målt med et luminometer (Thermo Scientific Luminoskan Ascent, Walthan, MA). De luminescens data blev normaliseret ved prøve protein mængder (målt ved hjælp af en BCA assay).

Reaktive ilt arter (ROS) måling

Generering af intracellulær ROS blev undersøgt ved hjælp af 6-carboxy-2 ' , 7'-dichlorfluorescein-diacetat (H _{2DCFDA). Kort fortalt, 5 × 10 ^{4 celler blev udpladet i 60 mm skåle og lodes binde natten over. Cellerne blev farvet med 5 uM H 2DCFDA i 30 minutter ved 37 ° C og derefter opsamlet, og fluorescensen blev analyseret med et fluorescensspektrometer (Flex StationII 384, Molecular Devices) ved 485 nm (excitation) og 538 nm ( udledning). Cellular oxidant niveauer blev udtrykt som relativ DCF fluorescens per prøve protein mængder (BCA-metoden). I nogle forsøg blev celler forbehandlet med 10 mM N
-acetylcysteine ​​(NAC), før analysen af ​​ROS generation.}}

Western blot-analyse

Cellerne blev lyseret i IP lysepuffer (Beyotime), denatureret i 10 min ved 95 ° C, forskydes med en insulinsprøjte og opløst på SDS /PAGE-geler. Efter immunblotting blev membranerne blokeret og inkuberet med primære antistoffer i PBS /0,1% Tween-20 med 5% fedtfri tørmælk. Antistoffer rettet mod HDAC4, p21, LC3, Beclin 1, ATG 7, caspase 3, 9, Bcl-2, Bax og anti-β-Actin blev alle indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz). Kemiluminescerende påvisning blev analyseret under anvendelse af et ECL påvisning kit (Pierce, Rockford, IL, USA). Resultaterne blev analyseret ved anvendelse Mængde One-software til opnåelse af optisk densitet forholdet mellem målproteinet p-actin.

Immunofluorescens

Cellerne blev udpladet på dækglas, fikseret med 4% paraformaldehyd (Sigma- Aldrich) i 10 minutter og permeabiliseret med 0,1% Triton X-100 /PBS. Cellerne blev blokeret med 1% BSA i 1 time, efterfulgt af inkubation natten over ved 4 ° C med anti-LC3 antistof og derefter celler blev inkuberet med FITC-konjugeret sekundært antistof (Beyotime) i 1 time. Kernerne blev farvet med 4,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI; Sigma). Den fluorescens billeddannelse blev visualiseret ved hjælp af en konfokal laser scanning mikroskop (Carl Zeiss, Oberkochen, Tyskland).

Statistisk analyse

Alle data er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg. Dataene er præsenteret som middelværdier ± S.E.M. Statistisk signifikans blev beregnet ved envejs variansanalyse (ANOVA) eller ved t-test mellem de to grupper ved hjælp af GraphPad Prism 5 statistisk software. P
værdier. ≪ 0,05 blev betragtet som signifikante

Resultater

HDAC4 udtryk var opreguleret i mavekræft væv og cellelinjer

Først, vi analyseret HDAC4 udtryk i niogtyve parrede mavekræft og tilstødende ikke-tumorvæv ved QRT-PCR-analyse og western blot. Vi fandt, at HDAC4 var signifikant opreguleret i gastrisk karcinom væv (figur 1A, B og C, ** P
< 0,01, *** P
< 0,001). Derudover blev også analyseret adskillige gastriske cancercellelinier. Vi observerede højere udtryk for HDAC4 i tre gastrisk cancer cellelinier (AGS, BGC-823 og SGC-7901), sammenlignet med en normal gastrisk epitel celle linje (GES) (Figur 1D og E, * P
<0,05, ** P
< 0,01). Derfor vores resultater viste, at HDAC4 udtryk var opreguleret i både gastrisk cancer væv og cellelinier.

Den HDAC4 udtryk lykkedes ned-eller opreguleret i SGC-7901 celler

A pcDNA3.1 (+) ekspressionsvektor blev anvendt til overekspression HDAC4 i SGC-7901 celler for at undersøge dens effektivitet som en vækst regulator. Efter stabil transfektion, ekspressionen af ​​HDAC4 mRNA niveauer var mere rigelige i pcDNA3.1 (+) - HDAC4 celler end i de ikke-transficerede celler eller negativ kontrol (NC) SGC-7901 celler (figur 2A, ** * P
. < 0,001), hvilket var i overensstemmelse med resultatet af western blot analyse (figur 2B)

for at vurdere gen-silencing effekt af menneskelig HDAC4-siRNA, omfanget af HDAC4 proteinekspression var målt efter HDAC4-siRNA transfektion og en 48-timers inkubation periode i human gastrisk cancercellelinie SGC-7901. Real-time PCR-analyse viste, at HDAC4 siRNA-infektion resulterede i 36,3% knockdown af HDAC4 mRNA-niveauer (figur 2C, *** P
< 0,001). Western blot-analyse viste, at HDAC4 protein blev reduceret signifikant (figur 2D), i overensstemmelse med dets mRNA reduktion. Tilsammen disse data antydede, at HDAC4 siRNA væsentlig grad kan undertrykke den endogene HDAC4 udtryk.

HDAC4 fremmet celledeling og kolonidannelse

Dernæst undersøgte vi effekten af ​​HDAC4 på cellevækst. Celleproliferation blev undersøgt under anvendelse celle Counting Kit-8 (CCK-8) ved tidspunkterne på 24, 48 og 72 timer. Kurverne vækst viste, at når HDAC4 var overekspression i SGC-7901 celler, blev cellevæksten steget med 1,5 gange sammenlignet med kontrolgruppen på dag 3 (figur 3A, * P
< 0,05, ∧∧P
< 0,01). Derudover kolonidannelse assayet udviste en dramatisk stigning på 2 gange i koloni nummer, når SGC-7901-celler blev transficeret med pcDNA3.1 (+) - HDAC4 forhold til NC-gruppen (fig 3B og C, ** P
< 0,01)

Vi undersøgte også virkningerne af HDAC4 down-regulering i SGC-7901 celler.. Den CCK-8 assay og kolonidannelse assay viste, at HDAC4 nedregulering undertrykte spredning evne (figur 3D, ∧P
< 0,05) og kolonidannelse antal SGC-7901 celler (figur 3E og F, ** P
< 0,01). Sammenfattende foreslog disse data, at HDAC4 kunne være en vækstfremmer i SGC-7901 celler.

HDAC4 øget ATP niveauer, og faldt ROS generation

En stigning i ATP-niveauer i HDAC4 overekspression celler var observerede forhold til NC SGC-7901 celler (figur 3G, * P
< 0,05). Desuden blev ATP-niveau faldt i HDAC4 knockdown celler (figur 3H, * P
< 0,05).

Fordi intracellulær ROS generation kan være relateret til mitokondriel dysfunktion, vi yderligere undersøgt, om HDAC4 kunne stimulere ROS generation i SGC-7901 celler. Resultaterne viser, at en betydelig reduktion af ROS generation blev observeret i pcDNA3.1 (+) - HDAC4 SGC-7901 celler sammenlignet med NC SGC-7901 celler (figur 3G, ∧P
< 0,05). I mellemtiden, nedregulering af HDAC4 håndfast aktiveret ROS generation i SGC-7901 celler (figur 3H, ** P
< 0,01). Blokering ROS produktion ved hjælp af antioxidanten NAC inhiberede betydeligt ROS generation (figur 3H, ∧P
< 0,05). Denne blokering af ROS generation ved forbehandling af cellerne med NAC også markant forhindret ATP tab i HDAC4-siRNA SGC-7901 celler (figur 3H, ∧P
< 0,05).

Den ned -regulated HDAC4 udtryk anholdt celler i G0 /G1 fasen

nedregulering af HDAC4 udstillet en klar stigning i andelen af ​​celler i G0 /G1 fasen (78,74% i forhold til 49,92% i NC-siRNA gruppe). Der var også et tilsvarende fald i antallet af celler i S-fasen (12,94% sammenlignet med 34,61% i NC-siRNA gruppe) (figur 4A). De kvantificere cellecyklusfordeling resultater blev vist, at HDAC4 knockdown betydeligt inducerede SGC-7901 celler G0 /G1 anholdelse og S fag hæmning (figur 4B, * P
< 0,05, ** P
< 0,01). Derfor disse resultater antyder, at HDAC4 plan kan regulere cellecyklusprogression.

Den nedreguleret HDAC4 udtryk induceret apoptose og autophagy

For at undersøge, om nedreguleret HDAC4-induceret celievækstinhiberingen var relateret til celle apoptose, blev virkningen af ​​nedreguleret HDAC4 på celleapoptose evalueret ved flowcytometri under anvendelse Annexin V-FITC /PI dobbelt farvning. Det blev observeret, at apoptose steg markant i HDAC4-siRNA SGC-7901 celler sammenlignet med NC-siRNA-gruppe (figur 4C). Vi bekræftede endvidere induktionen af ​​apoptose gennem aktivering af caspase-3 og 9 ved Western blot. Analysen viste, at nedreguleret HDAC4 øget spaltning af caspase-3 og 9 sammenlignet med NC-siRNA gruppe. Ekspressionen af ​​anti-apoptotiske protein Bcl-2 og det pro-apoptotiske protein Bax blev også kvantificeret. Den Bax /Bcl-2-forholdet blev øget betydeligt i HDAC4-siRNA SGC-7901 celler sammenlignet med NC-siRNA-gruppe (figur 5D).

For at undersøge om nedreguleret HDAC4 induceret autophagy i SGC-7901 celler, vi først undersøgte den intracellulære lokalisering af LC3 i HDAC4-siRNA SGC-7901 celler ved immunofluorescens analyse ved hjælp af fluorescerende antistoffer til LC3. Den specifikke punktformig fordeling af endogent LC3 blev observeret som punktformig prikker af grøn fluorescens i HDAC4-siRNA SGC-7901 celler sammenlignet med den af ​​NC-siRNA gruppe (figur 4E), hvilket indikerer, at autophagy blev induceret som et middel til overlevelse. Den subcellulære fordeling af LC3 blev væsentligt inhiberet af autofagi-specifikke inhibitor 3-MA i HDAC4-siRNA SGC-7901 celler (figur 4E). Derefter de Autophagy beslægtede proteiner Atg7, Beclin 1, og forholdet af LC3-II til LC3-I blev analyseret ved western blot. Vi observerede, at ekspressionsniveauerne af Atg7, Beclin 1 og LC3-II alle var signifikant forøget i HDAC4-siRNA SGC-7901 celler sammenlignet med NC-siRNA gruppe (figur 4F). The Atg7, Beclin 1, og forholdet af LC3-II til LC3-I faldt markant i HDAC4-siRNA SGC-7901 celler, som blev behandlet med 3-MA sammenlignet med NC-siRNA gruppe (figur 4F).

den nedreguleret HDAC4 ekspression inhiberede cellevækst gennem p21 opregulering

Da behandlingen af ​​humane cancerceller med HDAC-inhibitorer konsekvent fører til opregulering af p21-ekspression, en cyclin-afhængig kinase inhibitor, som er en veletableret mål for HDAC-hæmmere [6], [7], [12], vi søgte at afgøre, om overekspression eller knockdown af HDAC4 kunne påvirke p21 regulering og at spekulere mekanismen for HDAC4-medieret vækstfremme i gastriske kræftceller.

Som vist i figur 5A, opreguleringen af ​​HDAC4 dramatisk ført til nedsat p21-proteinekspression. I modsætning hertil nedregulering HDAC4 førte til forøget p21-ekspression (figur 5A). Vi undersøgte derefter, om p21 knockdown kan påvirke cellevækst og apoptose i SGC-7901 celler, hvor HDAC4 blev slettet. De SGC-7901 celler blev co-transficeret med siRNA HDAC4 og siRNA p21. Den p21 mRNA niveau blev signifikant reduceret i HDAC4-siRNA SGC-7901 celler efter p21 knockdown (figur 5B, ** P
< 0,01, *** P
< 0,001). p21 knockdown dramatisk svækket celledeling hæmning i HDAC4-siRNA SGC-7901 celler (figur 5C, * P
< 0,05, ∧∧ P
< 0,01). ATP-niveau blev øget, men intracellulær ROS generation faldt i siRNA-p21-HDAC4 gruppen sammenlignet med siRNA HDAC4 gruppen (figur 5D, * P
< 0,05, ** P
<0,01). p21 nedregulering betydeligt svækket G0 /G1 anholdelse og S fag hæmning i HDAC4-siRNA SGC-7901 celler (figur 5E og F, * P
< 0,05). Immunoblotting viste, at mængden af ​​Bcl-2 var signifikant højere, men Bax var lavere i siRNA-p21-HDAC4 celler (figur 5G). Celleapoptosen faldt markant i siRNA-p21-HDAC4 SGC-7901 celler sammenlignet med siRNA HDAC4 gruppe (figur 5H). Det blev også observeret, at p21 knockdown kunne redde den øgede autofagi præget fluorescerende pletter (fig 5I) og ATG 7, Beclin 1 og LC3II proteiner ekspression i SGC-7901 celler induceret af siRNA HDAC4 (figur 5J). Kollektivt, disse data viste, at nedregulering af p21 kunne efterligne effekten af ​​HDAC4 overekspression og kan være en vigtig mediator i HDAC4-medieret SGC-7901 promotion cellevækst.

Diskussion

Talrige HDAC inhibitorer, som har vist sig at inhibere proliferation og inducerer differentiering eller apoptose i tumorceller, er ved at blive undersøgt i kliniske forsøg, enten som anticancermidler eller sammen med anden behandling [13]. Høj ekspression af HDAC1 /2 blev fundet i gastriske carcinoma væv [14]. I vores undersøgelse, viste vi, at HDAC4 udtryk var opreguleret i gastrisk cancer væv og cellelinier in vitro
. HDAC4 nedregulering i SGC-7901 celler undertrykte celleproliferation og de kolonidannelse numre, standset cellecyklus og induceret celle apoptose afhænger af aktivering af caspaser 3 og 9, som er i overensstemmelse med de anti-proliferative og proapoptotiske virkninger af HDAC-inhibitorer i humane cancer cellelinjer [15] og med den tidligere rapporterede observation, at HDAC4 nedregulering reducerer klonogene overlevelse og inducerer apoptose i HeLa-celler [5]. Den proproliferative virkning HDAC4 i gastriske cancerceller stemmer overens med tidligere rapporteret for de klasse I HDAC, HDAC1, -2, og -3 [16]. Således kan målrette inhibering af HDAC4 aktivitet være en potentiel terapeutisk tilgang til behandling af gastrisk cancer.

Autophagy er hovedsageligt en proteinnedbrydning system cellens egne lysosomer. En række stress-signaler, såsom næringsstofudsultning eller behandling med forskellige anticancer-midler, stimulere autophagy proces [17]. Autophagy er generelt karakteriseret ved tilstedeværelsen af ​​autophagosomes og en stigning i spaltning af LC3 [18]. Rolle autofagi i celledødsprocessen er kontroversielt, men det er blevet bekræftet, at krydstale mellem apoptose og autofagi er afgørende i programmeret celledød [19]. I vores undersøgelse, blev induktionen af ​​autofagi i HDAC4-siRNA SGC-7901 celler fremgår af punktformig mønster af LC3 immunofarvning og akkumuleringen af ​​biokemiske kendetegnende proteiner af autophagy (Atg7, Beclin 1 og LC3) ved western blot-analyse. Autophagy hæmning af inhibitor 3-MA svækket den autophagy induktion i HDAC4-siRNA SGC-7901 celler. Således har vi spekuleret autofagi indtraf, beskytte SGC-7901 cancerceller apoptose induceret af HDAC4 knockdown.

p21-protein, også kendt som cyclin-afhængig kinase (CKD) inhibitor 1, regulerer G1-fasen progression af cellecyklus . p21 er ofte mis-reguleret i humane cancere, og det kan fungere som en tumorsuppressor eller som et onkogen [20]. Dem med p21-positive og p53-negative kræftformer har væsentligt højere overlevelse kurver i gastrisk karcinom [21], mens tabet af p21-ekspression sammen med øget p53 detektion er forbundet med dårlig prognose og nedsat samlet overlevelse i gastrisk kræft [22]. I overensstemmelse med det resultat, at p21-protein blev nedreguleret i de gastrisk cancer væv [23], observerede vi, at HDAC4 fremmer gastrisk cancer celleproliferation og vækst, medieret af undertrykkelsen af ​​p21 i gastriske cancerceller, og er ledsaget af en stigning i ATP-niveauer og undertrykkelse af ROS-generering. Derfor har vi undersøgt, om p21 var en vigtig mediator for HDAC4-medieret SGC-7901 promotion cellevækst. I denne undersøgelse HDAC4 knockdown signifikant inducerede forøget ekspression af p21-protein, mens HDAC4 overekspression faldt betydeligt ekspressionen af ​​p21-protein i SGC-7901 celler. Disse data underforståede, at p21 kan være et nedstrøms mål for HDAC4. Funktionelle analyser viste nedregulering af p21 kunne efterligne effekten af ​​HDAC4 overekspression på SGC-7901 cellevækst forfremmelse. Tilsammen disse resultater antydede, at HDAC4 nedregulering kunne fremme SGC-7901 celle apoptose med op-regulering p21-ekspression. p21 kan være et tumor-suppressor i udviklingen og progressionen af ​​gastrisk cancer, kan ekspressionen af ​​hvilken støtten i at kontrollere en række maligne adfærd af mavekræft. Men den potentielle relevans af HDAC4 regulering af p21-ekspression behov, også skal ses i sammenhæng med, at der er flere vigtige faktorer og veje, der potentielt modulerer ekspressionen af ​​p21 i mavekræft.

Tilsammen vores resultater har afslørede en vigtig rolle for HDAC4 kontrollere human gastrisk cancer cellelinje SGC-7901 udvikling via regulering af p21, hvilket tyder på, at ændring af HDAC4 ekspression og /eller aktivitet kan være en vigtig begivenhed i løbet af mavekræft. Afslutningsvis disse resultater identificerer HDAC4 som en vigtig regulator for spredning af mavekræft gennem undertrykkelse af p21 in vitro
.

• PLoS ONE: Cirkulerende tumorceller (CTCs) Fundne ved RT-PCR og dens Prognostisk Rolle i Gastric Cancer: En metaanalyse af Udgivet Literature
• PLoS ONE: MUC5AC Upstream Komplekse Gentagne Region polymorfier er forbundet med modtagelighed og klinisk fase af gastrisk Cancer