PLoS ONE: didinimas spinduliuotės iki Ursolic rūgšties BGC-823 Žmogaus adenokarcinoma Skrandžio vėžio ląstelių Line

Anotacija

Neseniai atlikti tyrimai rodo, kad kai kurios augalinės kilmės polifenoliai, ty ursolic rūgštis (UA), kuris pranešama, kad priešvėžinius veiklą, gali būti naudojamas atkreipti auglio ląsteles radioterapija slopindamas kelius pirmaujančių atsparumo radioterapija. Šis eksperimentas buvo sukurta siekiant ištirti poveikį ir galimą mechanizmą radiosensitization pagal UA į BGC-823 ląstelių linijos iš žmogaus adenokarcinoma skrandžio vėžio in vitro
. UA sukelia toksiškumą dozės priklausomu būdu, ir mes naudojamas sub-citotoksiškumo koncentracija iš UA išbandyti radioenhancement veiksmingumas UA skrandžio vėžio. Radioczulość nulėmė clonogenic išgyvenimo testą. Išgyventi frakcija Kombinuotosios grupės su švitinimo ir sub-citotoksiškumo UA gerokai sumažėjo, palyginti su švitinimo grupei. Pagerinta radiosensitization veiksmingumas buvo susijęs su padidintu G2 /M arešto, padidėjo reaktyvių deguonies formų (ROS), žemyn reguliuojama Ki-67 lygį ir pagerinti apoptozę. Taigi, kaip UA parodė stiprus antiproliferation poveikį ir sinergetinį poveikį, jis gali būti naudojamas kaip potencialus narkotikų dirgikliu dėl spindulinės terapijos taikymo

nurodomoji dalis:. Jonas Y Jiang M Hu J, LV X, J. L , Qian X, ir kt. (2015) didinimas spinduliuotės iki Ursolic rūgšties BGC-823 Žmogaus adenokarcinoma skrandžio vėžio ląstelių linija. PLoS ONE 10 (7): e0133169. Doi: 10,1371 /journal.pone.0133169

redaktorius: Jian-Hua Mao Lorenco Berklio nacionalinės laboratorijos, Kalifornijos universitetas, Berklis, JAV

Įstojo: Sausis 26, 2015 m Priėmė: Birželis 24, 2015 m Paskelbta: Lie 15, 2015

Visos teisės saugomos: © 2015 Yang et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Duomenų Prieinamumas: Visi susiję duomenys yra per popieriaus

finansavimas:. Palaikoma dotacijas iš nacionalinio Gamtos mokslo fondo Kinijos (dotacijos Nr 81.172.094), Top šešis talentus projektas Dziangsi provincijos (dotacijos Nr 2011ws005), ir medicinos mokslo ir technologijų plėtros projektai Nanjing (dotacijos Nr ZKX10011). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Nors į sergamumo mažėjimas, skrandžio vėžys vis dar laikoma viena iš pagrindinių priežasčių, vėžio mirčių visame pasaulyje. Chirurgijos ir toliau būti bet gydomųjų ramstis; Tačiau maždaug du trečdaliai pacientų diagnozuotas skrandžio vėžys turi nerezekuojamas vietos pažangias ir /arba metastazavusiu liga. 5 metų išgyvenamumas pacientų, kuriems buvo diagnozuotas su pažangiomis sritinių skrandžio vėžiu ir buvo atlikta gydomoji rezekcija išlieka žemas dėl didelės rizikos vietos pasikartojimo ar tolimų metastazių, net jei rezekcija buvo manoma, kad gydomasis. [1] perspektyva atsitiktinių imčių intergrupy (INT) -0116 bandymus (556 pacientai) bei grįžtamąją galią turinčia Korėjos patirtis (990 pacientų) parodė į vietos pasikartojimo norma su pooperaciniu regioninio spinduliuotės kartu su chemoterapija mažinimą ir didesnį išgyvenamumas į pagalbinį rankos. [2] Radioterapijos yra pagrindinis Loco regionų valdymo modalumas už neįmanomu skrandžio vėžiu [3] Nacionalinė Išsami Vėžys tinklas (NCCN) gairėse rekomenduojama radioterapija kaip standartinis gydymas skrandžio vėžio pacientams, sergantiems didelės rizikos pasikartojimo.; [4] Tačiau, yra dviejų pagrindinių apribojimus, susijusius su gydant skrandžio vėžio su spinduliuotę: (1) vidinis arba įgytas atsparumas kartu su radioterapija; (2) nespecifinis toksiškumas į skrandžio gleivinę ir aplinkinių sveikų audinių. [2,5]

Jei spręsti šiuos apribojimus, kurie buvo pagaminti moksliniai bandymai ieškoti veiksmingo radiosensitizer iš žolelių su mažesne toksiškumo ir efektyvesnė. Naujausi tyrimai parodė, kad daugelis augalinės kilmės polifenoliai, įskaitant kurkuminas, flavopiridolio, emodin, ursolic rūgšties ir tt, gali būti naudojamas atkreipti auglio ląsteles chemoterapiniais preparatais ir radioterapija, slopindamas į kelius, padedančią atsparumo gydymui. [6,7, 8] Šios medžiagos taip pat buvo nustatyta, kad apsauginis nuo terapijos susijęs toksinis poveikis. [5] Ursolic rūgštis (UA) A pentacyclic triterpeno rūgštis, kuri yra laikoma viena iš perspektyviausių cheminių profilaktikos agentas vėžio, buvo įrodyta, kad tai paskatins priešvėžiniai veikla, įskaitant slopina naviko inicijavimo ir skatinimo. [9,10] Jis taip pat sukeltas naviko ląstelių diferenciaciją reguliavimo diferenciacijos konkrečių genų pelės F9 teratokarcinoma ląstelių išraiška. [11] Be to, ten buvo įrodymų, kad UA gaminami antiangiogeninis poveikis viščiuko chorioalantoic membranos ir anti-invazinės veiklos HT1080 žmogaus fibrosarkoma ląsteles. [12,13]

Tačiau prieš tyrimai dar įrodyti, ar UA gali padidinti radiacijos poveikį piktybiniai navikai , Eksperimentas buvo sukurta siekiant ištirti poveikį ir galimą mechanizmą in vitro radiosensitization pagal UA į BGC-823 ląstelių linijos iš žmogaus adenokarcinoma skrandžio vėžio suteikti teorinį paramą klinikiniam naudojimui.

Medžiagos ir metodai

ląstelių kultūros

BGC-823 ląstelės buvo gauti iš Šanchajaus instituto ląstelės biologijos (Šanchajaus, Kinijos) ir saugomi RPMI 1640 terpėje, turinčioje 10% veršiuko jaučio serumo 37 ° C temperatūroje, vandens-prisotintoje atmosferoje su 5% CO _2.

ląstelių citotoksiškumo tyrimas

citotoksiškumas nulėmė MTT atliktas anksčiau paskelbtas. [14] Kad būtų aiškiau, ląstelės buvo padengtas 8 × 10 ^{3 ląstelės per gerai į 96-duobučių lėkštelėse ir leidžiama pridėti naktį. Tada, ląstelės buvo gydomi įvairios koncentracijos UA (0, 5, 6,25, 10, 12,5, 20, 40, 50ug /ml) 48H Atliekant trijų atkartoti šulinius minimumo. Kiekvienas gerai tada buvo įtraukta 20ul MTT, paruošti sumaišant 5 mg MTT su 1 ml fiziologinio tirpalo ir inkubuojama už papildomą 4h. Vidutinio kiekvieną šulinėlį buvo pakeistas su 150ul DMSO. Optinių buvo nustatomas plokštelėse skaitytojui (PVP-RAD) esant 490nm. Tuščiosios kontrolės šuliniai buvo naudojami nulio absorbcija. Slopinimas norma (IR%) buvo apskaičiuotas naudojant background-ištaisyti absorbcija pagal šią lygtį:.}

SSD _{50 buvo apibrėžta kaip koncentracija, reikalinga 50% slopina ląstelės augimo}

Mobilusis grupavimas ir in vitro jonizuojančia radiacija

Ląstelės buvo atsitiktiniu būdu suskirstytos į 4 grupes: kontrolė (a) grupę, UA grupė (B), radioterapija (RT), grupė (C), ir kartu grupė (D ). Į BGC-823 ląstelės buvo auginamos 6-duobučių lėkštelėse, o tada grupė B ir D buvo gydomi UA, o C ir D grupės buvo apšvitinti naudojant 6-MeV elektronų pluošto linijiniu greitintuvu (Elekta, Švedija).

clonogenic išlikimo analizė

Radioczulość nulėmė clonogenic išgyvenimo testą. Ląstelių (500-2000 vienam pat) buvo padengtas į 6-duobučių lėkštelėse ir leidžiama pridėti naktį. Tada ląstelės buvo gydomi UA (0, 6,25 ir 10ug /ml) 24h ir po to paveikiami didinant dozes RT (0, 2, 4, 6 ir 8Gy). Po to, kai 10-14 dienų inkubacijos, kolonijos sudarė daugiau nei 50 ląstelių buvo pastebėtas. Kolonijos buvo kruopščiai nuplauti, tamsintas su etanoliu /violetinei dažų, ir tada suskaičiuoti. Dengimo efektyvumą (PE), buvo apskaičiuota kaip (vidutinis kolonijų skaičius /pasėtų ląstelių) ir išlikęs frakcija (SF) buvo apskaičiuota kaip [reiškia kolonijų skaičius /(pasėtų ląstelių × PE)], kur PE buvo apibrėžiamas kaip (vidutinis kolonijų skaičius dėl JT apšvitinti prevencija /pasėtų ląstelių). D _{0 vertybės buvo apskaičiuojamas kelių tikslinės vieno populiaraus modelio [s = 1 - (1-e ^{-D /D0) N.], kuris atstovavo vidutinę dozę mirtiną poveikį. Jautrikliui didinimo santykis (SEA) buvo apskaičiuota kaip D 0 santykis tarp kombinuoto gydymo ir gydymu vien RT.}}

Mobilaus ryšio ciklo analizė

ląstelių ciklo įtaka buvo analizuojami naudojant propidiumo jodidas /RNazės buferis (BD Pharmingen, San Chosė, CA, JAV) dažymo pagal gamintojo instrukcijas. 2,5 × 10 ^{5 ląstelės buvo padengtas į 6-duobučių lėkštelėse ir leidžiama pridėti naktį. Tada ląstelės buvo gydomi UA (0 ir 10ug /ml) 24 val ir po to paveikiami RT (0 ir 2Gy) už 48h. Ląstelės buvo surinkti trypsinization, nustatyta iš 70% etanolio -20 ° C temperatūroje, išplautos PBS, resuspenduotos 1 ml PBS, kurių sudėtyje yra 1 mg /ml RNazės ir 50 ug /ml propidiumo jodidas, inkubuojamas esant už 30 min tamsoje, esant 37 ° C, ir analizuojami tėkmės citometrijos (FACScan, Becton Dickinson Sunnyvale, CA, JAV).}

Matavimo apoptozės

ląstelės kiekybinis apoptozės ląstelių buvo įvertintas naudojant aneksino-V-FITC apoptozę nustatymo rinkinys (BD Pharmingen, San Chosė, CA, USA) pagal gamintojo instrukcijas. 2,5 × 10 ^{5 ląstelės buvo padengtas į 6-duobučių lėkštelėse ir leidžiama pridėti naktį. Tada ląstelės buvo gydomi UA (0 ir 10ug /ml) 24 val ir po to paveikiami RT (0 ir 2Gy) už 48h. Ląstelės buvo surinkti trypsinization, ir resuspenduojamos 500ul privalomosios buferio, ir 5ul aneksino-V-fluoresceino izotiocianatu (FITC), ir tada, buvo pridėta 5ul iš propidiumo jodido (PI),. Tyrimai buvo atliekami su tėkmės citometrijos.}

aptikimas reaktyvių deguonies formų (ROS) karta

intraceliulinės ROS koncentracija buvo aptikta naudojant membrana pralaidi fluorescencinė zondai 2 ", 7'-dichlorofluorescin diacetatas (DCFH-DA) (Beyotime, Haimen, Jiangsu, Kinija) pagal gamintojo instrukcijas. 1 × 10 ^{6 ląstelės buvo padengtas į 6-duobučių lėkštelėse ir leidžiama pridėti naktį. Tada ląstelės buvo gydomi UA (0 ir 10ug /ml) 24 val ir po to paveikiami RT (0 ir 2Gy) už 48h. Ląstelės buvo renkami trypsinization, sumaišymo DCFH-DA už 30min, nuplauti RPMI 1640 serumo nemokamai, o tada aptikta tėkmės citometrijos metodą. Vidutinė fluorescencinė intensyvumas (PFI) atstovavo ląstelėje ROS lygį.}

imunohistocheminį dažymo vertinant Ki-67 raišką

Ki-67 baltymo ekspresija buvo įvertintas avidino-biotinas sudėtingos Imunohistocheminiais (ZSGB-BIO Pekinas, Kinija) pagal gamintojo instrukcijas. 2 × 10 ^{4 ląstelės buvo padengtas į 6-duobučių lėkštelėse su dangčiu slydimo kiekvienam gerai, ir leidžiama pridėti naktį. Tada ląstelės buvo gydomi UA (0 ir 10ug /ml) 24h, ir po to paveikiami iki kambario temperatūros (0 ir 2Gy) 24h. Tada danga lapeliai buvo nustatytas 4% paraformaldehido, inkubuojami su 0,5% Triton X-100 už 20min, išplauti PBS ir inkubuojami su 3% H _{2O 2 už 15min. Praplovus PBS tris kartus, ląstelių, kurios buvo pridėtos ant viršelio lapeliai buvo inkubuojami Ki-67 monokloninių antikūnų 60 min 37 ° C temperatūroje, ir tada plauti PBS dar kartą. Biotinas konjuguoto antriniai antikūnai už 20min prie 20-37 ° C, plaunamas PBS keturis kartus, tada sutepa DAB Dažymo KIT, nuplauti vandeniu, o tada counterstained hematoksilinu.}}

Statistinė analizė

duomenys buvo pateikiami kaip vidurkis ± SD, ir reiškia palyginimai buvo atlikti vieną pusę ANOVA. P < 0,05 buvo priimta kaip statistiškai reikšmingas. Statistinė analizė atlikta naudojant SPSS, v. 17.0.

Rezultatai

citotoksinis poveikis UA apie bgc-823 ląstelių

citotoksinis poveikis UA ant bgc-823 ląstelių buvo paskaičiuojama pagal MTT. Mes nustatėme, kad UA priklausomai nuo dozės padidėjo citotoksiškumo į skrandžio vėžio ląstelių linijos BGC-823 (1 pav). Pusinės eliminacijos maksimalus slopinanti koncentracija (SSD _{50) vertės BGC-823 buvo 17.5ug /ml. Šiek tiek citotoksiškumo (< 15%) iš UA už bgc-823, 10ug /ml buvo naudojama vėlesniuose planuojamų eksperimentų, kontroliuoti dėl radioenhancement dėl ​​tiesioginio citotoksinio poveikio}

Apie radiosensitization poveikis UA in. in vitro

Mobilusis išgyvenimo kreivės matuojami clonogenic išgyvenimo tyrimą buvo parodyta 2 pav Palyginti su RT tik SF _{2 RT kartu su UA žymiai sumažėjo bgc-823 ląstelių, SER vertės Kombinuotosios grupių buvo 1,180 karto ir 1,315 kartus. Šie rezultatai parodė, kad UA sustiprino spinduliuotės poveikį BGC-823 A priklausomai nuo dozės būdu per šiek tiek citotoksiškumo koncentracija.}

Mobilusis ciklas paskirstymas ir sukeliama apoptozė.

Jei ištirti, ar RT /arba UA gydymas gali sukelti bet kokią ląstelės ciklo pasipiktinimas, kurio BGC-823 ląstelių gydomiems 2Gy švitinimo ir /ar 10ug analizė /ml, UA buvo atliktas. Palyginti su kontroline grupe, 10ug /ml UA vien davė beveik neturi įtakos ląstelės ciklo poveikį. Tačiau kartu grupė UA ir švitinimo sukelta ląstelių ciklo arešto tuo G _{1 etapas (51.87% vs 60,28%, p = 0,13) ir G 2 /M etapas (3,14%, palyginti su 13,67%, P <; 0,01), palyginti su 2Gy švitinimo grupės (pav 3A ir 3C). Šie rezultatai rodo, kad derinys gydymas gali sukėlė G 1 etapas ir G 2 /M fazių areštą, kuris buvo labiau linkusios į žalingo radiacijos. Panašios išvados iš ląstelinio ciklo duomenys buvo įrodyta ankstesniame tyrime [15].}

iš UA ir švitinimo derinys taip pat gali sukelti daugiau Apoptozė ląstelių mirtį kaip parodyta pav 3B. Iš apoptozinių ląstelių dalis gerokai padidėjo taikymo tiek UA ir apšvitinimo bgc-823 ląstelių, o ne UA arba IR gydyti vien. (78,2% vs 9,6% ir 12,5%, p < 0,01, pav 3D)

UA padidėjo RT sukeltas ROS susidarymą

Jis yra plačiai pripažįstama, kad elementas žmogžudystė po Jonizuojančios spinduliuotės poveikis iš dalies keisdamas ROS [16]. ROS analizė naudojant DCF-DA gaminami vidutinę fluorescencinės intensyvumą (PFI), kuris atstovaujama ląstelėje reaktyviųjų deguonies formų lygį iš kiekvienos grupės (pav 4a ir 4b). PFI vien UA grupės, vien RT grupę ir UA RT grupės padidėjo 1,15 kartus, 1,53 karto ir 2,09 karto, lyginant su kontroline grupe. Iš ROS deriniu grupės lygis žymiai padidėjo, palyginti su RT grupės, atskleisti, kad pridedant UA RM sukelta daugiau ROS susidarymą nei vien RT.

imunohistocheminį dažymo Ki-67

Kar -67 buvo žinomas kaip branduolinės antigeną, kuris dažnai koreliuoja su ląstelių proliferaciją. Mūsų eksperimentas aptiko teigiamą pajamų normą Ki-67 baltymų imunohistocheminiu dažymo, ir rezultatai buvo parodyta pav 5. procentinė dalis Ki-67 teigiamų ląstelių jungtinis grupė žymiai sumažėjo, palyginti su kontroline grupe, taip pat spindulinės terapijos grupės .

Diskusijos

Šis tyrimas nagrinėjo poveikį ir galimą mechanizmą UA kaip radiosensitizer. MTT tyrimas ir clonogenic išlikimo tyrimas parodė, kad IR kartu su UA buvo pranašesnis citotoksiškumo nei vien IR. Šis poveikis buvo pastebėtas abiejose grupėse su skirtingais Sub-citotoksiškumo koncentracijos UA, 6.25ug /ml ir 10ug /ml. Šią dozę, UA turėjo nedidelį toksiškumą žmogaus adenokarcinoma skrandžio vėžio ląstelių linijos BGC823 ir neturėjo reikšmingos citotoksiškumo įprastinį skrandžio ląstelių linija. [17] Tai parodė, kad UA buvo perspektyvi radiosensitization in vitro
.

Centrinė vėžio radioterapija yra maksimaliai gydomasis poveikis naviko audinio kartu iki minimumo sumažinant į sveikų audinių žalą. Nors Kruopščiai sukurtas planavimas ir vėliausios fizinės metodai gali saugiai padidinti radiacijos dozė naviko audinyje, kartu mažinant dozę iki aplinkinių sveikų audinių, [18] Dabartinės Radioterapijos metodai vis dar negali išvengti sužeisti netoliese normalius audinius. Daugiau spindulinės terapijos nauda galima rasti nagrinėjant biologinį atsaką naviko mikroaplinkos atskleisti, kaip padidinti naviko jautrumą radiacijai arba slopina šalutinį poveikį radiacijos. [19]

normaliuose audiniuose aplink skrandžio vėžio, pavyzdžiui, žarnyno ir skrandžio, yra jautrūs jonizuojančia spinduliuote. Kaip rezultatas, turi būti ribojamas jonizuojančiosios spinduliuotės dozės į naviko audinyje. Be to, sutapo šalutinis poveikis jonizuojančiosios spinduliuotės sustiprins radioterapija šalutinį poveikį, ir net nutraukti gydymą. Sub-citotoksiškumo koncentracija UA kartu su jonizuojančiąja spinduliuote, tačiau gali padidinti toksiškumą jonizuojančiosios spinduliuotės, o mažos koncentracijos UA yra beveik nekenksmingi normaliuose audiniuose. Ši strategija gali padidinti terapinis indeksas naviko audinyje nedidinant radiacijos dozę ir spindulinės terapijos šalutinio poveikio pavojus.

Jei nustatyti radiosensitization iš UA mechanizmą, mes atliekame analizę kelis žingsnius. Pirma, mes analizuojami ląstelės ciklo paskirstymą. Sub-citotoksiškumo koncentracija UA nedavė jokios reikšmingos įtakos ląstelės ciklo, o palyginti su jonizuojančiosios spinduliuotės vien, bendra gydymo sustiprintą G _{2 /M sustojimas. Ląstelių Radioczulość koreliuoja su ląstelių ciklo, o koreliacija yra didesnis G 2 /M fazės ir mažesnis S fazėje. Tai gali būti svarbiausias pagrindines priežastis, dėl glaudesnio radiosensitization pastebėtas šiame tyrime. Antra, mes išanalizavo ląstelėje ROS lygį. ROS lygis mišriai grupei gerokai padidėjo, palyginti su kontroline grupe, UA vien grupės, ar net jonizuojančiosios spinduliuotės grupei. Iš UA be jonizuojančiosios spinduliuotės sukelta daugiau ROS susidarymą. Jonizuojanti spinduliuotė sukeltas vandens Radioliza, kuris generuoja ROS, pavyzdžiui, hidroksilo radikalų ir superoksido. Šie ROS molekulės suvaidino svarbų vaidmenį jonizuojančiosios spinduliuotės sukelta ląstelių pakitimai, pavyzdžiui, oksidacinis DNR pažeidimus, o tai gali lemti tiek clonogenic mirties ir apoptozės. Trečia, šiame tyrime, mes nustatėme, kad Ki-67-teigiamų ląstelių kombinuotą grupės dydis, sumažėjo žymiai, palyginti su kontroline grupe arba radioterapija grupės. Ki-67 yra žinomas kaip ląstelių ciklo susijusio antigeno ir naudingosios proliferacijos žymeklį. Ki-67 baltymo lygis koreliuoja su didesniu platinimo ir metastazių galimybes. [20,21]}

Taigi, dabartinis tyrimas yra pirmasis bandymas įrodyti, kad UA gali synergize su jonizuojančiąja spinduliuote prieš žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijų , Pagrindinė mechanizmas geresnis radiosensitization veiksmingumas gali būti sustiprintas G2 /M sustojimas, padidėjęs ROS ir žemyn reguliuojama Ki-67 lygį. Bendrai, kaip UA parodė, stiprus antiproliferation poveikį ir sinergetinį efektą, jis gali būti naudojamas kaip galimas gydymo vaistais sensibilizatoriaus Radioterapinių taikymo. Tačiau tai be abejo, kad reikia atlikti tolesnius tyrimus, siekiant įvertinti galimybes ir naudą, naudojant tradicinius kinų medicinos radiosensitizers prieš faktinį klinikinėje praktikoje. Daugiau eksperimentai ir atsikirtimai, reikia kitų tipų navikais ir gyvūnų tyrimų, siekiant patvirtinti, kad siūlomos strategijos veiksmingumą.

• PLoS ONE: MicroRNA-206: Efektyvus slopinimas skrandžio vėžio progresavimo per c-met būdas
• PLoS ONE: klinikinė reikšmė MLH1 metilinimas ir CpG Island Methylator Fenotipas kaip prognostiniai Žymekliai pacientams, sergantiems skrandžio vėžiu