PLoS ONE: Erweiterung der Radiation Effects Ursolsäure in BGC-823 menschliche Adenokarzinom Gastric Cancer Cell Line

Abstrakt

Die neuere Forschung hat vorgeschlagen, dass bestimmte Pflanzen abgeleiteten Polyphenolen, dh Ursolsäure (UA), die berichtet Antitumor- Aktivitäten aufweisen, können verwendet werden, um Tumorzellen zu Strahlentherapie durch Hemmen Wege führt zu einer Strahlentherapie Widerstand sensibilisieren. Dieses Experiment wurde entworfen, um die Auswirkungen und möglichen Mechanismus von radiosensitization von UA ​​in BGC-823-Zelllinie aus menschlichen Adenokarzinoms Magenkrebs In-vitro-
zu untersuchen. UA verursachte Zytotoxizität in einer dosisabhängigen Art und Weise, und wir haben eine Unter Zytotoxizität Konzentration von UA ​​radioenhancement Wirksamkeit mit UA in Magenkrebs zu testen. Radiosensitivity wurde von klonogenen Überleben Test bestimmt. Die überlebenden Anteil der kombinierten Gruppe mit Bestrahlung und Unter Zytotoxizität UA verringerte sich signifikant mit der Bestrahlungsgruppe verglichen. Die verbesserte radiosensitization Wirksamkeit wurde mit verbesserter G2 /M Stillstand verbunden sind, erhöhte reaktive Sauerstoffspezies (ROS), herunterreguliert Ki-67-Ebene und eine verbesserte Apoptose. Abschließend als UA potente antiproliferative Wirkung und synergistische Wirkung zeigte, könnte es als ein potenzielles Medikament Sensibilisator für die Anwendung von Strahlentherapie verwendet werden

Citation:. Yang Y, Jiang M, Hu J, Lv X, Yu L , Qian X, et al. (2015) Verbesserung der Radiation Effects Ursolsäure in BGC-823 humane Adenokarzinom-Magenkrebs-Zelllinie. PLoS ONE 10 (7): e0133169. doi: 10.1371 /journal.pone.0133169

Editor: Jian-Hua Mao, Lawrence Berkeley National Laboratory, University of California, Berkeley, UNITED STATES

Empfangen: 26. Januar 2015; Akzeptiert: 24. Juni 2015; Veröffentlicht: 15. Juli 2015

Copyright: © 2015 Yang et al. Dies ist ein offener Zugang Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons Attribution verteilt, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorgesehen sind der ursprüngliche Autor und Quelle genannt

Datenverfügbarkeit: Alle relevanten Daten innerhalb des Papiers sind

Finanzierung:. Unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Natural Science Foundation of China (Grant No 81172094), Top Six Talents Projekt in der Provinz Jiangsu (Grant No 2011ws005) und medizinischen Wissenschaft und Technik Entwicklungsprojekte von Nanjing (Grant No ZKX10011). Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Trotz eines Rückgangs der Inzidenz ist Magenkrebs immer noch eine der führenden Ursachen von Krebs verursachten Todesfälle weltweit betrachtet. Chirurgie bleibt die Grundlage jeder Heilbehandlung zu sein; jedoch etwa zwei Drittel der Patienten mit Magenkrebs diagnostiziert haben inoperablem, lokal fortgeschrittenem und /oder metastasierten Erkrankung. Die 5-Jahres-Überlebensrate von Patienten, die mit fortgeschrittenen lokoregionale Magenkrebs diagnostiziert wurden und kurative Resektion bleiben aufgrund der hohen Lokalrezidivrisiko oder Fernmetastasen, auch wenn Resektion kurativ zu niedrig war gemacht geglaubt. [1] Eine Perspektive randomisierten Inter (INT) -0116-Studie (556 Patienten) und retrospektive koreanische Erfahrung (990 Patienten) zeigte gekoppelt, um eine Reduktion der Lokalrezidivrate mit postoperativen regionalen Strahlung mit einer Chemotherapie und eine höhere Überlebensrate in der adjuvanten Arm. [2] die Strahlentherapie das ist Haupt lokoregionale Kontrolle Modalität für inoperablen Magenkrebs [3] Die National Comprehensive Cancer Network (NCCN) Richtlinien Strahlentherapie als Standardbehandlung für Patienten mit Magenkrebs mit einem hohen Risiko eines erneuten Auftretens empfehlen. [4] Es gibt jedoch zwei wesentliche Beschränkungen im Zusammenhang mit Magenkrebs mit Strahlung Behandlung: (1) intrinsische oder Resistenz gegenüber Strahlentherapie erworben; (2) nicht-spezifische Toxizität gegenüber Magenschleimhaut und umgebenden normalen Geweben. [2,5]

Um diese Einschränkungen zu begegnen, haben wissenschaftliche Versuche unternommen worden, für eine effektive radiosensitizer aus Kräutern mit einer geringeren Toxizität und höhere Wirksamkeit zu suchen. Die neuere Forschung hat vorgeschlagen, dass viele Pflanzen stammende Polyphenole, einschließlich Curcumin, Flavopiridol, Emodin, Ursolsäure und etc, könnte verwendet werden, um Tumorzellen gegenüber Chemotherapeutika und Strahlentherapie sensibilisiert durch die Wege Hemmung der Behandlung Widerstand führt. [6,7, 8] Diese Mittel haben sich ebenfalls als Schutz von der Therapie-assoziierten Toxizitäten gefunden. [5] Ursolsäure (UA), einen pentacyclischen Triterpen-Säure, die für Krebs eine der vielversprechendsten chemopräventives Mittel angesehen wird, wurde Antitumor- gezeigt aufzufordern Aktivitäten, einschließlich der Tumor Initiierung und Förderung zu hemmen. [9,10] Es Tumorzelldifferenzierung durch Regulation der Expression von differenzierungsspezifische Gene in der Maus F9 Teratokarzinomzellen. [11] auch Zusätzlich induziert wurde der Beweis belegen, dass UA produziert eine anti-angiogene Wirkung in Küken chorioalantoic Membran und einer anti-invasive Aktivität in HT1080 humanen Fibrosarkom-Zellen. [12,13]

Allerdings hat frühere Untersuchungen noch zeigen, ob UA die Strahlenwirkung in bösartigen neubildungen verbessern können . Das Experiment wurde entwickelt, um die Auswirkungen und möglichen Mechanismus in vitro von radiosensitization von UA ​​in BGC-823-Zelllinie aus menschlichen Adenokarzinoms Magenkrebs zu erkunden die theoretische Unterstützung für den klinischen Einsatz zur Verfügung zu stellen.

Materialien und Methoden

Zellkultur

BGC-823-Zellen wurden aus Shanghai Institut für Zellbiologie (Shanghai, China) und gespeichert in RPMI 1640-Medium mit 10% Kälberrinderserum bei 37 ° C in einer wassergesättigten Atmosphäre erhalten mit 5% CO _2.

Zell Zytotoxizitätstest

Die Zytotoxizität von MTT-Test bestimmt wurde durchgeführt, die zuvor eine veröffentlichte. [14] veranschaulichen, wurden die Zellen bei 8 × 10 plattiert ^{3 Zellen pro Well in 96-Well-Platten und über Nacht anheften gelassen. Dann wurden die Zellen mit verschiedenen Konzentrationen von UA ​​behandelt (0, 5, 6,25, 10, 12,5, 20, 40, 50 ug /ml) für 48 h in einem Minimum von drei Vertiefungen zu replizieren. Jede Vertiefung wurde dann 20 ul MTT hinzugefügt, zubereitet von 5mg MTT mit 1 ml normaler Kochsalzlösung vermischt und für eine weitere 4h inkubiert. Medium in jeder Vertiefung wurde mit 150ul DMSO ersetzt. Die Absorption wurde mit einem Mikroplattenleser (BIP-RAD) bei 490 nm bestimmt. Die leeren Kontrollvertiefungen wurden für Nullstellung Absorption eingesetzt. Die Hemmungsrate (IR%) wurde unter Verwendung der Hintergrund-korrigierten Extinktion durch die folgende Gleichung berechnet:.}

Die IC _{50 als die Konzentration für die 50% ige Hemmung des Zellwachstums erforderlich ist definiert wurde}

Zellgruppierung und in-vitro-ionisierender Strahlung

Die Zellen wurden zufällig in 4 Gruppen eingeteilt: Kontrollgruppe (A), UA-Gruppe (B), Strahlentherapie (RT) Gruppe (C), und kombinierte Gruppe (D ). Die BGC-823-Zellen wurden in 6-Well-Platten kultiviert und dann Gruppe B und D wurden mit UA behandelt, während Gruppe C und D bestrahlt wurden unter Verwendung eines 6-MeV Elektronenstrahl Linearbeschleuniger (Elekta, Schweden).

klonogene Überleben Test

Strahlenempfindlichkeit wurde von klonogenen Überleben Test bestimmt. Zellen (500-2000 pro Vertiefung) wurden in Platten mit 6 Vertiefungen ausplattiert und über Nacht anheften gelassen. Dann wurden die Zellen mit UA behandelt (0, 6,25 und 10 ug /ml) für 24 Stunden und dann in steigenden Dosen von RT ausgesetzt (0, 2, 4, 6 und 8Gy). Nach 10-14 Tagen Inkubation bestand Kolonien mehr als 50 Zellen beobachtet wurden. Die Kolonien wurden sorgfältig, gefärbt mit Ethanol /Kristallviolett-Farbstoff und dann gezählt gewaschen. Die Platierungseffizienz (PE) wurde als (mittlere Koloniezahlen /Zellen ausgesät) berechnet und überlebende Fraktion (SF) wurde als [Koloniezahlen /(Zellen × PE ausgesät) bedeuten], wobei PE wie definiert wurde (mittlere Koloniezahlen für un-bestrahlten Kontrollen /Zellen ausgesät). D _{0 -Werte wurden durch eine Multi-Target-Single-Hit-Modell berechnet [S = 1 - (1-e ^{-D /D0) N], die die durchschnittliche Dosis einer letalen Exposition dargestellt. Sensitizer Enhancement-Verhältnis (SER) wurde als D berechnet 0 Verhältnis zwischen der Kombinationstherapie und RT allein.}}

Zellzyklusanalyse

Der Einfluss des Zellzyklus analysiert wurde Propidiumiodid /RNase Puffer (BD Pharmingen, San Jose, CA, USA) Färbung nach den Anweisungen des Herstellers. 2,5 x 10 ^{5-Zellen wurden in 6-well-Platten ausplattiert und über Nacht zu befestigen. Dann wurden die Zellen mit UA (0 und 10 ug /ml) für 24 h behandelt und dann auf RT ausgesetzt (0 und 2GY) für 48h. Zellen durch Trypsinisierung gesammelt, in 70% Ethanol bei -20 ° C fixiert, in PBS gewaschen, in 1 ml PBS resuspendiert, das 1 mg /ml RNase und 50 ug /ml Propidiumiodid, bei 37 ° C im Dunkeln für 30 min inkubiert, und durchflusszytometrisch (FACScan, Becton Dickinson, Sunnyvale, CA, USA) analysiert.}

Messung von Apoptose

Zellen Quantifizierung der Apoptose-Zellen wurde unter Verwendung eines Annexin-V-FITC Apoptosis Detection Kit (BD Pharmingen, San Jose, CA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers. 2,5 x 10 ^{5-Zellen wurden in 6-well-Platten ausplattiert und über Nacht zu befestigen. Dann wurden die Zellen mit UA (0 und 10 ug /ml) für 24 h behandelt und dann auf RT ausgesetzt (0 und 2GY) für 48h. Die Zellen wurden durch Trypsinisierung gesammelt und in 500 ul Bindungspuffer resuspendiert und 5 ul von Annexin-V-Fluorescein-Isothiocyanat (FITC), und dann 5 ul von Propidiumiodid (PI) wurden zugegeben. Die Analysen wurden Cytometrie mit einem Strömungsdurchgeführt.}

Detektion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) Generation

Die Konzentrationen von intrazellulären ROS detektiert wurden unter Verwendung der Membran-permeable fluoreszierenden Sonden 2 ', 7'-dichlorofluorescin diacetat (DCFH-DA) (Beyotime, Haimen, Jiangsu, China) gemäß den Anweisungen des Herstellers. 1 × 10 ^{6 Zellen wurden in 6-well-Platten ausplattiert und über Nacht zu befestigen. Dann wurden die Zellen mit UA (0 und 10 ug /ml) für 24 h behandelt und dann auf RT ausgesetzt (0 und 2GY) für 48h. Zellen durch Trypsinisierung gesammelt, resuspendiert DCFH-DA für 30min, gewaschen mit serumfreiem RPMI 1640 und dann durch Flusszytometrie nachgewiesen. Die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) dargestellt intrazellulären ROS.}

Die immunhistochemische Färbung für die Beurteilung der Ki-67-Expression

Ki-67 Protein-Expression durch die Avidin-Biotin-Komplex immunhistochemischen (ZSGB-BIO bewertet , Beijing, China) gemäß den Anweisungen des Herstellers. 2 x 10 ^{4-Zellen wurden mit einem Deckglas in 6-Well-Platten plattiert für jeden gut, und über Nacht zu befestigen. Dann wurden die Zellen mit UA (0 und 10 ug /ml) für 24 h behandelt und dann auf RT ausgesetzt (0 und 2GY) für 24 Stunden. Dann werden die Deckgläser wurden in 4% Paraformaldehyd fixiert, mit 0,5% Triton X-100 für 20 Minuten inkubiert, in PBS gewaschen und inkubiert mit 3% H _{2 O 2 für 15min. Nach dem Spülen wieder mit PBS dreimal Zellen, die auf den Deckgläsern befestigt wurden, wurden bei 37 ° C, mit Ki-67 monoklonalen Antikörpern für 60min inkubiert und dann in PBS gewaschen. Biotin-konjugierten Sekundärantikörper für 20 min bei 20 bis 37 ° C, mit PBS gewaschen viermal, dann gefärbt von DAB-Färbekit, mit Wasser gewaschen und dann mit Hämatoxylin gegengefärbt.}}

Die statistische Analyse

Die Daten wurden als Mittelwert ± SD angegeben und bedeuten Vergleiche durch Einweg-ANOVA durchgeführt wurden. P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angenommen. Die statistische Analyse wurde mit SPSS, v. 17.0.

Ergebnisse |

zytotoxischen Effekte von UA ​​auf BGC-823 Zellen

Die zytotoxische Wirkung von UA ​​auf BGC-823-Zellen beurteilt basierend auf dem MTT-Assay. Wir fanden, dass UA dosisabhängig Zytotoxizität in der Linie Magen-Krebszelle erhöht BGC-823 (Fig 1). Die halbmaximale Hemmkonzentration (IC _{50) Werte für BGC-823 war 17.5ug /ml. Geringe Zytotoxizität (< 15%) von UA ​​für BGC-823, 10 ug /ml, wurde für nachfolgende geplante Versuche verwendet, für die radioenhancement zu steuern durch eine direkte zytotoxische Wirkung}

Die radiosensitization Wirkungen von UA ​​in. vitro

Zellüberlebenskurven von klonogenen Überleben Test gemessen wurden in Bild 2. im Vergleich nur mit RT dargestellt, SF _{2 von RT mit UA kombiniert signifikant verringert BGC-823-Zellen, SER-Werte der kombinierten Gruppen waren 1.180-fach und 1.315-fach. Diese Ergebnisse zeigten, daß UA den Strahlungseffekt von BGC-823 in einer dosisabhängig Weise innerhalb einer leichten Zytotoxizität Konzentrationen.}

Zellzyklusverteilung und Induktion von Apoptose verstärkt.

Um zu untersuchen, ob RT und /oder UA Behandlung jeder Störung des Zellzyklus führen könnte, die eine Analyse der BGC-823-Zellen, behandelt mit 2GY Bestrahlung und /oder 10 ug /ml UA durchgeführt. Relativ zu der Kontrollgruppe, 10 ug /ml ergab UA alleine fast keine Wirkung auf den Zellzyklus. Allerdings ist die kombinierte Gruppe von UA ​​und Bestrahlung induzierten Zellzyklusarrest in der G _{1 Phase (51,87% VS 60,28%, p = 0,13) und die G 2 /M-Phase (3,14% VS 13,67%, p <0,01) im Vergleich mit der 2GY Bestrahlungsgruppe (3A und 3C). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Kombinationsbehandlung verursacht haben kann G 1 Phase und G 2 /M Phase Verhaftung, die anfälliger für die schädlichen Auswirkungen der Strahlung war. Die ähnlichen Schlussfolgerungen aus dem Zellzyklus Daten von früheren Studie nachgewiesen. [15]}

Die Kombination von UA ​​und Bestrahlung auch apoptotischen Zelltod führen könnten, wie durch 3B gezeigt. Der Anteil der apoptotischen Zellen im Wesentlichen durch die Anwendung sowohl UA und Bestrahlung in BGC-823-Zellen erhöht, wie allein UA oder IR-Behandlung gegenüber. (78,2% VS 9,6% und 12,5%, p < 0,01, Abb 3D)

UA erhöht RT
ROS-Bildung induziert

Es ist weithin anerkannt, dass die Strahlung nach der Exposition zelltötende ionisierender durch ROS vermittelt wird teilweise. [16] ROS Analyse DCF-DA unter Verwendung der mittleren Fluoreszenzintensität erzeugt (MFI), die intrazelluläre ROS jeder Gruppe (4A und 4B) dargestellt. MFI von UA ​​allein Gruppe, RT allein Gruppe und UA + RT-Gruppe um 1,15-fach erhöht, 1,53-fache und 2,09-fache im Vergleich mit der Kontrollgruppe. Die Höhe der ROS von der Kombinationsgruppe signifikant erhöht gegenüber der RT allein Gruppe, das enthüllt Zugabe UA auf RT mehr ROS-Bildung induziert als RT allein.

Immunhistochemische Färbung von Ki-67

Ki -67 wurde als nuclear antigen, bekannt, die oft mit der Zellproliferation korreliert. Unser Experiment nachgewiesen wird die positive Rate von Ki-67 Protein durch immunhistochemische Färbung, und die Ergebnisse wurden in Fig 5. Prozentsatz der Ki-67-positiven Zellen der kombinierten Gruppe dargestellt signifikant verringert im Vergleich mit der Kontrollgruppe, sowie der Strahlentherapie Gruppe .

Diskussion

Diese Forschung, die Auswirkungen und möglichen Mechanismus der UA als radiosensitizer sucht. Der MTT-Test und klonogenen Überleben Test zeigte, dass IR mit UA kombiniert allein in Zytotoxizität als IR überlegen war. Dieser Effekt wurde in den beiden Gruppen mit unterschiedlichen Unter Zytotoxizität Konzentrationen von UA, 6.25ug /ml und 10 ug /ml beobachtet. Bei dieser Dosis hatte UA geringe Zytotoxizität für die menschliche Adenokarzinom Magenkrebs-Zelllinie BGC823 und hatte keine signifikante Zytotoxizität auf normale Magen-Zelllinie. [17] Dies zeigte, dass UA eine viel versprechende radiosensitization war In-vitro-
.

Zentral Strahlentherapie Krebs therapeutische Wirksamkeit auf Tumorgewebe zu maximieren, während die Schäden an gesundem Gewebe zu minimieren. Während ausgefeilten Planung und letzten physikalischen Techniken sicher die Strahlendosis auf das Tumorgewebe steigern können, während die Dosis auf umgebende normale Gewebe zu reduzieren, [18] Strom noch Strahlentherapie Techniken können verletzt in der Nähe normalem Gewebe nicht vermeiden. Weitere strahlentherapeutischen Nutzen kann durch die Untersuchung der biologischen Reaktion der Tumor-Mikroumgebung gefunden werden, um aufzudecken, wie ein Tumorempfindlichkeit gegenüber Strahlung zu erhöhen, oder Nebenwirkungen von Strahlung verhindern. [19]

normale Gewebe um Magenkrebs, wie Darm und Magen, sind empfindlich gegenüber ionisierender Strahlung. Als Ergebnis muss die ionisierende Strahlungsdosis zur Tumorgewebe beschränkt sein. Darüber hinaus werden die überlappenden Nebenwirkungen von ionisierender Strahlung Strahlentherapie Nebenwirkungen verstärken und sogar Behandlung unterbrechen. Sub-Zytotoxizität Konzentration von UA ​​in Kombination mit ionisierender Strahlung, jedoch kann die Zytotoxizität erhöhen durch ionisierende Strahlung, während niedrige Konzentration UA ​​nahezu unschädlich zu normalen Geweben ist. Diese Strategie kann den therapeutischen Index zu Tumorgewebe zu erhöhen, ohne Strahlendosis und strahlentherapeutischen Nebenwirkung zu erhöhen.

, um den Mechanismus der radiosensitization von UA ​​zu identifizieren, führten wir Analyse in mehreren Schritten. Zunächst analysierten wir die Zellzyklus-Verteilung. Unter Zytotoxizität Konzentration von UA ​​brachte keine wesentlichen Auswirkungen auf den Zellzyklus, während Vergleich mit ionisierender Strahlung alleine, die kombinierte Behandlung verbesserte G _{2 /M Arrest. Die Strahlungsempfindlichkeit von Zellen auf Zellzyklus korreliert, und die Korrelation ist höher in der G 2 /M-Phase und der unteren in die S-Phase. Dies kann der wichtigste Grund für die verbesserte radiosensitization in dieser Studie beobachtet werden. Zweitens haben wir analysiert, die intrazellulären ROS Ebenen. Die ROS Ebene der Kombinationsgruppe signifikant erhöht im Vergleich mit der Kontrollgruppe, die UA allein Gruppe oder auch die ionisierende Strahlung Gruppe. Die Zugabe von UA ​​auf Strahlung induziert mehr ROS Bildung ionisieren. Ionisierende Strahlung induziert die Radiolyse von Wasser, das ROS erzeugt, wie Hydroxylradikale und Superoxid. Diese ROS Moleküle spielte eine wichtige Rolle bei der strahlungsinduzierten Zellläsionen ionisierender wie oxidative DNA-Schädigung, was möglicherweise zu führen sowohl klonogenen Tod und Apoptose. Drittens, die in dieser Studie fanden wir, dass Prozentsatz der Ki-67-positiven Zellen der Kombinationsgruppe signifikant mit der Kontrollgruppe oder der Strahlungstherapiegruppe im Vergleich abnahm. Ki-67 ist als ein Zellzyklus-assoziierten Antigen und einem nützlichen Proliferationsmarker bekannt. Ki-67 Protein-Ebene wird mit höherer Proliferation und Metastasen Fähigkeit korreliert. [20,21]}

Abschließend ist die vorliegende Studie der erste Versuch, zu zeigen, dass UA mit ionisierenden Strahlen gegen humane Zelllinien Magenkrebs synergieren könnte . Der zugrunde liegende Mechanismus der verbesserten radiosensitization Wirksamkeit kann die erhöhte G2 /M Arrest sein, erhöhte ROS und herunterreguliert Ki-67-Ebene. Zusammenfassend als UA potent antiproliferative Wirkung und synergistische Wirkung zeigte, könnte es als ein potenzielles Medikament Sensibilisator für die Anwendung von Strahlentherapie verwendet werden. Allerdings ist es ohne Zweifel, dass weitere Forschung ist notwendig, um die Durchführbarkeit und die Vorteile der Verwendung der traditionellen chinesischen Medizin als Radiosensitizern vor der tatsächlichen klinischen Anwendungen zu bewerten. Weitere Experimente und Replikationen sind in anderen Tumorarten und in Tierversuchen erforderlich, um die Wirksamkeit der vorgeschlagenen Strategie zu bestätigen.

• PLoS ONE: MicroRNA-206: Eine wirksame Hemmung der Magenkrebs Progression durch das c-Met-Bahn
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