PLoS ONE: Triukšmo slopinimo ir XB130 yra susijęs su abiem prognozė ir Chemosensitivity skrandžio vėžio

Anotacija

XB130 yra naujai būdingas adapteris baltymas, kuris buvo pranešta skatinti skydliaukės naviko augimą, tačiau jos vaidmuo kitų vėžio rūšių, pavyzdžiui, skrandžio vėžiu (GC) progresavimo lieka nežinoma. Taigi, mes ištirti ryšį tarp XB130 išraiškos ir GC pacientų prognozei asociacija. Dalykai buvo 411 pacientai, sergantys GC etapais į I-IV. XB130 išraiška buvo nagrinėjamas chirurginių egzempliorių GC. Kaplan-Meier analizė ir Cox proporcinės pavojai modelis buvo naudojamas siekiant įvertinti prognostinę reikšmę XB130 išlikimo ir pasikartojimo. Be to, GC ląstelės stabiliai transfektuotose XB130 trumpas segtukas RNR buvo įkurta analizuoti XB130 poveikį jautrumo chemoterapija. Rezultatai rodo, kad tiek XB130 mRNR ir baltymo ekspresija buvo aptikta įprastomis skrandžio audiniuose. I-III pacientų bendro išgyvenamumo laikas IV etapas pacientų ir ligos be laikotarpiui po radikalaus rezekcijos GC etape buvo žymiai trumpesnis, kai imunohistocheminis dažymas XB130 buvo mažas, nei kai Dažymo buvo didelis (tiek P
< 0,05). XB130 sąvoka taip pat prognozavo, naviko jautrumą kelių chemoterapiniais preparatais. Gyvybingumas ir XB130-Silenced SGC7901 ląstelės ir laukinio tipo ląstelės buvo numalšinta 5-fluorouracilu (5-FU), cisplatinos ir irinotekano dozės priklausomas būdu, bet cisplatina ir irinotekano, buvo jautresni prieš sXB130-engiamų GC ląstelių ir 5-FU parodė didesnį jautrumą laukinio tipo ląsteles. Kai gydomi 5-FU, pacientai, sergantys didelio išraiška XB130 navikų buvo didesnis išgyvenamumas nei tie, su ekspresija maža navikų. Šie rezultatai rodo, kad sumažėjęs XB130 baltymo ekspresija yra prognostinė biologinis trumpesnį išlikimo ir didesnis pasikartojimo dažnis pacientams, kuriems GC, taip pat atsako į chemoterapiją

nurodomoji dalis:. Shi, M, Huang W Lin L , Zheng D, Zuo Q, Wang L, ir kt., (2012) Triukšmo slopinimo ir XB130 yra susijęs su abiem prognozė ir Chemosensitivity skrandžio vėžio. PLoS vieną iš 7 (8): e41660. Doi: 10,1371 /journal.pone.0041660

redaktorius: Zilong Wen Jiabao, Honkongo mokslo ir technologijos universitetas, Kinija

Įstojo: Kovo 31, 2012; Priėmė: Birželis 24, 2012 m Paskelbta rugpjūčio 23, 2012

Visos teisės saugomos: © Shi et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis darbas parėmė dotacijas iš nacionalinės programos dėl bendrųjų pagrindinio tyrimo projekto (2012CB945100, į WL ir il), komanda programa gamtos mokslo fondo Guangdong Province, Kinija (S2011030003134, į WL ir il). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Onkogeny ir anti-Onkogeny vaidina labai svarbų vaidmenį kuriant ir progresavimo skrandžio vėžio (GC) ir genetinis heterogeniškumas buvo įrodyta, kad įtakos prognozės ženkliai. Todėl medžioklės naujų genų ir baltymų su potencialią vertę kaip diagnostikos ar prognostinių įrankiai yra svarbu, ir nukreipti naujų onkogenų yra dar vienas perspektyvus požiūris į vėžio gydymo.

XB130 yra naujai nustatyta adapteris baltymas, kuris yra stipriai išreikštas į blužnis ir skydliaukės žmonių, o tai rodo silpną išraišką inkstų, smegenų, plaučių ir kasos [1]. XB130 buvo aptikta folikulų ir papilinio skydliaukės karcinomos, taip pat kaip ir žmogaus plaučių karcinoma ląstelių linijų [2]. Nors jos išraiška buvo sumažintas skydliaukės karcinomos, XB130 buvo nustatyta, kad navikų aktyvatorius [2]. , Buvo pastebėta, kad XB130 ne tik turi tam tikrą vaidmenį ląstelių proliferacijos, išlikimo, judrumui, ir invazija [2], [3], [4], bet taip pat, dalyvaujantį signalo transdukcijos [1]. XB130 reguliuojamas RAC ir citoskeleto [3], ir ji dalyvauja c-Src [1] ir fosfatidiletanolaminas-inozitolis-3-kinazės (PI3K) /Akt keliu [4] aktyvavimo, kuri savo ruožtu reguliuoja Citoskeletas funkcija [3]. Šie signaliniai keliai taip pat buvo įrodyta, kad svarbų vaidmenį kuriant ir progresavimo GC [5], [6], [7]. Taigi, ten galėtų būti XB130 vaidmenį GC per daug. Tačiau ne dėl šio naujai nustatyta adapterio baltymų tyrimai buvo padaryta gastroenterologijos srityje iki šiol. Šiame tyrime mes iškėlė hipotezę, kad XB130 išraiška gali būti susijęs su išgyvenimo ir /ar naviko atsinaujinimo, taip pat su GC chemosensitivity.

Rezultatai

XB130 išraišką normaliomis skrandžio audinių ir GC

"skiriasi nuo ankstesnių pranešimų, mes patvirtino, kad XB130 yra constitutively išreikštas įprastais audinių žmogaus kepenų, storosios žarnos, blužnies ir skrandžio (1a pav.) Imunohistocheminis buvo atliktas siekiant įvertinti XB130 išraišką visose 411 porų parafino įterptųjų skyriuose iš GC ir jų gretimų ne navikų audiniuose. Mes nustatėme, kad XB130 buvo daugiausia išreikštas citoplazmoje normaliai skrandžio audinio, o ji buvo žymiai downregulated į GC audiniuose. Mes taip pat skirstomi į GCS į XB130 teigiamų (aukštos raiškos su balas ≥3) ir negatyvų (žemos išraiška su balas < 3) pagal dažymo rezultatus (1b paveikslas). Sergamumas XB130 teigiamų ir neigiamų stadijoje I-III GC buvo iš jokio skirtumo, bet XB130 negatyvų dalis buvo didesnė IV etape ir po operacijos pasikartojimo grupių (1c pav.) Kiekybiniai iRNR lygis XB130 buvo aptiktas IV etapas paliatyviosios rezekcijos mėginių ir žymiai sumažinti pažangių GCS (1d pav). Be to, sumažintas baltymų ekspresija XB130 pažangių GC taip pat buvo patikrintas Vakarų dėmė (1e pav.)

Žemas išraiška XB130 koreliuoja su blogos prognozės

Atsižvelgiant į bendrus 411 atvejų analizės GC etapu I-IV, kaupiama išgyvenamumas pacientams, sergantiems XB130 neigiamas dažymo buvo gerokai mažesnis nei tie, turinčių teigiamą dažymo (2a pav.) Pacientams, sergantiems IV stadijos GC, kurie prarado operacijos išgydyti galimybę, jis parodė didelę apatinę išgyvenamumas į XB130 neigiamas grupė (2b pav.) Bendro išgyvenamumo mediana laikas pacientų pažengęs buvo ilgesnė XB130 teigiamą grupėje, nei neigiamo grupėje (16,7 vs 8,5 mėnesių HR neigiamam grupėje buvo 1,72, p = 0,011; 1 lentelė). Tais pacientams etapo I-III GC gavusių radikalų Resekować operacija, liga Išgyvenamumas be XB130 teigiamą grupėje buvo didesnis nei neigiamo grupėje (p < 0,05; 2c pav), o vidutinis laikas pasikartojimui buvo 36 ir 24 mėnesių teigiamų ir neigiamų grupių (atitinkamai 1 lentelėje HR neigiamiems pacientams buvo 1,2, p = 0,022). Šie rezultatai rodo, kad mažas išraiška XB130 yra susijęs su trumpesniu išlikimo ir aukštojo pasikartojimo GC pacientams.

prognozinė vertė kitų klinikos parametrų

Kitų klinikos parametrų bendro išgyvenamumo ir disease- įtaka nemokamai išgyvenamumas buvo išvardytos 1 lentelėje ir 3 pav Be XB130, rezultatai Kaplan-Meier išgyvenimo funkcija analizė pacientams, kuriems yra IV stadijos sugrupuoti pagal gerai žinomus veiksnius, kaip antai karcinoembrioninius antigeno (CEA) koncentracija, skirtumas laipsnį, metastazės , ascitas ir chemoterapija parodė didelę įtaką sukaupto išlikimo (3 paveikslas-e). A vienmatės Cox regresinė analizė pacientams gavo radikalų gydymą, mes pažymėti, kad etapas taip pat buvo reikšmingas prognostinis faktorius pasikartojimo (1 lentelė).

Dispersinės analizės naudojant Cox modelis, mes pažymėti, kad XB130, CEA, chemoterapija ir ascitas (visais atvejais p < 0,01) buvo nepriklausomi veiksniai, prognozuoti HR už mirties pacientų IV stadijos, o XB130 (p = 0,044) ir etapas (p < 0,000) buvo nepriklausomi veiksniai, prognozuoti vyriausiojo įgaliotinio pasikartojimo po radikalaus rezekcijos GC pacientams, esant I etapo III (2 lentelė).

chemoterapiniai jautrumas reaguojant į XB130 slopinimo

siekiant išsiaiškinti terapinį potencialą nukreipti XB130, įvertinome ląstelių gyvybingumą sh- XB130 reaguojant į 5-FU, cisplatina ir irinotekano. Ląstelių gyvybingumas SH-XB130 ir laukinio tipo grupių abu numalšino visų trijų chemoterapiniais preparatais priklausomai nuo dozės. Atitinkamai, palyginti su SH-XB130, laukinio tipo kontrolė parodė, jautresni 5-FU pasireiškia žymus mažesnę ląstelių gyvybingumą (4a paveikslas), o cisplatina (4b paveikslas) ir irinotekano (4c pav) buvo įrodyta, kad būti labiau veiksminga sh- XB130 grupė nei laukinio tipo kontrolę.

išgyvenimo analizė GC pacientams 5-FU terapijos

Surūšiuota pagal XB130 neigiamas ir teigiamas, mes vertinami 5-FU terapija IV stadijos GC pacientus į retrospektyvinis tyrimas. Gydomi 5-FU, pacientai, sergantys XB130 teigiamą dažymo patiko didesnę išgyvenamumas nei neigiamas grupė (4d pav). Atitinkamai, XB130 teigiami gydymo 5-FU turėjo ilgiau bendro išgyvenamumo mediana laiko (4d pav). Kadangi buvo nedaug pacientų, gydytų su cisplatina ar irinotekano, kad XB130 ekspresijos lygio klinikinių terapinių poveikių įtaka nebuvo palyginti šio tyrimo.

Diskusijos

XB130 yra neseniai klonuoti 130 kDa-adapteris baltymų ir pranešama, kad daugiausia išreikštas skydliaukės ir blužnies audinių įteisintais šiaurinėje dėmė ir vaidina daugiafunkcinį vaidmenį ląstelių išlikimo, dauginimosi, invazijos skydliaukės naviko [2], [3], [4], tačiau jo iRNR ir baltymų ekspresija kitų audinių nebuvo patvirtintas realaus laiko PGR, Vakarų dėmė ar imunohistocheminiu. Šiame straipsnyje, mes pirmiausia davė parodymus, kad XB130 iRNR ir baltymų, taip pat buvo constitutively išreikštas įprastais skrandžio audinio ir santykinai mažesnę raišką GC ląsteles. Šie duomenys yra priešingai ankstesnių pranešimų, kad XB130 iRNR buvo vos aptinkamas kituose audiniuose, išskyrus skydliaukės ir blužnies [1], [4], iš dalies, nes jie naudojami tik Šiaurės dėmė patvirtinti. XB130 išraiška sumažėja skydliaukės naviko, tačiau ji lieka visiškai neaišku, ar XB130 yra prognostinė biologinis kitų piktybinių navikų, tokių kaip skrandžio vėžiu (GC) [2]. Siekiant patvirtinti, kad XB130 dalyvauja GC progresavimo, mes nagrinėjo išlikimas arba pasikartojimo 411 pacientams, sergantiems GC ir pažymėjo, kad XB130 mažas išraiška prognozavo mažesnę išlikimą ir didesnį pasikartojimo. Be to, chemoterapinių jautrumas remdamiesi XB130 išraiška buvo įvertintas pirmą kartą, ir korinio eksperimentiniais ir klinikiniais retrospektyvinė studija parodė, kad downregulation iš XB130 didina narkotikų jautrumas cisplatina ir irinotekano ir sumažina narkotikų jautrumas 5-fluorouracilu.

Kadangi ir ankstesniais ataskaitų [2] kancerogeniškumo, [8], [9], XB130 turėtų būti laikoma kita onkogeninė nei naviko-slopinančio baltymų, nors būtini tolesni tyrimai siekiant patikrinti, ar jis taip pat yra ir GC atveju. Tada, kaip paaiškinti klinikinė reikšmė mūsų klinikinius stebėjimus, kad XB130 downregulation prognozuoja mažą bendrą išgyvenamumą Išplėstinė GC ir aukštojo pasikartojimo dažnis pacientams, gydytiems radikaliai rezekcija operacijos? Iš tiesų, yra žinoma, kad Tumorigenesis gali sukelti iš pakitimų daugelio genų ir baltymų, o XB130, adapteris baltymas su daugiau nei vieną funkcinę domeno, gali būti paveiktas keliais prieš srovę ir pasroviui veiksnių. Todėl, tai yra per anksti spręsti, ar genas arba baltymas yra onkogeninė ar ne tik remdamiesi savo išraiška tiriamojoje klinikinėje medžiagoje, nors pastarasis padarė užuominą kai įkalčiais. Tiesą sakant, downregulation iš XB130 GC gali būti laikoma kompensacinio sureguliavimo, nes kai naviko slopintuvai būtų mobilizuota atsispirti XB130 per GC progresavimą. Be to, buvo pranešta, kad navikas slopintuvas p53 raiška buvo didesnė blogai diferencijuoti GC nei gerai diferencijuotų tie [10], o ankstyvųjų skrandžio vėžio prastai apoptozės, padidėjo išraiška iš BCL-2 ir p53 buvo labiau tikėtina, skatinti metastazių [11], [12].

XB130 gali būti Proto-onkogeno, kuris išsaugo normaliai audinio. Tokie prokalbės Onkogeny gali prisidėti išlaikyti fizinius funkcijas ląstelių atsinaujinimą ir aukštyn migracijos normaliai skrandį. Tuo tarpu, yra dar vienas reguliuoti genų, kurie trukdytų normaliai ląstelės per neplatinimo ir metaplazijos rinkinys. Tačiau, kai microecological balansas disequilibrated, ląstelių proliferacija ir metastazės yra nekontroliuojamas, todėl todėl kancerogenezėje [13]. Ši klasikinė teorija prokalbės onkogeno gali duoti priimtiną paaiškinimą, kodėl normalių audinių su tokia didelė XB130 išraiška vis dar išlieka "sveikas". Yra žinoma, kad daugelis genų signaliniai keliai žaisti PRO-onkogeninių ar anti-onkogeninių vaidmenis kontekstinį priklausomu būdu, todėl tai nėra neįprasta, kad tas pats genas gali daryti skirtingą poveikį skirtingose ​​stadijose arba skirtingų audinių tipų vėžio vystymąsi [ ,,,0],14], [15], [16]. Šioje studijoje, nors mes nelietė ant XB130 funkcijų normalų skrandžio audinio, ši tema yra įdomi, taip pat ir reikia tolesnių tyrimų.

Jei XB130 išraiška modelis gali būti naudojamas kaip surogatinis žymeklis nusakančios chemoterapijos atsakas, tai taip pat suteiktų už prognozės paaiškinimus. Šiuo metu fluoropirimidinas dariniai pagrindu ir platinos junginio pagrindu deriniu buvo priimtos kaip įprastinių pirmos eilės gydymo GC [17], o irinotekano, topoizomerazės Aš inhibitorius, naudojamas kaip antros eilės gydymo [18], ir cisplatina turi daugiausia buvo naudojamas pažangiosios, Neoperuojamo GC [19] gydymą. Šioje mokslinių tyrimų, chemoterapinio jautrumo tyrimai Remiantis XB130 ekspresijos lygio buvo atliktas. GC ląsteles, XB130 nokdaunas nurodė geresnį reagavimą į cisplatina ir irinotekano, bet su mažiau jautrumo ir 5-FU. Mūsų klinikiniai duomenys parodė trumpesnį bendro išgyvenamumo laiko 5-FU gydytų pacientų su žemu išraiška XB130, tai rodo, kad XB130 downregulation sumažina reakciją į 5-FU, kuris gali būti kitas paaiškinimas dėl prastos prognozės pacientams su mažu išraiška XB130 šiame tyrime. Mūsų išvados GC ląstelių linijos įpainioti, kad pažangių GCS, kurių dauguma yra pristatomos iki XB130 mažos raiškos, gali daugiau naudos iš cisplatina ir irinotekano, išskyrus 5-FU. Atsižvelgiant į tai, priimti skirtingų genomo foną, pavyzdžiui, skirtingų išraiškos XB130 GC, ji yra įmanoma, kad kai kurie populiacijos gali būti naudinga iš irinotekano ir /arba cisplatina, nes ji pasiūlė mūsų korinio eksperimento metu, o yra verta tolesniam tyrimui. Daugiau būsimiems tyrimai gali nustatyti, ar XB130 ekspresijos modeliai gali būti naudojami siekiant padėti stratifikuoti pacientus į skirtingas multimodalinių gydymo režimus.

Apibendrinant, mūsų dabartinis tyrimas suteikė pirmasis įrodymas, kad XB130 buvimas skrandžio audinio ir GC pirmą kartą , Mes patvirtinta, kad chemoterapinio jautrumas vertinimas remiantis atrankinio XB130 išraiškos visų pirma buvo nukreiptas, nurodant, kad XB130 žemos raiškos pacientai gali būti jautrūs cisplatina ir irinotekano, tačiau vyresnysis įrodymų reikia. Klinikinis būsimasis šio tyrimo apima (1) XB130 gali veikti kaip GC prognostinį biologinis žymuo savo žemos raiškos implicating už nepalankių rezultatų; (2) Kadangi XB130 mažo išreikšta GC reaguoja į cisplatinos ir irinotekano pranašesnis 5-fluorouracilu mūsų chemoterapinių jautrumo tyrimo, vertinimas XB130 išraiška gali padėti susiorientuoti klinikinį vaistų GC.

Medžiagos ir metodai

pacientai ir audinių mėginiai

Visi 411 pacientai buvo histologiškai diagnozuota ne Nanfang ligoninė, Pietų medicinos universiteto (Guangzhou, Guangdong, Kinija) nuo 2000 iki 2011 m auglio stadijoje buvo apibrėžta atsižvelgiant į 7-osios redakcijos AJCC vėžio sustojimo vadovas 2010. Mėginiai diagnostikos tikslais buvo imtasi su sutikimu kiekvienam pacientui. Tyrimas patvirtino institucinių peržiūros valdybos Nanfang ligoninė, Pietų medicinos universitete. Vidutinė tolesnių laikas visiems pacientams buvo 59,5 (95% PI: nuo 55,5 iki 63,5) mėnesių. Klinikinė charakteristika ir XB130 išraiška visų GC pacientų aprašyti 1 lentelėje Pacientai I-III stadijos GC buvo atlikta radikali rezekcija, o pacientai, kuriems IV stadijos gavo paliatyvios operacijos.

Prieš imunohistocheminis analizė, parafino įterptųjų pirminės audinių mėginiai buvo supjaustyti į 4 mkm storio sekcijas, ir montuojamas ant stikliukų. Devyni poros naviko ir vėžio greta įprastų audinių iš IV etapas GC pacientų buvo atsitiktinai surinkti kiekybinius realaus laiko PGR ir šešių porų Vakarų dėmė analizė.

imunohistocheminis

imunohistocheminį dažymo buvo atliktas naudojant DaKo įsivaizduoti sistema (DaKo, CARPINTERIA, ĮA) ir triušio anti-XB130 AB (1:100; Abnove) po gamintojo rekomenduojamą protokolą. Dėl XB130 vertinimu, audinių skyriuje buvo nuskaitomi visiškai priskirti balus. Dažymo intensyvumas buvo įmuštas kaip 0 (neigiamas), 1 (silpnai), 2 (vidutinio), arba 3 (stiprus). Iš dažymo mastu pelnytas kaip 0 (0%), 1 (1% -25%), 2 (26% -50%), 3 (51% -75%), arba 4 (76% -100%), pagal teigiamai tamsintas sričių, susijusių su visa karcinomos srityje (arba visai skyriuje normalių pavyzdžių) procentais. Iš dažymo intensyvumo ir mastas balai suma buvo naudojamas kaip galutinis dažymo rezultatus (0-7) už XB130. Dėl išlikimo vertinimo tikslu buvo laikomas navikai, kurių galutinio dažymo rezultatas ≥ 3 bus teigiamas. XB130 imunodažymu buvo įvertintas nepriklausomai dviejų asmenų apakinti į klinikinius parametrus.

Fluorescencinis kiekybine PGR

Viso RNR išskirta naudojant Trizol komplektas (Invitrogen, Karlovi Varai, CA, JAV). Atvirkštinę transkripciją kDNR tada buvo gautas su iScript ™ sintezei Kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) Po gamintojo instrukcijas. Visi RNR duomenys buvo pateikti, palyginti su namų ruošos genų beta-aktino naudojant ΔΔCt metodą. Įprastas PGR taip pat buvo atliekama siekiant ištirti ekspresijos XB130 skirtingose ​​organo žmogaus ir pelės (gruntas sekas S1 lentelė).

imunoblotingu

audiniai buvo plaunama du kartus šalto fosfato-buferio druskų tirpalo ( PBS) ir lizuojamos baltymų lizės buferiniame tirpale, 30 min. Centrifugavimas buvo atliktas, ir baltymų, kurių sudėtyje yra supernatantas buvo palikta. Baltymų Lizatai electrophorectically atskirtos 10% SDS-poliakrilamido gelyje ir perkeliamas ant polivinilidenfluorido membranų (Immobilon p, MILLIPORE Bedford, MA). Tada imunoblotas buvo atlikta naudojant triušio prieš XB130 antikūnas (PradoWalnut, CA, JAV) ir ß-aktino (Santa Cruz, CA). Imunoreaktyvių juostos buvo regimos sustiprinto cheminės liuminescencijos metodas (Amersham) su Imunoblotingo aptikimo sistema ( "Kodak Skaitmeninis mokslo, Rochester, NY, JAV) ir buvo kiekybiškai Vaizdo programinė įranga QuantityOne v4.6.2.

Mobilusis kultūra

ląstelės iš SGC7901 ląstelių linijos buvo auginamos visiškoje terpėje [Roswell Park memorialinis institutas (RPMI) 1640 terpė (Invitrogen, Karlovi Varai, CA, JAV) su 10% vaisiaus galvijų serumo (FBS) (Hyclone)]. Stabiliai-transfekuotos ląstelės ir buvo išlaikytos priemones, kurių iš puromicino buvimą (Sigma-Aldrich). Ląstelės buvo inkubuojami 5% CO _{2 37 ° C temperatūroje.}

pajėgumo-transfekuotos ląstelių linijos sukūrimas

Trys skirtingi shRNR sekos XB130 buvo klonuotas į pSuper-Rretro-puromicino plazmidės su apribojimas fermentas BGL II Hind III (Naujoji Anglija Biolabs) ir T4 DNR ligazės (Takara). Tiek pSuper-Rretro-Puro-shXB130 ir pSuper-Rretro-Puro buvo pastatyti. pSuper-Rretro-puromicino-shXB130 kartu su pakavimo plazmidžių vektoriumi ar peštynės vektorių kaip neigiamos kontrolės buvo supakuoti į viruso naudojant kalcio fosfato metodą. SGC7901 ląstelės buvo pernešta iki shRNR plazmidžių naudojant Lipofectamine 2000 (INVITROGEN, Carlsbad, CA, JAV), kartojamas tris kartus. Ląstelės buvo auginamos kaip minėta aukščiau, ir pavieniai kolonijos buvo pasirinkta Imunoblotingo ir fluorescencijos kiekybine PGR ir naudojamas kitokiems eksperimentams. Trys shRNR orientacija XB130 ir vienas peštynės buvo sukurta (lentelė S2),. Tiek iRNR ir baltymų ekspresija XB130 (gruntas seka S1 lentelėje išraiška rezultatai S1A pav B) buvo patvirtintas realaus laiko PGR ir Vakarų dėmė. Adenovirusinė infekcija efektyvumas parodė S1C ir D pav pervežimas

Ląstelių gyvybingumas analizė

tripsinizuojamos ir pasėjamos į 96-duobučių lėkštelėse pradinio tankio 0,2 × 10 ^{4 /Na, ląstelės buvo kultūringas ir stebimas 1, 3, 5 ir 7 dienos. Ląstelių gyvybingumas nulėmė metilo thiazolyltetrazolium (MTT) Analizės pagal gamintojo instrukcijas. Absorbcija buvo matuojamas esant 570 nm bangos ilgiui, su 655 nm kaip atskaitos bangos. Visi eksperimentai buvo atliekami trimis egzemplioriais.}

chemoterapiniai jautrumo vertinimas GC ląstelių

Ląstelės laukinio tipo kontrolės ir SH-XB130 buvo auginamos terpėje su 5-fluorouracilu (5-FU), cisplatinos ar irinotekano skirtingų koncentracijų. vėliau keturiasdešimt aštuonias valandas, buvo įvertintas ląstelių gyvybingumas.

Statistinė analizė

Rezultatai pateikiami kaip vidurkis ± SEM arba medianos. buvo naudojamas chi kvadrato testas kategorinių kintamųjų ir Stjudento t-testas nuolat kintamųjų. Išgyvenimo ir pasikartojimo normos buvo apskaičiuojamos pagal Kaplan-Meier metodu.

Statistinis reikšmingumas buvo priimtas ne P pervežimas vertė yra mažesnė nei 0,05. Pagalbinė informacija
S1 paveiksle.
patvirtinimas genų slopinimo poveikį mažų segtukas RNR iš XB130 (SH-XB130) ir infekcinę efektyvumo adenovirus. XB130 downregulated ląstelių linija modeliai buvo patvirtinta realiu laiku PGR (a) ir Vakarų dėmė (b). Ląstelės Transfekuoti iki peštynės vektoriaus tarnavo kaip neigiamą kontrolę ir ne perkeltų Mock kaip kontroliuoti. Užkrečiamuoju efektyvumas adenovirusą 293FT išaugintų ląstelių buvo patvirtinta normali (C) ir fluorescencijos (D) microscopies. Intarpas A yra amplifikacija kreivė realiojo laiko PGR
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0041660.s001
(ppt)
S1 lentelėje.
Primer sekas realaus laiko ar įprastinio PGR
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0041660.s002
(DOC)
lentelė S2.
XB130 SH-RNR sekų
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0041660.s003
(DOC)

• PLoS ONE: adenovirusiniai Pristatymas apie EMX2 Genų slopina augimo į žmogaus skrandžio vėžio
• PLoS ONE: prieštaringos tendencijos pastaraisiais gyventojams skirtas išgyvenimo į stemplės ir skrandžio Cancer