PLoS One: Tetrandrine indukál mitokondriumok által közvetített apoptózist Emberi gyomorkarcinóma BGC-823 sejteket

absztrakt katalógusa

Tetrandrine, bisz-benzilizokinolin alkaloid izolált szárított gyökere Hang-Fang-Chi ( Stephania katalógusa tetrandra katalógusa S. Moore), már jelentett, hogy rendelkezzen rákellenes hatásait számos daganatok. Ebben a tanulmányban azt vizsgáltuk, tetrandrine apoptózis humán gyomorrák BGC-823 sejtek in vitro katalógusa és in vivo katalógusa. Az eredmények azt mutatták, hogy tetrandrine szignifikánsan gátolta a sejtek életképességét dózis- és időfüggő módon, és az indukált apoptózist. Ez növelte a apoptózis; felfokozását Bax, Bak, és Bad; és downregulációját Bcl-2 és Bcl-XL BGC-823 sejtekben. Sőt, tetrandrine növelte a kaszpáz-3 és -9, felszabadulását citokróm C katalógusa, és fokozza a Apaf-1, ami arra utal, hogy a tetrandrine-indukálta apoptózis kapcsolódik a mitokondriális út. Eközben előkezelés a pán-kaszpázgátló z-VAD-FMK a BGC-823 sejtek csökkent tetrandrine apoptózist blokkolásával kaszpázok aktiválása. Továbbá tetrandrine hatékonyan gátolta a tumor növekedését apoptózis indukció, amelyet immunhisztokémiai analízissel igazoltuk egy csupasz egér xenograft modellben. Mindent összevetve, arra a következtetésre jutottunk, hogy a tetrandrine jelentősen gátolta elterjedése gyomorrák BGC-823 sejtek révén a mitokondrium-függő apoptózis, amely játszhat ígéretes szerepet gyomorrák terápiában. Katalógusa

Citation: Qin R, Shen H, Cao Y, Fang Y, Li H, Chen Q, et al. (2013) Tetrandrine indukál mitokondriumok által közvetített apoptózist Emberi gyomorkarcinóma BGC-823 sejteket. PLoS ONE 8 (10): e76486. doi: 10,1371 /journal.pone.0076486 katalógusa

Szerkesztő: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson Egyetem, az Amerikai Egyesült Államok katalógusa

Beérkezett: december 16, 2012; Elfogadva: augusztus 27, 2013; Megjelent: október 1, 2013 katalógusa

Copyright: © 2013 Qin és mtsai. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: Ez a munka támogatta az alábbi támogatásokat: a támogatások Nemzeti Természettudományi Alapítvány Kína (81070423 és 81101677), a támogatást a Természettudományi Alapítvány Jiangsu tartomány (BK 2010332). A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

Kínában, gyomorrák, az egyik leggyakoribb rosszindulatú tumorok, eredő felhalmozódása genetikai és epigenetikai események, még mindig nagy előfordulási és halálozási aránya [1-3]. Számos tényező okozza a kialakulását gyomorrák, mint például a Helicobacter pylori
fertőzés, diétát, a dohányzás, és így tovább [4]. A körülményektől függően, a legtöbb beteg gyomorrák szüksége műtét, kemoterápia és /vagy sugárkezeléssel [5]. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a gyomorrák egy komplex genetikai betegség kapcsolódó onkogének vagy tumor szupresszor [6]. Katalógusa

Tetrandrine (C _{38H 42N 2 O 6 MW 622,730 ) bisz-benzilizokinolin alkaloid izolált szárított gyökere Hang-Fang-Chi ( Stephania katalógusa tetrandra katalógusa S. Moore). A közelmúltban, a különböző biológiai tevékenységét tetrandrine már intenzíven tanulmányozták, mert a széles körű használata az arthritis, aritmia, a gyulladás, a szilikózis, a különböző típusú daganatok, és fordított multi-drog rezisztencia [7,8]. Úgy tűnik, hogy tetrandrine jelentős hatással van a daganatok, beleértve a lassuló tumor növekedését és növeli az állatok túlélési időt és a túlélési arány [9-12]. Tetrandrine okoz G1 sejtciklus-blokád és apoptózist indukál különböző típusú sejtek. Azonban a pontos mechanizmus, amellyel az tetrandrine, apoptózist indukál és gátolja a sejtnövekedést gyomor tumorsejtek továbbra is tisztázatlanok, [13]. Úgy tűnik, hogy a codelivery a paclitaxel (PTX), és tetrandrine által nanorészecskék hatékonyan fokozza a citotoxicitást PTX szekvenciális gátlása a ROS-függő Akt útvonal és aktiválás Az apoptotikus utak alapján oxidáció elleni terápiaként gyomorrák [14]. Azonban, mint egy terápiás szer, Pj x elkerülhetetlenül súlyos mellékhatásai miatt a nem specifikus toxikus hatásokat, és speciális oldószerek, és a daganatos sejtek válhatnak jobban ellenáll a Pj x által indukált apoptózist [15-17]. Egy korábbi tanulmány kimutatta, hogy tetrandrine szinergetikus hatást kemoterápiás szerekkel az apoptózis a gyomor rákos sejtvonalak [18]. Továbbá, egy származék (H1) tetrandrine fejt ki jó anti-multidrog rezisztencia aktivitás által kezdeményező az intrinsic apoptózis útvonal és aktiválásának gátlása az ERK1 /2 és Akt1 /2 [19]. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy tetrandrine lehet cserélni Pj x, mint az első vonalbeli kemoterápiás gyomorrák. Katalógusa}

Mivel tetrandrine nagy potenciállal rendelkezik a rákellenes terápia, fontos, hogy tanulmányozza rendszeresen megérteni a mechanizmust. Ezért ebben a tanulmányban megvizsgáltuk a lehetséges mechanizmusok tetrandrine humán gyomorrák sejtek in vitro katalógusa és in vivo katalógusa.

Anyagok és módszerek katalógusa

anyagok és reagensek

Tetrandrine kapunk Jiangxi Yintao Pharmaceutical Development Company (Jiangxi, Kína). Antitesteket kapunk, a következő forrásokból: elleni antitestek Bcl-2, Bax, Bcl-XL, a kaszpáz-3, -8, -9, citokróm C katalógusa, Apaf-1, és a β-aktin voltak a Santa Cruz Biotechnology (santa Cruz, CA, USA); anti-Bad és Bak voltak Bioworld Technology (St. Louis Park, MN, USA). A Trizol reagens készlet vásárolt (Invitrogen, Grand Island, NY, USA). MTT-t (3- (4, 5-dimetil-tiazol-2-il) -2, 5-difenil-bromid) a Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

Sejtkultúra katalógusa

Az emberi gyomorrák sejtvonal BGC-823-ben vásárolt Shanghai Cell Biology, a kínai Tudományos Akadémia (Sanghaj, Kína). A sejteket Dulbecco-féle módosított Eagle-féle tápközeg (DMEM) (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), kiegészítve 10% magzati marhaszérummal (Hyclone, Logan, UT, Amerikai Egyesült Államok), 1% penicillin, és 1% sztreptomicin egy nedves atmoszférában 95% levegő és 5% CO _{2 37 ° C-on.}

életképesség teszt

a sejtek életképességét mértük az MTT assay. Röviden, a sejteket oltottunk 96 lyukú lapokra, a sejtsűrűség 1 × 10 ^{4 sejt /lyuk. 36 óra elteltével a sejteket kezeltük vagy anélkül tetrandrine változó koncentrációjú 24, 48 és 72 H; és foszfát-pufferolt sóoldat (PBS) szolgált negatív kontrollként. Ezután 20 ul MTT festék oldatot (0,5 mg /ml, PBS-ben oldott, és átszűrjük egy 0,2 mm-es membrán) adunk az egyes lyukakhoz, és inkubáljuk 37 ° C-on 4 órán át. Ezt követően 150 ul dimetil-szulfoxidot adunk az egyes lyukakhoz, és a lemezeket inkubáljuk 37 ° C-on további 10 percig. Az abszorbanciát mérjük 490 nm-en egy 96 lyukú mikrolemez leolvasóval. Az IC _{50 érték úgy definiáljuk, mint a hatóanyag koncentrációja, amely 50% -ban gátolja a sejtek növekedését a kontrollhoz képest.}}

Western blot

Gyomorrák sejteket kétszer mostuk PBS-sel, majd a 100 ul RIPA Lysis Buffer (Beyotime, Kína) adunk az egyes lyukakhoz, hogy lizáljuk a sejteket körülbelül 20 percig. Ezután az elegyet centrifugáltuk 12,000 G katalógusa 15 percig, és a felülúszót összegyűjtöttük. A protein koncentrációt detektáltuk egy BCA Protein Assay Kit (Beyotime, Kína), a gyártó utasításai szerint. Összesen fehérjét választottunk el SDS-PAGE-on 8%, 10%, és 12% -os poliakrilamid gélen, és át elektroforetikusan ra polivinilidén-difluorid (PVDF) membránokra (Millipore, Bedford, MA, USA). Blokkolás után 2 órán vagy egy éjszakán át 5% zsírmentes száraz tej (feloldjuk Tris-pufferolt sóoldatot-Tween 20-puffer; TBST), membránokat inkubáltuk primer antitestekkel (1: 500-1: 1000 hígításban) 2 órán át szobahőmérsékleten, vagy egy éjszakán át 4 ° C-on, majd háromszor mossuk TBST-vel (5 mM Tris-HCI, pH = 7,4, 136 mM NaCi, 0,1% Tween 20), mielőtt reakcióba torma-peroxidáz (HRP) konjugált szekunder antitestet (1: 5000 -1: 10000) 1 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Mosás után háromszor 10 percig minden egyes TBST-vel, a membránokat kezeltük ECL Western-blot detektáióreagens.

kvantitatív valós idejű polimeráz láncreakció

Az összes celluláris RNS-t izoláltunk Trizol reagens ( Invitrogen) Miután a gyártó protokoll és feloldjuk DEPC-vel kezelt vízben. A koncentráció a teljes RNS-t mértük UV-abszorbancia-spektroszkópiával. A reverz transzkripciót végeztünk RevertAid ™ First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas MBI, Waltham, MA, USA) a gyártó utasításai szerint. Az újonnan szintetizált cDNS-t amplifikáljuk polimeráz-láncreakció (Fermentas). A szekvenciák mindegyik primerből ebben a tanulmányban alkalmazott táblázatban mutatjuk be 1. A polimeráz láncreakció feltételek szerepelnek a következők: 95 ° C-on 3 percig, 95 ° C, 5 perc, 58 ° C-on 30 percig, és 72 ° C 30 percig, majd 40 ciklus 94 ° C-on 15 s és 60 ° C-on 1 percig. Minden vizsgálatot három párhuzamosban végeztük.
Gene
szensz láncindító (5'-3 ') katalógusa antiszensz láncindító (5'- 3’)
bcl-2GGATCCAGGATAACGGAGGCCCAGATAGGCACCCAGGGTbaxACCAAGAAGCTGAGCGAGTGTACAAACATGGTCACGGTCTGCbclxlGGCAGGCGACGAGTTTGACCCATCCCGGAAGAGTTCATβ-actinTGGCACCCAGCACAATGAACTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCATable 1. szekvenciák primerek a gének, amelyek ebben a vizsgálatban.
CSV letöltése CSV

Annexin V-propidium-jodid kötődési vizsgálatban

Röviden, a sejteket szélesztettünk 6 lyukas lemezeken, és az oldathoz különböző koncentrációjú tetrandrine 24 órán, és PBS szolgált negatív kontrollként. Ezután a sejteket újra felszuszpendáltuk 500 ul hideg kötődési pufferrel. a sejtszuszpenziókat festettük ellen Annexin-V és propídium-jodid (BD Pharmingen ^{TM, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) alkalmazásával a gyártó utasításai, majd áramlási citometriával elemzést végeztünk egy FACS (Coulter, Becton Dickinson).}

a kaszpáz-3 aktivitás assay

Röviden, a sejteket inkubáltuk egy 6 mérőhelyes lemez koncentrációban 4 × 10 ^{5 /lyuk, és az oldathoz a megadott koncentrációban gyógyszerek. azonos térfogatú PBS-t alkalmaztunk negatív kontroll. a kaszpáz-3 aktivitást mértük kaszpáz-3 aktivitás assay kit (Beyotime, Kína), a gyártó utasításai szerint. Az abszorbanciát ezután mérjük 405 nm-en egy mikrotiterlemez-leolvasó. Minden kísérletet háromszor végeztünk el. Katalógusa}

Etikai nyilatkozat katalógusa

eljárásokat állatokon, és az ellátást is összhangban végzik NIH irányelveket (NIH Pub. No.85-23, átdolgozott 1996) és hagyta jóvá az Animal Care and Use Committee a kapcsolt Népi Kórház, Jiangsu Egyetem. katalógusa

Állatkísérletek

nőstény szőrtelen egerek (BALB /c nu /nu), 4-6 hetes, kaptuk a kísérleti állat Center a kínai Tudományos Akadémia (Sanghaj, Kína) és rendszeresen specifikus kórokozóktól mentes körülmények között a biológiai szekrényben a Laboratory Animal Facility Jiangsu Egyetemen. Az állatokat tartottuk 12 órás világos-sötét ciklusban. A szobahőmérséklet tartjuk 20 ° C körüli, és a páratartalom tartottuk körülbelül 50% egy szobában szűrt levegő. Katalógusa

Tetrandrine kezelésére szubkután BGC-823 daganatok egereken katalógusa

Annak megállapítása BALB /c egér xenograft modell a humán gyomorrák, BGC-823 sejtek koncentrációban 5,0 x 106/150 ul-t injektáltunk a jobb horpasz egyes BALB /c csupasz egeret. Körülbelül 10 nap múlva (a tumor mérete elérte a 120-150 mm3), csupasz egereket véletlenszerűen három csoportba osztottuk (n = 5), és figyelembe véve az alábbi kezelések: kontroll (kezelt normál sóoldat), alacsony dózisú csoportban (kezelt 40 mg /kg tetrandrine), és a magas dózissal kezelt csoport (kezelt 120 mg /kg tetrandrine). BALB /c egereket injektáltunk intraperitoneálisan tetrandrine (200 ul, 40 mg /kg vagy 120 mg /kg) vagy azonos térfogatú fiziológiás sóoldatot, naponta egyszer, 3 héten, ill. A tumor méretét mértük 3 naponként két, egymásra merőleges irányban Vernier kaliberek, és a tumor térfogata (TV) úgy számítottuk ki a következő képlet: TV = hosszúság (mm) × szélesség ^{2 (mm 2) × 0,5 . Relatív tumortérfogat (RTV) szerint számítottuk a következő képlet szerint: RTV = TV _{T /TV 0, ahol TV 0 a tumor térfogata a 0. napon és a TV t a daganat kötet egy adott napon t. Eközben az állatokat lemértük, hetente kétszer. A kísérlet végén, a tumorokat kivágjuk és formaiinban fixáljuk a további elemzéshez.}}

Immunhisztokémiai analízis

A paraffinba ágyazott minták kivágtuk BGC-823 csupasz egerekbe megfestjük a következő antitestek : Bcl-2 és Bax (Boster), a Bcl-XL, aktivált kaszpáz-3, és az aktivált kaszpáz-9 (santa Cruz) immunhisztokémiai. Felvételeket készítettünk egy fluoreszcens mikroszkóp (Carl Zeiss).

Statisztikai analízis

Minden kísérletet legalább három alkalommal, és az összes adatot kerültek bemutatásra átlag ± standard deviáció (SD). Statisztikai különbségek határoztuk egyutas ANOVA SPSS 16.0 szoftver. A P-érték kevesebb, mint 0,05 értéket tekintettük szignifikánsnak. Katalógusa

Eredmények katalógusa

citotoxikus hatását tetrandrine a BGC-823 sejtek katalógusa

A kémiai szerkezetét tetrandrine ábrán mutatjuk be az 1A. Az anti-proliferatív hatása tetrandrine vizsgáltuk BGC-823 sejtekben az MTT assay. Amint az ábrán látható, az 1B, a sejteket 24, 48 és 72 órán át különböző koncentrációjú tetrandrine. Tetrandrine azt találták, hogy szignifikánsan gátolja a növekedést a BGC-823 sejtek dózis- és időfüggő módon. BGC-823 sejteket szignifikánsan gátolta tetrandrine 10 ng /ml ( P
< 0,05). Az IC _{50 érték volt 6,104 ± 0,786, 4,471 ± 0,650, és 3,744 ± 0,573 következő 24, 48, és 72 órával az tetrandrine kezelés, ill. Így, 6, 8, és 10 ng /ml-es koncentrációban határoztuk meg, mint a képviselője koncentrációját a következő vizsgálatokban.}

az apoptotikus tetrandrine

Tetrandrine-közvetített daganatellenes képességeit leírták, hogy társulhat apoptózist [9-12]. Ennek megfelelően vizsgáltuk a képességét, tetrandrine-indukálta apoptózisa BGC-823-sejteken, áramlási citometriás vizsgálattal. Amint amelyet áramlási citometriával mérünk, a hatásait tetrandrine on BGC-823 sejt apoptózis ábra mutatja a 2A és B, a 24-H tetrandrine kezeléseket 0, 6, 8, és 10 ng /ml-es eredményező 4,35%, 11,4% , 17.72%, és 32.34% apoptotikus sejtek, illetve és tetrandrine (8 ug /ml), 0, 12, 24, és 48 órával kapott 3,4%, 6,64%, 19,15%, és 25,85% az apoptotikus sejtek, ill (2C ábra és D). Ezek az adatok egyértelműen azt jelezte, hogy tetrandrine indukált apoptózist BGC-823 sejtek dózis- és időfüggő módon. A számok az apoptotikus sejtek együtt emelkedett a tetrandrine koncentráció és a kezelés ideje. Katalógusa

Tetrandrine mediálta expressziója a Bcl-2 család tagjai

Annak vizsgálatára, a konkrétabb mechanizmust az apoptózis kiváltása BGC -823 sejtek tetrandrine észleltünk expresszióját apoptózis kapcsolódó fehérjék Western-blottal és azok mRNS szint valós idejű (RT) -PCR. Itt, tanulmányoztuk a kifejezés a Bax, Bad, Bak, Bcl-2, és a Bcl-XL BGC-823 kezelt sejtek tetrandrine. 24 óra eltelte után az expozíció tetrandrine, Bax, Bad, és a Bak fehérje expressziót dózisfüggően növekedett, míg a Bcl-2 és Bcl-XL protein expressziója volt dózisfüggően csökkentette (3A ábra). Azt is tapasztaltuk, hogy tetrandrine lehetett upregulate expresszióját Bax és downregulate expresszióját a Bcl-2, egy időfüggő módon (3B, ábra). Annak meghatározására, hogy tetrandrine hatással lenne a gén transzkripcióját a Bcl-2, Bcl-XL, és a bax, a mRNS expresszióját vizsgáltuk RT-PCR (3C, ábra). Az RT-PCR eredmények világosan egybeesett azok ábra mutatja be a 3A.

Tetrandrine-indukálta apoptózis útján mitokondriális útvonal BGC-823 sejtek

vizsgálni, hogy tetrandrine-indukálta apoptózis társult kaszpáz tagok, mértük a kifejezés a kaszpázok a BGC-823 kezelt sejtek különböző koncentrációjú tetrandrine Western-blottal. Az eredmények azt mutatták dózisfüggő magasság a hasított kaszpáz-3 és a hasított kaszpáz-9 tetrandrine- kezelt sejtekben (4a ábra). Azonban nem festôdik szintje a hasított kaszpáz-3 és a hasított kaszpáz-9 találtak a sejtek hiányában tetrandrine kezelés (az adatokat nem mutatjuk be). További meghatározása a szerepe a kaszpáz-aktiválás in tetrandrine által indukált apoptózis, BGC-823 sejteket előkezeltük a pán-kaszpáz inhibitor Z-VAD-FMK (10 uM), 4 órán át, majd kezeltük 8

• PLoS One: SULF2 Metiláció társul In Vitro Cisplatin érzékenység és a klinikai hatásosság gyomorrák kezelt betegek Módosított FOLFOX Regimen
• PLoS One: leszabályozza a claudin-18 társított proliferatív és inváziós potenciált a gyomorrák a Invazív Front