PLoS One: Reg IV közvetlen célpontja a bél transzkripciós faktor CDX2 gyomorrákban

absztrakt

REG4 katalógusa, amely kódolja Reg IV fehérje, amely tagja a kalcium-függő lectin szupercsalád és hatékony aktivátora az epidermális növekedési faktor receptor /Akt /aktivátor protein-1 szignalizációs. Számos emberi rák overexpresszál Reg IV Reg IV kifejezés társul bél fenotípus differenciálás. Azonban szabályozása REG4 katalógusa transzkripciós továbbra is tisztázatlan. A jelen tanulmányban azt vizsgáltuk, hogy CDX2 szabályozza Reg IV kifejezés gyomorrákban (GC) sejtek. Expressziója Reg IV és CDX2 analizáltuk Western-blot és kvantitatív reverz transzkripciós polimeráz-láncreakció 9 GC sejtvonalakban és 2. vastagbélrák sejtvonalak. A funkció az 5'-szegélyező régió, a REG4
gén jellemezte luciferáz assay. 9 GC sejtvonalak endogén Reg IV CDX2 kifejezés jól korrelált. Használata egy ösztrogén receptor által szabályozott formában CDX2, gyors indukálása Reg IV expressziót figyeltünk meg a HT-29 sejtekben. Riportergén vizsgálati eljárások kiderült fontos szerepet transzkripció számára konszenzus CDX2 DNS-kötő elemek az 5'-szegély-régióban a REG4
gént. A kromatin immunprecipitációs vizsgálatok azt mutatták, hogy CDX2 kötődik közvetlenül az 5'-szegélyező régió REG4 katalógusa. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy CDX2 fehérje közvetlenül szabályozza Reg IV expressziót.

bevezető hivatkozás: Naito Y, Oue N, Hinoi T, Sakamoto N, Sentani K, Ohdan H, et al. (2012) Reg IV közvetlen célpontja a bél transzkripciós faktor CDX2 gyomorrákban. PLoS ONE 7 (11): e47545. doi: 10,1371 /journal.pone.0047545 katalógusa

Szerkesztő: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Amerikai Egyesült Államok katalógusa

Beérkezett: 2012. május 24., Elfogadva: szeptember 12, 2012; Megjelent: november 2, 2012 katalógusa

Copyright: © 2012 Naito et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: Ez a munka támogatott Grants-in-Aid Kutatási Minisztérium Oktatási, Kulturális, Tudományos, Sport és Technológiai Japán, és részben egy Grant-in-támogatás a harmadik átfogó 10 éves stratégia Rákellenes és Rákkutató Minisztérium egészségügyi, Munkaügyi és jóléti Japán, és a National Institute of Biomedical Innovation (Program támogatnia kell az alapvető tanulmányok Health Sciences). A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

Gyomorrák (GC) az egyik leggyakoribb humán rák a világon. Rák következtében alakul többszörös genetikai és epigenetikai változások [1]. Mi korábban végzett soros analízise génexpresszió (SAGE) négy elsődleges GC és azonosítottak több GC-specifikus gének [2]. Ezen gének, regeneráló sziget származó családtag 4 katalógusa ( REG4 katalógusa, amely kódolja Reg IV protein) egy jelölt gén a rák-specifikus kifejezés [3]. REG4 katalógusa tagja a REG katalógusa gén család, amely a kalcium-függő lektin szupercsaládba. REG4
eredetileg azonosított nagy áteresztőképességű szekvencia analízise egy nagy gyulladásos bélbetegség cDNS-könyvtár [4]. Reg IV egy potenciális aktivátora az epidermális növekedési faktor receptor (EGFR) /Akt /aktivátor protein-1 (AP-1) jeltovábbítási útvonal vastagbél rákos sejteket, és növeli expressziója a Bcl-2, Bcl-XL és a survivin, melyek fehérjék társított az apoptózis gátlása [5]. Kiegészítését az REG4 katalógusa gént írtak le hasnyálmirigyrák [6]. Reg IV már azonosították az egyik gén felfelé szabályozott rákos-kezdeményező sejtek [7]. Korábban hatását vizsgálták erőltetett expressziója Reg IV GC sejtvonal. Kimutattuk, hogy Reg IV gátolja az 5-fluorouracil (5-FU) által kiváltott apoptózis révén EGFR aktiválását GC sejtekben [8]. Ezzel szemben, a Reg IV-overexpresszáló sejtek nem mutattak szignifikáns különbséget proliferáció és invázió aktivitás képest transzfektált sejtek üres vektorral [8]. Ez alátámasztja azt az elképzelést, hogy Reg IV fehérje részt vesz a gyomor kialakulásában. Katalógusa

GC osztható négy fenotípus szerinti mucin kifejezés: gyomor- vagy foveolar fenotípus; bél fenotípus; bél és gyomor vegyes fenotípus; és sem a gyomor, sem bél fenotípus [9]. Eltérő genetikai változások úgy tűnik, hogy jár a gyomor és a bélrendszer fenotípus GC [10]. Korábbi megfigyelések, Reg IV-ben kifejezve 30% GC esetben, és korrelál a bél fenotípus [11]. Számos immunhisztokémiai elemzések Reg IV számoltak be humán rákok [11] - [20]. Általánosságban, ezek az elemzések azt jelentette, hogy Reg IV expresszálódik adenokarcinóma sejtek megjelenítésére egy bél fenotípust. Leírták, hogy a Reg IV expressziót által indukált GLI1, amely kulcsfontosságú transzkripciós tényező a Hedgehog jelátviteli [21], vagy a növekedési faktorok, mint az EGF, transzformáló növekedési faktor-α (TGF-α), hepatocita növekedési faktor (HGF) vagy bázikus fibroblaszt növekedési faktor (bFGF) [22]. Ezek a molekulák azonban nem valószínű, hogy számot adjon a szövetség között Reg IV kifejezés és bélrendszeri fenotípus differenciálódását. Katalógusa

Már korábban megállapították, hogy kifejeződése Reg IV korrelált CDX2 kifejezés [11]. CDX2 egy emlős caudális kapcsolatos intesztinális transzkripciós faktor és fontos a karbantartása bél epiteliális sejtek [23], [24]. Számos bizonyíték arra utal, hogy intesztinális metaplázia a gyomor és a bél fenotípus GC társított ektopikus CDX2 kifejezés [9], [25]. A jelen tanulmányban azt vizsgáltuk, hogy CDX2 szabályozza Reg IV kifejezést GC és megállapította, hogy CDX2 közvetlenül kötődik az 5'-szegélyező régió REG4 katalógusa gént és fokozza a promoter aktivitását. Katalógusa

Eredmények

Reg IV CDX2 Expression korrelálnak a GC Cells katalógusa

először vizsgálták indukció Reg IV expressziójának CDX2 GC sejtvonalak. Western-blot-analízise CDX2 9 GC sejtvonalakban kiderült, hogy nem, vagy csak alacsony szintű expresszióját CDX2 detektáltunk MKN-7, TMK-1, HSC-44PE, és KATO-III (1A.). Annak meghatározására, hogy CDX2 és Reg IV expresszió szorosan korrelált a GC-sejtek, Western blot és kvantitatív reverz transzkripciós polimeráz-láncreakció (QRT-PCR) analízise Reg IV végeztünk 9 GC sejtvonalakban. Ábrán látható. 1A, Reg IV fehérje expresszióját csak detektáltunk a 3 sejtvonalak magas a REG4
transzkriptumok által mért QRT-PCR. Az 5 GC sejtvonalak CDX2 fehérje expresszió, 2 sejtvonal (MKN-1 és MKN-28) nem voltak kimutatható kifejezése REG4 katalógusa átiratok és fehérje. A sejtvonalakat, nem kimutatható CDX2 fehérje expresszióját (MKN-7, TMK-1, HSC-44PE, és KATO-III) nem mutatnak REG4
transzkriptumok vagy fehérje (1A.).

Következő, generált poliklonális populációját MKN-7, TMK-1, HSC-44PE, és KATO-III sejtek magas szinten kifejező CDX2 által fertőzés a sejtek replikációdefektív retrovírusok könyv egy teljes hosszúságú humán CDX2 cDNS mert nem, vagy csak alacsony szintű expresszióját CDX2 detektáltunk ezen sejtvonalak. Azonban overexpressziója CDX2 nem aktiválta Reg IV expressziót Western blot (adatokat nem mutatjuk). Mivel lehetséges, hogy a CDX2 önmagában nem elegendő aktiválására Reg IV kifejezés, expressziója CDH17 katalógusa (kódolás LI-cadherin fehérje), amely egyike a célpontjai CDX2 [24], is vizsgáltuk. Azonban aktiválása LI-cadherin expresszió nem volt megtalálható a MKN-7, TMK-1, HSC-44PE, és KATO-III sejtek magas szinten kifejező CDX2 (az adatokat nem mutatjuk be). Mivel kimutattuk aktiválását LI-cadherin expresszió által CDX2 a HT-29 vastagbél rákos sejtvonal [24], indukcióját Reg IV expressziót vizsgáltuk ugyanabban a sejtvonalban. Ábrán látható. 1B, indukciója Reg IV expressziót detektáltunk a HT-29 sejtek fertőzött retrovírusok könyv egy teljes hosszúságú humán CDX2 cDNS-t. Mi is generált poliklonális populációját SW480 (vastagbél rák sejtvonal) sejtek magas szinten kifejező CDX2 által fertőzés a sejtek replikációdefektív retrovírusok könyv egy teljes hosszúságú humán CDX2 cDNS-t. Ábrán látható. 1B, indukciója Reg IV expressziót találtunk SW480 fertőzött sejtek retrovírusok könyv egy teljes hosszúságú humán CDX2 cDNS-t. Ezek az eredmények azt sugallják, hogy Reg IV expresszió indukálható CDX2 sejtvonalakban származó vastagbél rák. Mert intestinalis metaplasia a gyomor, CDX2 Reg IV kifejezés jól korrelál [11], a használata a vastagbélrák sejtvonal alkalmas lehet a modell intestinalis metaplasia. Katalógusa

Hogy jobban közötti kapcsolat értékelésére CDX2 Reg IV kifejezés azt vizsgáltuk, Reg IV kifejezés egy HT-29-eredetű összhangban szigorúan szabályozott CDX2 tevékenység. Mi egy poliklonális HT-29 sejtvonal, hogy már a transzdukciót a pCDX2-ER vektor. A pCDX2-ER vektor kódol egy kiméra protein, amely a teljes hosszúságú CDX2 szekvenciák fuzionálva upstream mutált ösztrogén receptor (ER) ligand-kötő domén. A mutált ER ligand-kötő domén nem kötődik az ösztrogén, de megtartja a képességét, hogy kötődni tamoxifen. A kezelés a HT-29 /CDX2-ER sejtvonal 4-hidroxi-(4-OHT-t) eredményezett erős indukcióját Reg IV fehérje expresszió 48 órán belül (ábra. 1C). Ezek az eredmények azt jelzik, hogy Reg IV egy közvetlen vagy elsődleges célgén által szabályozott CDX2. Azonban CDX2 önmagában nem elegendő az aktiváló Reg IV kifejezést. Katalógusa

gátlása CDX2 RNS interferencia (RNSi) Eredmények a down-regulációja Reg IV GC Cells katalógusa

Annak meghatározására, hogy CDX2 szükséges a Reg IV expressziót GC sejtekben elemeztük a gátló hatás CDX2 expressziójának RNSi szintjének Reg IV expressziót HSC-39 sejtvonal, mert a magas endogén CDX2 és Reg IV expressziót detektáltunk HSC-39 sejtvonal. CDX2-specifikus kis interferáló RNS-ek (siRNS-ek) lényegesen csökkentette CDX2 fehérje expressziós 3 nappal a transzfekció után, és kifejezése Reg IV transzkriptumot alulszabályozott körülbelül 50% -kal CDX2 siRNS a HSC-39 aránya a szintek a kontroll siRNS-kezelt sejtekben ( ábra. 1D). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy CDX2 részt vesz a fenntartásában Reg IV génexpresszió. Katalógusa

funkcionális jellemzése 5'-szegélyező régió REG4 katalógusa Gene luciferáz kísérleti katalógusa

A potenciális CDX2 kötésében a REG4 katalógusa promoter régió, a keresés a genomi szekvenciák közvetlenül 5'a feltételezett transzkripciós starthely hajtottunk végre konszenzus kötelező eleme a CdxA csirke caudalis katalógusa homológ (5'-a, a /T, T, a /T, a, T, a /G-3 ') [26] és egy korábban leírt keresési algoritmust [27]. Azt találtuk, négy feltételezett CDX2-kötőhelyek 2 kilobázis (kb) 5'-szegélyező régió, a REG4
gén (2A.). Ezek a következők voltak: Site (5'-AATAATA-3 ', -1.828--1.834), helyszín B (5'-CTTTACAG-3', honnan -901 hogy -908), helyszín C (5'-TTTTATGG-3 "származó -114 hogy -121), helyszín D (5'AATAATA -3" -90 -96). Szerepének értékeléséhez ilyen feltételezett CDX2-kötőhelyek szabályozásában REG4 katalógusa átírás, különböző riporter gén konstrukciót hoztunk létre. Ábrán látható. 2B, riporter gén konstrukciót tartalmazó 2,1, 1,2, illetve 0,6 kb-5'-szegélyező szekvenciát a REG4
gén mutatott erős aktivitást a HSC-39-sejtek, amely megjeleníti az erős endogén expresszióját REG4
átiratok és fehérje. Összehasonlításképpen, MKN-1 sejtek kis endogén REG4
transzkriptum és kijelzésre alig vagy egyáltalán nem transzkripciós aktivitása által kiváltott 2.1, 1.2, illetve 0,6 kb A REG4
riporter gén konstrukció (adatokat nem mutatjuk) . A REG4 katalógusa riporter gént tartalmazó konstrukciók bázispár -116 a 58 és -87, hogy 58-ra csökkent aktivitás a HSC-39 sejtek (ábra. 2B), jelezve, hogy szekvenciák közötti bázispár -634 és - 116 kulcsszerepet játszanak aktiválásában REG4 katalógusa átírás. Továbbá, elemeztük egyszeri és többszöri mutációk a feltételezett CDX2-kötőhelyek az 5'-szegély-régióban a REG4
gén felhasználásával HSC-39 sejtek (ábra. 2C). Ahogy az várható volt, a vélelmezett CDX2-kötő C, amely között található bázispár -634 és -116, döntő szerepet játszik az aktiváló REG4 katalógusa átírás.

CDX2 Közvetlenül kötődik az 5 ' -flanking régió REG4 katalógusa Gene katalógusa

Annak vizsgálatára, hogy CDX2 közvetlenül kötődik a feltételezett CDX2-kötőhelyek REG4 katalógusa 5'-szegélyező régióban végeztünk kromatin immunprecipitációs (chip) assay HSC-39 sejtekben. A 6-iáncindítók a REG4
5'-szegélyező régió (3A.), Mi kinyert DNS-fragmenseket tartalmazó REG4
5'-szegélyező régiót Primer 1, amely magában foglalja a feltételezett CDX2- kötőhely C (ábra. 3B). DNS-fragmensek 5'-szegélyező régió REG4 katalógusa, amely generáltunk primerek alkalmazásával a 2., 3., 4., 5. és 6. oly módon, hogy azok nem tartalmaznak vélelmezett CDX2 kötőhelyeket, nem kinyerjük az anti- CDX2 antitest. A sajátossága helyreállítását a REG4 katalógusa promoter régiót követő chip anti-CDX2 antitestet mutatja az a tény, hogy más releváns DNS fragmentumok hiányzik CDX2-kötőhelyek (pl exon 3 CDX1
gén) nem került vissza (ábra. 3B). Ezen túlmenően, makett immunprecipitációt (egér IgG) után néhány REG4 katalógusa vagy CDX1 katalógusa specifikus DNS-fragmentumok (ábra. 3B). Mindezek az eredmények arra utalnak, hogy CDX2 aktiválja REG4 katalógusa átirata közvetlenül kötelezőek szekvenciák 5'-szegélyező a gén. Katalógusa

trimetiláció hiszton H3 lizin 27 (H3K27me3) REG4 katalógusa Szervező a GC sejtvonalak

Bár CDX2 fehérje expressziót találtak MKN-1 és MKN-28 sejtvonal, ezek 2 sejtvonal nem voltak kimutatható kifejezése REG4 katalógusa átirat és fehérje. Mivel azt jelentették, hogy a DNS hipermetiláció CpG-szigetek társul hangtompító számos gén [28], azt vizsgáljuk, hogy a DNS-metilációs indukált transzkripcionális inaktiválásához Reg IV MKN-1 és MKN-28 sejtekben. Kezeltük ezeket a sejteket egy demetilező szer, 5-aza-2'-dezoxicitidin (Aza-dC), majd végezzük QRT-PCR. Azonban Reg IV expresszió nem visszaállított ezekben a sejtvonalakban (az adatokat nem tüntettük fel), ami arra utal, hogy a DNS metiláció nem érintheti Reg IV expressziót. Azt is jelentette, hogy H3K27me3 kapcsolatba hozták a elfojtott génexpressziót [29]. Mi tovább vizsgálják H3K27me3 GC sejtvonalak. Annak megállapításához, a gazdagodását H3K27me3 a REG4 katalógusa promoter GC sejtvonalak, chip vizsgálatokat végeztünk. In MKN-1 és MKN-28 sejtvonal H3K27me3 szint a REG4 katalógusa promoter régióban magas volt, míg a HSC-39 sejtvonal H3K27me3 szinten a REG4 katalógusa promoter régió alacsony volt (3C.). Ezek az eredmények azt sugallják, hogy a zárt kromatin szerkezetének REG4
promoter képes gátolni Reg IV expressziót CDX2.

Discussion

Habár beszámoltak arról, hogy Reg IV expressziót által indukált GLI1 [21] vagy EGF [22], ezek a molekulák nem valószínű, hogy teszik a szövetség között Reg IV és bélrendszeri differenciálás. A jelen tanulmányban azt mutatták, hogy az endogén CDX2 Reg IV expresszió jól korreláló GC sejtvonalak. Ezen felül, segítségével egy ER-szabályozott formában CDX2, azt találtuk, hogy nem volt gyors indukálása Reg IV expresszió után 4-OHT kezelést. Riporter gén vizsgálatokban kiderült, hogy fontos szerepet konszenzus CDX2 DNS-kötő elemek a REG4 katalógusa promoter régiójában található transzkripció. Későbbi ChIP vizsgálatok azt mutatták, hogy CDX2 kötődik közvetlenül a REG4 katalógusa promoter. Korábban kimutatták, hogy a primer GC szövetek és intesztinális metaplázia a gyomor, CDX2 és Reg IV kifejezés jól korreláltak [11]. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy CDX2 fehérje közvetlenül szabályozza Reg IV expressziót GC és bélrendszeri metaplázia a gyomor.

CDX2 túlexpresszálódik bél fenotípus GC és intestinalis metaplázia a gyomor [9], [25]. Ezzel szemben, a veszteség a CDX2 expresszió volt megfigyelhető egy részhalmaza primer colorectalis rák, általában rosszul differenciált colorectalis rák [30]. A jelentősége megváltoztatását CDX2 expresszió emberi rákos megbetegedések továbbra is tisztázatlan, és ezért fontos, hogy meghatározza a megcélzott gének, amelyek lefelé CDX2. Több olyan CDX2 szabályozott géneket, mint a CDH17 katalógusa (kódoló LI-cadherin) [24], HEPH katalógusa (kódoló hephaestin) [31], ABCB1
(kódoló multidrog 1) [32], és DSC2 katalógusa (kódoló desmocollin 2) [33]. Ezek közül a gének, A ABCB1
eredetileg azonosították egy túlzott mértékben expresszált, és amplifikált gén többszörös gyógyszer-rezisztens sejteket, és terméke, a P-glikoprotein, úgy tűnik, hogy kritikus szerepet játszanak a gyógyszer-rezisztencia [34]. Korábban már beszámoltunk, hogy a kényszerített expressziója Reg IV GC gátolt sejtek 5-FU által kiváltott apoptózist indukálása útján Bcl-2 és a dihidropirimidin-dehidrogenáz [8]. Összefoglalva, akkor lehetséges, hogy a bél fenotípus GC, kifejezés (vagy ektopikus expresszió) A CDX2 indukál Reg IV és multidrog rezisztencia 1 expresszió növekedését eredményezi a gyógyszer-rezisztencia. Sőt, azt is leírták, hogy a posztoperatív kemoterápia nem előnyös a betegek bél fenotípus GC [35].

Bár az adatok alátámasztják azt a nézetet, hogy a CDX2 játszik szerepet szabályozásában REG4
transzkripciós keresztül kötődik a promoter régiót, több megállapítások jelzik, hogy CDX2 önmagában nem elegendő aktiválására REG4
kifejezést. A jelen vizsgálatban, mi generált poliklonális populációját MKN-7, TMK-1, HSC-44PE, és KATO-III-expresszáló sejtek magas szinten CDX2 által fertőzés retrovírusok könyv egy teljes hosszúságú humán CDX2 cDNS-t. Azonban túltermelése CDX2 nem aktiválta Reg IV kifejezést. GC sejtvonalak, sem a sejtvonalak nem kimutatható CDX2 fehérje expresszió volt kimutatható REG4
transzkriptumok és fehérje. Ezért CDX2 szükséges Reg IV kifejezés, de CDX2 önmagában nem elegendő aktiválására Reg IV expressziót. A jelen vizsgálatban, kilenc GC sejtvonalakat vizsgáltunk. Az eredete a sejtvonalak a következők voltak. Az MKN-7, MKN-28, és MKN-74 sejtvonalak alakultak intestinalis típusú GC. A TMK-1 és MKN-45 sejtvonalak alakultak diffúz típusú GC. A KATO-III, HSC-39, és HSC-44PE sejtvonalak létre pecsétgyűrű sejtes carcinoma. Az MKN-1 sejtvonal jött létre adenosquamosus sejtes karcinóma. Mert intestinalis metaplasia a gyomor, CDX2 Reg IV kifejezés jól korrelál, GC sejtvonalak diffúz típusú GC vagy pecsétgyűrű sejtes carcinoma nem lehet alkalmas az elemzéshez a Reg IV indukció CDX2. Tény, Reg IV expresszió által kiváltott CDX2 sejtvonalakban származó vastagbél rák a jelen tanulmányban. Továbbá kimutattuk, hogy H3K27me3 szint a REG4 katalógusa promoter régióban magas volt az MKN-1 és MKN-28 GC sejtvonalak. Ezek a 2 sejtvonal nem voltak kimutatható kifejezése REG4 katalógusa bár CDX2 fehérje expressziót találtunk. Ezért H3K27me3 szint a REG4 katalógusa promoter régió nagy lehet MKN-7, TMK-1, HSC-44PE és KATO-III sejtek, amelyekben túltermelése CDX2 nem aktiválta Reg IV kifejezés.

leírták, hogy a REG4
mRNS expresszió fokozható stimulálás TGF-α, EGF, HGF, vagy bFGF aktiválása révén a mitogén-aktivált protein kináz (MAPK) reakcióút [22] . Így lehetne feltételezték, hogy Reg IV is szabályozza downstream transzkripciós faktorok a MAPK útvonalak. Végeztünk in silico katalógusa elemzi a REG4 katalógusa gén 5'-szegélyező régió, és megállapította, legalább egy feltételezett AP-1 konszenzus szekvenciák (a -883 bázispárjaival REG4
gén 5'-szegélyező régió), amely a downstream transzkripciós faktor MAPK jelátvitel. A jelen vizsgálatban, HSC-39 sejtek mutattak hasonló transzkripciós aktivitását riporter gén konstrukciót tartalmazó 1,2 kb és 0,6 kb a REG4
5'-szegélyező szekvenciát. Mivel a hatása EGF vagy TGF-α a REG4 katalógusa átírás nem vizsgálták a jelen tanulmányban, további vizsgálatok szükségesek, hogy tisztázza a jelátviteli indukáló szabályozása REG4 katalógusa átírás.

Végeredményben a jelenlegi adatok azt mutatják, hogy CDX2 fehérje közvetlenül szabályozza Reg IV kifejezést. Reg IV aktiválja az EGFR /Akt /AP-1 jelátviteli. Mivel a bél fenotípus GC gyakran fejezi EGFR [36], azt javasoljuk, hogy ez a Reg IV-aktivált reakcióút fontos szerepet játszik ebben a altípusának GC. Mivel CDX2 is indukálja a multidrog rezisztencia gén, ABCB1 katalógusa, az anti-EGFR terápia azonban nem kemoterápia hasznos lehet a betegek bél fenotípus GC. Katalógusa

Anyagok és módszerek katalógusa

plazmidokat

a CDX2 cDNS-t helyezünk a többszörös klónozási helyén a retrovirális expressziós vektorba PPG-CMV-CITE-neo korábban leírtak [24]. A teljes hosszúságú, vad típusú CDX2 cDNS-t is szubklónoztuk retrovirális vektor pBabe-Puro ER korábban leírt generál pCDX2-ER [24]. A pCDX2-ER vektor kódol egy kiméra protein, amely a teljes hosszúságú CDX2 szekvenciák fuzionálva upstream mutált ER ligand-kötő domén. A mutált ER ligand-kötő domén nem kötődik az ösztrogén, de megtartja a képességét, hogy kötődni tamoxifen. A genomiális DNS-szekvenciák az 5'-szegély-régió A humán REG4
gén PCR-rel amplifikáltuk genomikus DNS-t tisztítottunk HSC-39 sejtek, mint egy sablont, és szubklónoztuk a pGL4.10 [luc2] vektorba (Promega , Madison, WI). PCR-alapú módszereket használtak mutációk bejuttatására a feltételezett CDX2-kötőhelyek pGL4.10-REG4 riporter gén konstrukció segítségével QuikChange Helyre irányuló mutagenezis kit (Stratagene, La Jolla, Kalifornia). Négy feltételezett CDX2 kötőhelyek megváltoztak. Minden fragmentumokat PCR igazoltuk automata szekvenálás. A plazmid pGL4.74 [hRluc /TK] vektorba (Promega) alkalmaztuk kontrollként transzfekciós hatékonyság riporter vizsgálatokban.

sejtvonalak retrovírus által okozott fertőzések, és a gyógyszeres kezelés

amfotropikus Phoenix csomagoló sejtvonal adta G. Nolan (Stanford University, Stanford, Kalifornia) [37]. Kilenc származó sejtvonalak emberi GC és 2. származó sejtvonalakban a humán vastagbélrák használtunk. A TMK-1 sejtvonal jött létre laboratóriumunkban [38]. A HSC-39 és HSC-44PE sejtvonalak alakultak az egyik szerző (Kazuyoshi Yanagihara) [39], [40]. Öt GC sejtvonalak a MKN sorozatot bocsátotta rendelkezésünkre Dr. Toshimitsu Suzuki [41], [42]. A KATO-III sejtvonal volt szíves rendelkezésünkre Dr. Morimasa Sekiguchi [43]. A HT-29 és SW480 vastagbél rák sejtvonalak az American Type Culture Collection. A sejteket folyékony nitrogénben tároljuk, amíg a megindítását ebben a vizsgálatban. Felolvasztása után fagyasztott készlet a sejteket tartjuk alacsony áthaladás egész vizsgálat alatt. Következetes sejtek morfológiáját nyomon összehasonlítása mikroszkópos képek. A Phoenix csomagolás sejteket transzfektáltunk retrovirális expressziós konstrukciók (PPG-CDX2, PPG-k-neo, és pCDX2-ER), és a felülúszót tartalmazó nonreplicating amfotropikus vírust összegyűjtöttük a korábban leírt [24]. HT-29 expresszáló sejtek CDX2-ER fúziós fehérje (HT-29 /CDX2-ER), CDX2 funkció aktivált hozzáadásával 4-hidroxi-(4-OHT) (Sigma Chemical, St. Louis, MO) a növekedési közeg végső koncentrációban 500 nmol. Annak vizsgálatára, hogy a DNS-metilációs indukált transzkripcionális inaktiválásához Reg IV sejteket kezeltünk egy végső koncentrációja 1 jiM Aza-dC-t (Sigma Chemical) 5 napig, mielőtt azokat betakarított RNS kivonása.

Western-blot-elemzés

Western blot analízishez a sejteket lizáltuk, a korábban leírtak szerint [44]. A protein koncentrációt határoztuk meg Bradford-féle proteinvizsgálattal (BioRad, Richmond, CA) BSA-val használjuk, mint a standard. A lizátumokat (20 ug) Laemmli által mintapufferben történő forralással, majd alávetjük 12% -os SDS-poliakrilamid gél-elektroforézissel, majd elektro-transzfer nitrocellulóz szűrőt. A szűrőt 1 órán át inkubáljuk szobahőmérsékleten, egy anti-Reg IV antitest (nyúl poliklonális antitestet laboratóriumunkban kifejlesztett, hiv. 10), vagy anti-CDX2 antitesttel (BioGenex, San Ramon, CA). A peroxidázzal konjugált anti-nyúl vagy anti-egér IgG-t alkalmaztunk a szekunder reakcióban. Immunkomplexek láthatóvá tételéhez ECL Plus Western Blot Detection System (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). β-aktin (Sigma Chemical) is kimutatható volt, mint egy terhelési kontrollként.

QRT-PCR analízis

Teljes RNS-t extraháljuk, RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) és 1 ug teljes RNS-t alakítjuk cDNS-t egy First Strand cDNA Synthesis Kit (Amersham Biosciences). Kvantitatív REG4
mRNS szintek végeztük valós idejű fluoreszcens detektálás korábban leírtak szerint [45]. PCR-t végeztünk egy SYBR Green PCR Core Reagents készlet (Applied Biosystems, Foster City, CA). Valós idejű detektálását az emissziós intenzitásának SYBR zöld kötött kettős-szálú DNS végeztük ABI Prism 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems) a korábban leírtak szerint [46]. ACTB
-specifikus PCR termékeket amplifikáltuk az azonos RNS-mintákat és szolgált belső kontrollként. Sequences of primerek REG4
QRT-PCR táblázatban mutatjuk be 1. qRT-PCR-eket három párhuzamossal végzett minden egyes minta primer készlet, és az átlag és szórás (SD) a három kísérlet számítottuk, mint a relatív mennyiségi értékét. Végén 40 PCR-ciklus, reakciótermékek elválasztjuk elektroforetikusan 8% nem-denaturáló poliakrilamid gélek vizuális megerősítés a PCR-termékek.

RNSi

knockdown az endogén CDX2, RNSi végeztünk . Két siRNS duplexeket célzási CDX2 (5'-AACCAGGACGAAAGACAAAUA-3 ', CDX2 siRNA1; és az 5'-AAGCCUCAGUGUCUGGCUCUG-3', CDX2 siRNA2), és egy nonsilencing siRNS duplex (5'-AAUUCUCCGAACGUGUCACGU-3 ') szintetizálunk (Qiagen). A transzfekciót végeztünk Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA) alkalmazásával a gyártó protokollja. Röviden, 60 pmol siRNS és 10 jil Lipofectamine RNAiMAX összekeverünk 1 ml RPMI tápközegben (10 nmol /l végső siRNS koncentráció). 20 perc eltelte után az inkubálás után a keveréket hozzáadjuk a sejtekhez, és ezeket szélesztünk Edények minden meghatározáshoz. Három nappal a transzfekció után a sejteket analizáltuk minden kísérletben.

Reporter Gene Assay

HSC-39 és MKN-1 sejteket oltottunk 6 mérőhelyes lemezekre (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ ). A sejtek 50% -80% összefolyásig végeztünk 3 ul FuGENE6 transzfekciós reagens (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN), 0,8 ug pGL4.10 riporter gén konstrukciót, és 0,2 ug pGL4.74 [hRluc /TK] vektor (Promega). A transzfekció után 48 órával a sejteket összegyűjtjük, és újra szuszpendáljuk passzív lízis-puffert (Promega). A luciferáz aktivitást meghatározzuk egy kettős Luciferase Assay System (GloMax 96 Microplate luminométer, Promega).

ChIP Assay

A chip vizsgálatokat végeztünk az EZ-chip kromatin immunprecipitációs Kit (Millipore, Billerica , MA) egy a gyártó utasításait. Annak vizsgálatára, hogy CDX2 közvetlenül kötődik a feltételezett CDX2-kötőhelyek REG4 katalógusa 5'-szegélyező régióban végeztünk ChIP assay HSC-39 sejtekben. Röviden, a HSC-39 sejteket (1-2 x 10 ^{7) voltak térhálósított 1% formaldehidet tartalmazó foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS) 15 percig 37 ° C-on, és a glicin adunk, hogy leállítsuk a reaktív aldehidek. Mosás után a sejteket hideg PBS-sel a sejteket újra felszuszpendáltuk SDS-lízispufferben (1% SDS, 10 mM EDTA-t, és 50 mM Tris pH = 8,1) a proteináz inhibitor (Roche Diagnostics). Miután a mintákat ultrahanggal kezeltük, kromatin kivonatokat tartalmazó DNS-fragmenseket (átlagos mérete 500 bázispár) immunprecipitáltuk 2 ug monoklonális anti-CDX2 antitest (BioGenex) vagy 2 ug egér IgG-t (Millipore). Mindegyik immunprecipitált DNS mintát mennyiségileg qPCR primereket használva az 1. táblázatban felsorolt ​​Negatív kontrollként, egy körülbelül 200 bázispár DNS-fragmenst a 3. exon a CDX1
gént amplifikáltunk PCR-rei specifikus primereket (lásd 1. táblázat ).}

Annak meghatározására, a dúsítási H3K27me3 a REG4
promoter GC sejtvonalak, chip vizsgálatokat végeztünk MKN-1, MKN-28, és a HSC-39 sejtvonalak. Röviden, a GC-sejteket (1-2 x 10 ^{7) voltak térhálósított 1% formaldehid PBS-ben 15 percen át 37 ° C-on, és a glicin adunk, hogy leállítsuk a reaktív aldehidek. Mosás után a sejteket hideg PBS-sel, a sejteket újra felszuszpendáltuk SDS lízis pufferben proteináz inhibitor (Roche Diagnostics). Miután a mintákat ultrahanggal kezeltük, kromatin kivonatokat tartalmazó DNS-fragmenseket (átlagos mérete 500 bázispár) immunprecipitáltuk 2 ug poliklonális anti-H3K27me3 antitest (ABCAM, Cambridge, MA), illetve 2 ng nyúl IgG-t (Millipore). Mindegyik immunprecipitált DNS mintát mennyiségileg qPCR a REG4 katalógusa Primer 1 (1. táblázat). Katalógusa}

qPCRs háromszoros ismétlésben végeztünk minden egyes minta primer, és az átlag és szórás (SD) a a három kísérlet számítottuk a relatív mennyiségi értékét. Végén 40 PCR ciklus, reakció szétválasztjuk elektroforézissel 8% nem denaturáló poliakrilamid gélek vizuális megerősítés a PCR-termékek. Katalógusa

Köszönetnyilvánítás katalógusa

Köszönjük Mr Shinichi Norimura kiváló asszisztensi és tanácsadás. Ezt a munkát végezték a fajta együttműködés a Research Center for Molecular Medicine, Általános Orvostudományi Kar, Hiroshima Egyetem. Köszönjük a Analysis Center of Life Science, Hiroshima Egyetem használatáért a létesítményeket. Katalógusa

• PLoS One: RhoC Szabályozza a proliferáció gyomorrák sejtek kölcsönhatás révén IQGAP1
• PLoS One: differenciális expressziója foszfolipáz C Epsilon 1 társul krónikus sorvadásos gyomorhurut és gyomorfekély Cancer