PLoS ONE: Reg IV ein direktes Ziel der intestinalen Transkriptionsfaktor CDX2 in Gastric Cancer

Abstrakt

REG4
, die Reg IV-Protein codiert, ist ein Mitglied der Calcium-abhängigen Lektin -Superfamilie und potenter Aktivator der epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor /Akt /Aktivatorprotein-1-Signalweg. Mehrere menschlichen Krebsarten überexprimiert Reg IV und Reg IV Expression mit Darm-Phänotyp Differenzierung verbunden. Die Regulierung von REG4
Transkription, bleibt unklar. In der vorliegenden Studie untersuchten wir, ob die Expression Reg IV bei Magenkrebs (GC) Zellen CDX2 reguliert. Expression of Reg IV und CDX2 wurde durch Western-Blot und quantitative reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion in 9 GC-Zelllinien und 2 Kolon-Krebszelllinien untersucht. Die Funktion der 5'-flankierenden Region des REG4
Gen durch Luciferase-Assay charakterisiert wurde. In 9 GC-Zelllinien endogene Reg IV und CDX2 Expression waren gut korreliert. Unter Verwendung eines Östrogen-Rezeptor-regulierte Form von CDX2, schnelle Induktion von Reg IV-Expression wurde in HT-29-Zellen beobachtet. Reporter-Gen-Assays zeigten eine wichtige Rolle in der Transkription für Konsens CDX2 DNA-Bindungselemente in der 5'-flankierenden Region des REG4
Gen. Chromatin-Immunopräzipitation Assays zeigten, dass CDX2 bindet direkt an die 5'-flankierende Region von REG4
. Diese Ergebnisse zeigen, dass CDX2 Protein reguliert direkt Reg IV Ausdruck

Citation. Naito Y, Oue N, Hinoi T, Sakamoto N, Sentani K, Ohdan H, et al. (2012) Reg IV ist ein direktes Ziel der intestinalen Transkriptionsfaktor CDX2 in Magenkrebs. PLoS ONE 7 (11): e47545. doi: 10.1371 /journal.pone.0047545

Editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Vereinigte Staaten von Amerika

Empfangen: 24. Mai 2012; Akzeptiert: 12. September 2012; Veröffentlicht: 2. November 2012

Copyright: © 2012 Naito et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit wurde für die für Cancer Control 10-Jahres-Strategie Dritte Umfassende von Grants-in-Aid für Forschung aus dem Ministerium für Bildung, Kultur, Wissenschaft, Sport und Technologie von Japan, und zum Teil durch einen Zuschuss-in-Aid unterstützt und für Krebsforschung aus dem Ministerium für Gesundheit, Arbeit und Wohlbefinden von Japan, und für das National Institute of Biomedical Innovation (Programm zur Förderung der Grundlagenuntersuchungen in Gesundheitswissenschaften). Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs (GC) ist eine der häufigsten Krebserkrankungen des Menschen in der Welt. Krebs entwickelt sich als Folge von mehrfachen genetischen und epigenetischen Veränderungen [1]. Wir führten bisher serielle Analyse der Genexpression (SAGE) von vier primären GCs und identifizierte mehrere GC-spezifische Gene [2]. Von diesen Genen, Inseln stammenden Familienmitglied 4
Regenerieren ( REG4
, die Reg IV-Protein kodiert) ist ein Kandidatengen für Krebs-spezifische Expression [3]. REG4
ist Mitglied des REG
Genfamilie, die der Calcium-abhängigen Lektin -Superfamilie gehört. REG4
ursprünglich von Hochdurchsatz-Sequenzanalyse einer großen entzündlicher Darmerkrankung cDNA-Bibliothek identifiziert wurde [4]. Reg IV ist ein potenter Aktivator der epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) /Akt /Aktivator-protein-1 (AP-1) Signalweg in Dickdarmkrebszellen und erhöht die Expression von Bcl-2, Bcl-XL und Survivin, die Proteine ​​sind im Zusammenhang mit der Hemmung der Apoptose [5]. Die Verstärkung des REG4
Gen in Bauchspeicheldrüsenkrebs berichtet wurde [6]. Reg IV wurde als eines der Gene hochreguliert in Krebs-initiierende Zellen [7] identifiziert. Wir haben untersucht, die zuvor die Wirkung der erzwungenen Expression von Reg IV in GC-Zelllinie. Wir zeigten, dass Reg IV hemmt 5-Fluorouracil (5-FU) -induzierte Apoptose durch EGFR-Aktivierung in GC-Zellen [8]. Im Gegensatz dazu zeigen Reg IV-überexprimierenden Zellen keine signifikanten Unterschiede in der Proliferation und Invasion Aktivität im Vergleich zu Zellen, die mit leerem Vektor transfiziert [8]. Diese Ergebnisse unterstützen die Vorstellung, dass Reg IV Protein im Magen-Karzinogenese beteiligt

GC kann in vier Phänotypen nach Muzinexpression unterteilt werden:. Magen- oder Becherzellhyperplasie Phänotyp; Darm-Phänotyp; Darm- und Magen gemischten Phänotyp; und weder noch Magendarm Phänotyp [9]. Distinct genetische Veränderungen erscheinen mit Magen-und Darm-Phänotyp GC in Verbindung gebracht werden [10]. In unseren früheren Beobachtungen wurde Reg IV in 30% der Fälle GC ausgedrückt und wurde mit Darm-Phänotyp korreliert [11]. [20] - Eine Reihe von immunhistochemischen Analysen von Reg IV wurden in menschlichen Krebserkrankungen [11] berichtet. Im Allgemeinen berichteten diese Analysen, dass Reg IV-Adenokarzinom-Zellen exprimiert wird, eine Darm-Phänotyp anzeigt. Es wurde berichtet, dass Reg IV-Expression durch GLI1 induziert wird, die ein Schlüsseltranskriptionsfaktor in der Hedgehog-Signalweg ist [21], oder durch Wachstumsfaktoren wie EGF, transformierender Wachstumsfaktor-α (TGF-α), Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF) oder basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) [22]. Allerdings sind diese Moleküle unwahrscheinlich für den Verein Ausdruck zwischen Reg IV Differenzierung und Darm-Phänotyp zu berücksichtigen.

Wir haben zuvor festgestellt, dass die Expression von Reg IV mit CDX2 Expression korreliert war [11]. CDX2 eine Säuger caudal bezogenen intestinalen Transkriptionsfaktor und wichtig für die Aufrechterhaltung der intestinalen Epithelzellen [23], [24]. Mehrere Beweis legen nahe, dass intestinale Metaplasie des Magen-Darm-Phänotyp GC mit ektopischen CDX2 Expression assoziiert sind [9], [25]. In der vorliegenden Studie untersuchten wir, ob CDX2 regelt in GC-Reg IV Ausdruck und stellte fest, dass CDX2 bindet direkt an das 5'-flankierenden Bereich von REG4
Gen und verbessert die Promotoraktivität.

Ergebnisse

Reg IV und CDX2 Expression sind in GC-Zellen korrelierte

Wir erste Induktion von Reg IV-Expression durch CDX2 in GC-Zelllinien untersucht. Western-Blot-Analyse von CDX2 in 9 GC-Zelllinien zeigte, dass keine oder eine Low-Level-Expression von CDX2 in MKN-7 festgestellt wurde, TMK-1, HSC-44PE und KATO-III (Fig. 1A). Um festzustellen, ob CDX2 und Ausdruck Reg IV fest in GC-Zellen korreliert wurden, Western Blot und quantitative reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) analysiert der Reg IV wurden am 9. GC-Zelllinien durchgeführt. Wie in gezeigt. 1A, Reg IV-Protein-Expression wurde nur in den drei Zelllinien mit hoher REG4
Transkripte gemessen durch qRT-PCR nachgewiesen. Von den 5 GC-Zelllinien mit CDX2 Protein-Expression, 2-Zelllinien (MKN-1 und MKN-28) fehlte nachweisbare Expression von REG4
Transkripte und Protein. Die Zelllinien mit einer nicht nachweisbaren CDX2 Protein-Expression (MKN-7, TMK-1, HSC-44PE und KATO-III) nicht zeigen, REG4
Transkripte oder Protein (Abb. 1A).

Als nächstes erzeugt wir einen polyklonalen Population von MKN-7, TMK-1, HSC-44PE und KATO-III-Zellen ein hohes Maß an CDX2 durch eine Infektion der Zellen mit einem replikationsdefekten Retroviren Expression eines humanen Volllängen CDX2 cDNA trägt, weil keine oder eine Low-Level-Expression von CDX2 wurde in diesen Zelllinien nachgewiesen. Jedoch eine Überexpression von CDX2 fehlgeschlagen Reg IV-Expression durch Western Blot (Daten nicht gezeigt) zu aktivieren. Da es möglich ist, dass CDX2 allein nicht ausreichend ist für die Aktivierung Reg IV-Expression die Expression von CDH17
(Codierung LI-Cadherin-Protein), welches eines der Ziele von CDX2 ist [24], wurde ebenfalls untersucht. Jedoch Aktivierung von LI-Cadherin-Expression nicht in MKN-7 gefunden wurde, TMK-1, HSC-44PE und KATO-III-Zellen hohe Niveaus von CDX2 exprimierende (Daten nicht gezeigt). Weil wir die Aktivierung von LI-Cadherin-Expression durch CDX2 in der HT-29 Dickdarmkrebszelllinie zeigte, [24], die Induktion von Reg IV-Expression wurde in der gleichen Zelllinie untersucht. Wie in gezeigt. 1B, Induktion der Expression Reg IV wurde in HT-29-Zellen, infiziert mit Retroviren Durchführung einer humanen Volllängen-CDX2 cDNA nachgewiesen. Wir erzielten auch einen polyklonalen Population von SW480 (Kolon-Krebszelllinie) Zellen, die ein hohes Maß an CDX2 durch eine Infektion der Zellen mit einem replikationsdefekten Retroviren ein voller Länge menschlichen CDX2 cDNA trägt. Wie in gezeigt. 1B, Induktion von Reg IV-Expression wurde in SW480-Zellen, infiziert mit Retroviren Durchführung einer humanen Volllängen-CDX2 cDNA gefunden. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Reg IV Expression kann durch CDX2 in Zelllinien von Darmkrebs abgeleitet induziert werden. Da in intestinale Metaplasie des Magens, CDX2 und Ausdruck Reg IV gut korreliert sind [11], ist die Verwendung einer Zelllinie Darmkrebs könnte für das Modell der intestinale Metaplasie geeignet sein.

Zum besseren Verständnis der Beziehung zwischen beurteilen CDX2 und Reg IV Ausdruck, untersuchten wir Reg IV-Expression in einem HT-29-abgeleitete Linie mit streng reguliert CDX2 Aktivität. Wir verwendeten einen polyklonalen HT-29-Zelllinie, die mit dem pCDX2-ER Vektor transduziert worden waren. Der pCDX2-ER-Vektor codiert ein chimäres Protein, in dem Volllängen-CDX2 Sequenzen stromaufwärts eines mutierten Estrogenrezeptor (ER) Liganden-Bindungsdomäne fusioniert sind. Das mutierte ER-Liganden-Bindungsdomäne bindet nicht mehr Östrogen, sondern behält die Fähigkeit Tamoxifen zu binden. Die Behandlung der HT-29 /CDX2-ER-Zelllinie mit 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) führte zu einer starken Induktion von Reg IV-Protein-Expression innerhalb von 48 Stunden (Abb. 1C). Diese Ergebnisse zeigen, dass Reg IV ist eine direkte oder primäre Zielgens durch CDX2 geregelt. Doch allein CDX2 ist für die Aktivierung Reg IV Ausdruck nicht ausreichend.

Die Hemmung von CDX2 durch RNA-Interferenz (RNAi) Die Ergebnisse in der Down-Regulation der Reg IV in GC-Zellen

Um zu bestimmen, ob CDX2 Reg IV-Expression in GC-Zellen erforderlich ist, untersuchten wir die Wirkung von durch RNAi Hemmung in der Ebene der Reg IV-Expression in HSC-39-Zelllinie CDX2 Ausdruck, weil hohe endogene CDX2 und Reg IV-Expression in HSC-39-Zelllinie erkannt wurde. CDX2 spezifische small interfering RNAs (siRNAs) signifikant unterdrückt CDX2 Protein-Expression 3 Tage nach der Transfektion und Expression von Reg IV Transkript wurde nach unten reguliert etwa 50% von CDX2 siRNAs in HSC-39 im Vergleich zu den Ebenen in Kontroll-siRNA-behandelten Zellen ( Fig. 1D). Diese Ergebnisse zeigen, dass CDX2 bei der Aufrechterhaltung der Reg IV Genexpression beteiligt ist.

Funktionelle Charakterisierung der 5'-flankierenden Region von REG4
Gene von Luciferase Assay

Zur Identifizierung Potential CDX2 -Bindung Stellen im Promotorregion
REG4, eine Suche nach den genomischen Sequenzen unmittelbar 5 'zu dem vermutlichen Ort Transkriptionsstart durchgeführt wurde, um einen Konsens mit der CDXA Huhn Schwanz-
Homolog Bindungselement (5'-A, A /T, T, A /T, A, T, A /G-3 ') [26] und ein zuvor beschriebenen Suchalgorithmus [27]. Wir fanden vier mutmaßliche CDX2-Bindungsstellen im 2 Kilobasen (kb) 5'-flankierenden Region des REG4
Gen (Abb. 2A). Diese waren: Standort A (5'-AATAATA-3 ', -1.828--1.834), Seite B (5'-CTTTACAG-3', von -901 bis -908), Seite C (5'-TTTTATGG-3 ', von -114 bis -121), Standort D (5' AATAATA -3 ', von -90 bis -96). Um die Rolle dieser vermutlichen CDX2-Bindungsstellen bei der Regulierung beurteilen REG4
Transkription wurden verschiedene Reportergen-Konstrukten erzeugt. Wie in gezeigt. 2B, Reporterkonstrukte Gen enthält, 2,1, 1,2 oder 0,6 kb der 5'-flankierenden Sequenz aus dem REG4
Gen zeigten eine starke Aktivität in den HSC-39-Zellen, die von starken endogene Expression Anzeige REG4
Transkripte und Protein. Zum Vergleich: MKN-1-Zellen haben wenig endogener REG4
Transkript und angezeigt wenig oder keine Transkriptionsaktivität induziert durch die 2,1, 1,2 oder 0,6 kb REG4
Reportergen-Konstrukten (Daten nicht gezeigt) . Die REG4
Reportergenkonstrukten Basenpaare -116 bis +58 und -87 bis +58 enthält, hatte eine reduzierte Aktivität in den HSC-39-Zellen (Abb. 2B), was darauf hinweist, dass Sequenzen zwischen den Basenpaaren -634 und - 116 eine Schlüsselrolle spielen bei der Aktivierung von REG4
Transkription. Darüber hinaus analysierten wir einzelne und mehrere Mutationen in den vermutlichen CDX2-Bindungsstellen in der 5'-flankierenden Region des REG4
Gen unter Verwendung von HSC-39-Zellen (Fig. 2C). Wie erwartet, vermutliche CDX2-Bindungsstelle C, das zwischen den Basenpaaren -634 und -116, spielt eine entscheidende Rolle bei der Aktivierung von REG4
Transkription befindet.

CDX2 bindet direkt an das 5' -flanking Region von REG4
Gene

um zu analysieren, ob CDX2 bindet direkt an den vermeintlichen CDX2-Bindungsstellen in der REG4
5'-flankierenden Region, wir Chromatinimmunpräzipitation durchgeführt (CHIP) Tests unter Verwendung von HSC-39-Zellen. Unter Verwendung von 6-Primer für die REG4
5'-flankierenden Region (Abb. 3A), wir DNA-Fragmente, die das wiedergewonnene REG4
5'-flankierenden Region von Primer 1, der vermutliche CDX2- umfasst Bindungsstelle C (Abb. 3B). DNA-Fragmente aus dem 5'-flankierenden Region von REG4
, die 2 Primern erzeugt wurden, 3, 4, 5 und 6, so daß sie nicht präsumptive CDX2-Bindungsstellen enthielten, wurden durch den anti- nicht wiederhergestellt CDX2 Antikörper. Die Spezifität der Erholung der REG4
Promotorregion folgenden ChIP mit Anti-CDX2-Antikörper wurde durch die Tatsache gezeigt, dass andere irrelevante DNA-Fragmente fehlen CDX2-Bindungsstellen (zB Exon 3 des CDX1
Gen) wurden nicht wiederhergestellt (Fig. 3B). Darüber hinaus ergab mock Immunpräzipitation (Maus-IgG) wenige REG4 in oder in CDX1
-spezifischen DNA-Fragmente (Abb. 3B). Alle diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass CDX2 aktiviert REG4
Transkription von direkt Bindung an Sequenzen in der 5'-flankierenden Region des Gens.

Trimethylierung von Histone H3 Lysine 27 (H3K27me3) auf der REG4
Zelllinien

Obwohl CDX2 Protein-Expression in MKN-1 und MKN-28 Zelllinien, diese 2-Zelllinien fehlte nachweisbare Expression von REG4
gefunden Transkript und Protein. Denn es wurde berichtet, dass die DNA-Hypermethylierung von CpG-Inseln mit Silencing von mehreren Genen assoziiert ist [28] untersuchen wir, ob die DNA-Methylierung Transkriptions Inaktivierung von Reg IV in MKN-1 und MKN-28-Zellen induziert. Wir behandelten diese Zellen mit einem Demethylierungsmittel, 5-Aza-2'-desoxycytidin (Aza-dC) und dann durchgeführt, qRT-PCR. Die Expression Reg IV nicht in diesen Zelllinien wieder hergestellt wurde (Daten nicht gezeigt), dass die DNA-Methylierung was darauf hindeutet, ist nicht wahrscheinlich, Reg IV Expression zu beeinflussen. Es wurde auch berichtet, dass H3K27me3 wurde mit verdrängter Genexpression in Verbindung gebracht worden [29]. Wir weiter H3K27me3 in GC-Zelllinien untersucht. Zur Bestimmung der Anreicherung von H3K27me3 auf dem REG4
Promotor in den GC-Zelllinien, ChIP Assays wurden durchgeführt. In MKN-1 und MKN-28 Zelllinien, H3K27me3 Ebenen auf die Promotorregion
REG4 waren hoch, während sie in HSC-39-Zelllinie, H3K27me3 Ebene auf die REG4
Promotorregion war niedrig (Fig. 3C). Diese Ergebnisse legen nahe, dass geschlossene Chromatinstruktur von REG4
Promotor kann Reg IV Expression von CDX2 hemmen.

Diskussion

Obwohl es wurde berichtet, dass Reg IV-Expression durch GLI1 induziert wird [21] oder EGF [22], diese Moleküle sind unwahrscheinlich für die Assoziation zwischen Reg IV und Darm-Differenzierung zu erklären. In der vorliegenden Studie haben wir gezeigt, dass endogene CDX2 und Expression Reg IV in GC-Zelllinien gut korreliert. Darüber hinaus eine ER-regulierte Form von CDX2 verwenden, fanden wir, dass es eine schnelle Induktion von Reg IV-Expression nach 4-OHT Behandlung war. Reporter-Gen-Assays zeigten eine wichtige Rolle für die Konsens CDX2 DNA-Bindungselemente in der REG4
Promotorregion in seiner Transkription. Nachfolgende ChIP-Assays zeigten, dass CDX2 bindet direkt an die REG4
Promotor. Wir haben bereits gezeigt, dass in der primären GC Gewebe und intestinale Metaplasie des Magens, CDX2 und Reg IV-Expression wurden gut korreliert [11]. Diese Ergebnisse zeigen, dass CDX2 Protein reguliert Reg IV-Expression in GC und intestinale Metaplasie des Magens.

CDX2 überexprimiert wird in Darm-Phänotyp GC und in intestinale Metaplasie des Magens [9], [25] direkt. Im Gegensatz dazu Verlust von CDX2-Expression wurde in einer Untergruppe von primären kolorektalen Krebsen, in der Regel in schlecht differenzierten Darmkrebs [30] beobachtet. Die Bedeutung der Veränderung von CDX2-Expression in menschlichen Krebsarten, bleibt unklar, und deshalb ist es wichtig, die Zielgene zu definieren, die von CDX2 stromabwärts sind. Wir haben mehrere CDX2-regulierte Gene identifiziert wie CDH17
(die LI-Cadherin kodiert) [24], HEPH
(die kodiert Hephaestin) [31], ABCB1
[32], und DSC2
[33] (die Desmocollin 2 codiert) (die multidrug resistance 1 kodiert). Unter diesen Genen ABCB1
ursprünglich als überexprimierten und amplifizierten Gens in mehreren arzneimittelresistenten Zellen identifiziert wurde, und sein Produkt, P-Glykoprotein scheint eine wichtige Rolle in drug resistance spielt [34]. Zuvor berichteten wir, dass erzwungene Expression von Reg IV in GC-Zellen gehemmt 5-FU-induzierte Apoptose durch Induktion von Bcl-2 und Dihydropyrimidindehydrogenase [8]. Zusammengefasst ist es möglich, daß in intestinalen Phänotyp GC, Ausdruck (oder ektopische Expression) von CDX2 induziert Reg IV und multidrug resistance 1-Expression, was zu einer Erhöhung der Arzneimittelresistenz. In der Tat wurde berichtet, dass die postoperative Chemotherapie für Patienten mit Darm-Phänotyp GC nicht von Vorteil ist [35].

Obwohl unsere Daten die Ansicht unterstützen, dass CDX2 eine Rolle spielt bei der Regulierung der REG4
Transkription über die Bindung mehrere Erkenntnisse an die Promotorregion, zeigen an, dass CDX2 allein zur Aktivierung nicht ausreichend REG4
Ausdruck. In der vorliegenden Studie erzielten wir einen polyklonalen Population von MKN-7, TMK-1, HSC-44PE und KATO-III-Zellen, die ein hohes Maß an CDX2 durch eine Infektion exprimieren mit Retroviren ein voller Länge menschlichen CDX2 cDNA trägt. Doch die Überexpression von CDX2 gescheitert Reg IV Ausdruck aktivieren. In GC Zellinien keiner der Zelllinien mit nicht nachweisbarer CDX2-Protein-Expression hatten nachweisbare REG4
Transkripte und Protein. Daher ist CDX2 erforderlich für die Expression Reg IV, aber CDX2 allein ist nicht ausreichend für die Aktivierung Ausdruck Reg IV. In der vorliegenden Studie wurden neun GC-Zelllinien untersucht. Die Ursprünge der Zelllinien waren wie folgt. Der MKN-7, MKN-28, und MKN-74-Zelllinien wurden von intestinalen Typ GC etabliert. Die TMK-1 und MKN-45-Zelllinien wurden aus diffusen Typ GC etabliert. Die KATO-III, HSC-39 und HSC-44PE-Zelllinien wurden von Siegelringzellkarzinom etabliert. Der MKN-1-Zelllinie wurde von adenosquamöses Zellkarzinom etabliert. Da in intestinale Metaplasie des Magens, CDX2 und Reg IV Ausdruck sind gut korreliert, etablierten GC-Zelllinien aus diffusen Typ GC oder Zellkarzinom Siegelring kann nicht für die Analyse von Reg IV Induktion durch CDX2 geeignet sein. In der Tat kann Reg IV Expression von CDX2 in Zelllinien, abgeleitet von Dickdarmkrebs in der vorliegenden Studie induziert werden. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass H3K27me3 Ebenen auf der REG4
Promotorregion hoch waren in MKN-1 und MKN-28 GC-Zelllinien. Diese 2-Zelllinien fehlte nachweisbare Expression von REG4
obwohl CDX2 Protein-Expression gefunden wurde. Daher versagt H3K27me3 Ebenen auf die REG4
Promotorregion hoch sein kann in MKN-7, TMK-1, HSC-44PE und KATO-III-Zellen, in denen eine Überexpression von CDX2 Reg IV Expression zu aktivieren.

Es wurde berichtet, dass em <> REG4
mRNA-Expression durch Stimulation mit TGF-α, EGF, HGF oder bFGF durch Aktivierung der mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK) -Weg [22] verstärkt wurde . Somit könnte die Hypothese aufgestellt werden, dass Reg IV auch durch nachgeschaltete Transkriptionsfaktoren MAPK Wege reguliert wird. Wir führten in silico
der Analysen REG4
Gen 5'-flankierende Region, und mindestens eine präsumptive AP-1 Konsensus-Sequenzen (bei -883 Basenpaare von REG4 gefunden
Gen 5'-flankierende Region), die eine stromabwärtige Transkriptionsfaktor von MAPK-Signalisierung ist. In der vorliegenden Studie zeigten HSC-39-Zellen ähnliche Transkriptionsaktivität von Reportergen-Konstrukten, die 1,2 kb und 0,6 kb von REG4
5'-flankierenden Sequenz. Da die Wirkung von EGF oder TGF-α auf REG4
Transkription nicht in der vorliegenden Studie wurde untersucht, sind weitere Untersuchungen notwendig, um die Signalmechanismen zu klären, die Regulierung von REG4
Transkription induzieren.

Abschließend zeigen unsere aktuellen Daten, dass CDX2 Protein Reg IV-Expression direkt reguliert. Reg IV aktiviert den EGFR /Akt /AP-1-Signalweg. Als intestinale Phänotyp GC EGFR häufig exprimiert [36], wird vorgeschlagen, dass diese Reg IV-activated Weg eine wichtige Rolle in diesem Subtyp von GC spielt. Da CDX2 induziert auch die Expression des multidrug-Resistenzgen, ABCB1
, anti-EGFR-Therapie aber nicht Chemotherapie für Patienten mit Darm-Phänotyp GC von Vorteil sein.

Materialien und Methoden

Plasmide

die CDX2 cDNA wurde in die Mehrfachklonierungsstelle des retroviralen Expressionsvektor PPGs-CMV-CITE-neo wie zuvor beschrieben eingesetzt [24]. Die in voller Länge, Wildtyp CDX2 cDNA wurde ebenfalls in den retroviralen Vektor pBabe-Puro ER subkloniert, wie zuvor beschrieben pCDX2-ER [24] zu erzeugen. Der pCDX2-ER-Vektor codiert ein chimäres Protein, in dem Volllängen-CDX2 Sequenzen stromaufwärts eines mutierten ER-Liganden-Bindungsdomäne fusioniert sind. Das mutierte ER-Liganden-Bindungsdomäne bindet nicht mehr Östrogen, sondern behält die Fähigkeit Tamoxifen zu binden. Genomische DNA-Sequenzen aus der 5'-flankierenden Region des humanen REG4
Gen wurden mittels PCR unter Verwendung genomischer DNA, gereinigt aus HSC-39-Zellen als Matrize und subkloniert in die pGL4.10 [luc2] Vektor (Promega , Madison, WI). PCR-basierte Ansätze wurden verwendet, um Mutationen in die vermutliche CDX2-Bindungsstellen im pGL4.10-REG4 Reportergenkonstrukt QuikChange gerichtete Mutagenese-Kit (Stratagene, La Jolla, CA) unter Verwendung einzuführen. Vier mutmaßliche CDX2-Bindungsstellen wurden geändert. Alle durch PCR erzeugten Fragmente wurden durch automatisierte Sequenzierung verifiziert. Das Plasmid pGL4.74 [hRluc /TK] Vektor (Promega) wurde als Kontrolle für die Transfektionseffizienz in Reporter-Assays verwendet.

Zelllinien, Retrovirusinfektionen, und medikamentöse Behandlung

Die amphotropen Phoenix Verpackungszelllinie wurde von G. Nolan (Stanford University, Stanford, CA) [37] zur Verfügung gestellt. Neun Zelllinien aus menschlichen GC und 2 Zelllinien aus menschlichen Dickdarmkrebs verwendet. Die TMK-1-Zelllinie wurde in unserem Labor [38] etabliert. Die HSC-39 und HSC-44PE-Zelllinien wurden von einem der Autoren (Kazuyoshi Yanagihara) [39], [40] etabliert. Fünf GC-Zelllinien der MKN-Serie wurden freundlicherweise von Dr. Toshimitsu Suzuki zur Verfügung gestellt [41], [42]. Die KATO-III-Zelllinie wurde von Dr. Morimasa Sekiguchi freundlicherweise zur Verfügung gestellt [43]. Die HT-29 und SW480 Kolon-Krebszelllinien wurden von der American Type Culture Collection erhalten. Die Zellen wurden in flüssigem Stickstoff bis zur Einleitung der Untersuchung gespeichert. Nach dem gefrorenen Lager Auftauen wurden die Zellen bei niedrigen Durchgang während der gesamten Studie gehalten. Konsistente Zellmorphologie wurde durch Vergleich von mikroskopischen Aufnahmen überwacht. Die Verpackungszellen Phoenix wurden mit retroviralen Expressionskonstrukten transfiziert (PPGs-CDX2, PPG-neo und pCDX2-ER) und der Überstand nicht-replizierende amphotropen Virus enthielt, wurde wie zuvor beschrieben geerntet [24]. In HT-29-Zellen die CDX2-ER-Fusionsprotein exprimieren (HT-29 /CDX2-ER) wurde CDX2 Funktion durch Zugabe von 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) (Sigma Chemical, St. Louis, MO) zum Wachstum aktiviert Medium in einer Endkonzentration von 500 nmol. Um zu untersuchen, ob die DNA-Methylierung transkriptionellen Inaktivierung Reg IV induziert wurden die Zellen mit einer Endkonzentration von 1 uM Aza-dC (Sigma Chemical) für 5 Tage behandelt, bevor sie zur RNA-Extraktion geerntet.

Western Blot-Analyse

Für die Western-Blot-Analyse wurden die Zellen wie beschrieben lysiert vorher [44]. Protein-Konzentrationen wurden durch Bradford-Protein-Assay (BioRad, Richmond, CA) mit BSA als Standard verwendet wurde. Die Lysate (20 &mgr; g) wurden in Laemmli-Probenpuffer solubilisiert, durch Sieden und dann auf 12% SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese durch Elektrotransfer auf eine Nitrocellulosefilter gefolgt unterzogen. Der Filter wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit einem Anti-Reg-IV-Antikörper (polyklonale Kaninchen-Antikörper, der in unserem Labor entwickelt Ref. 10) inkubiert oder anti-CDX2-Antikörper (BioGenex, San Ramon, CA). Peroxidase-konjugiertes anti-Kaninchen- oder anti-Maus-IgG wurde in der Folgereaktion eingesetzt. Immunkomplexe wurden mit einem ECL Plus Western Blot Detection System (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) sichtbar gemacht. β-Actin (Sigma Chemical) wurde ebenfalls als Ladekontrolle erkannt.

qRT-PCR-Analyse

Gesamt-RNA wurde mit einem RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) extrahiert und 1 ug gesamt-RNA wurde mit einem First Strand cDNA Synthesis Kit (Amersham Biosciences) in cDNA umgewandelt. Quantifizierung von REG4
mRNA-Spiegel wurde durch Echtzeit-Fluoreszenzdetektion durchgeführt, wie zuvor beschrieben [45]. PCR wurde mit einem SYBR Green PCR Core-Reagenzien Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) durchgeführt. Echtzeit-Erkennung der Emissionsintensität des grünen SYBR gebunden an doppelsträngige DNA wurde mit einem ABI PRISM 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems), wie zuvor beschrieben [46] durchgeführt. ACTB
-spezifische PCR-Produkte wurden aus der gleichen RNA-Proben amplifiziert und diente als interne Kontrolle. Sequenzen von Primern für REG4
qRT-PCR sind in Tabelle 1 gezeigt qRT-PCRs wurden in dreifacher Ausfertigung für jede Probe Primersatz durchgeführt und der Mittelwert und Standardabweichung (SD) der drei Versuche wurde als die berechnete relative Quantifizierung Wert. Am Ende der 40 PCR-Zyklen, Reaktionsprodukte wurden elektrophoretisch auf 8% nicht-denaturierenden Polyacrylamidgelen für visuelle Bestätigung von PCR-Produkten getrennt.

RNAi

Um die endogenen CDX2 Knockdown wurde RNAi durchgeführt . Zwei siRNA-Duplexe Targeting CDX2 (5'-AACCAGGACGAAAGACAAAUA-3 ', CDX2 siRNA1; und 5'-AAGCCUCAGUGUCUGGCUCUG-3', CDX2 siRNA2) und eine nonsilencing siRNA-Duplex (5'-AAUUCUCCGAACGUGUCACGU-3 ') wurden synthetisiert (Qiagen). Die Transfektion wurde durchgeführt unter Verwendung von Lipofectamin RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA) nach dem Protokoll des Herstellers. Kurz gesagt, wurden 60 pmol siRNA und 10 &mgr; l Lipofectamine RNAiMAX in 1 ml RPMI-Medium gemischt (10 nmol /L final siRNA-Konzentration). Nach 20 min Inkubation wurde das Gemisch zu den Zellen zugegeben und diese wurden auf Geschirr für jeden Assay plattiert. Drei Tage nach Transfektion wurden die Zellen für alle Experimente analysiert.

Reportergen-Assays

HSC-39 und MKN-1-Zellen in Platten mit 6 Vertiefungen ausgesät (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ ). Transfektion von Zellen bei 50% -80% Konfluenz wurden mit 3 &mgr; l von FuGENE6 Transfection Reagent (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) durchgeführt, 0,8 ug pGL4.10 Reportergen-Konstrukten und 0,2 ug pGL4.74 [hRluc /TK] vector (Promega). 48 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen in passive Lysepuffer (Promega) gesammelt und resuspendiert. Die Luciferase-Aktivität wurde mit einem Dual-Luciferase-Assay-System (Glomax 96 Platten-Luminometer, Promega) bestimmt.

ChIP Assays

Die ChIP-Assays wurden unter Verwendung des EZ-Chip- Chromatin Immunopräzipitation Kit (Millipore, Billerica ausgeführt , MA) pro Herstellungsanweisungen. Um zu analysieren, ob CDX2 bindet direkt an den vermeintlichen CDX2-Bindungsstellen im REG4
5'-flankierenden Region, führten wir ChIP Assays HSC-39 Zellen. Kurz gesagt, HSC-39-Zellen (1-2 × 10 ^{7) wurden mit 1% Formaldehyd vernetzt in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) für 15 min bei 37 ° C, und wurde Glycin zugesetzt reaktive Aldehyde zu quenchen. Nachdem die Zellen mit kaltem PBS gewaschen, in SDS-Zellen wurden resuspendiert Lysepuffer (1% SDS, 10 mM EDTA und 50 mM Tris pH 8,1) mit Proteinase Inhibitor (Roche Diagnostics). Nachdem die Proben beschallt worden waren, wurden Chromatin-Extrakte, die DNA-Fragmente (mittlere Größe, 500 Basenpaare) immunpräzipitiert unter Verwendung von 2 ug monoklonalen anti-CDX2 Antikörper (BioGenex) oder 2 ug Maus-IgG (Millipore). Jede immunpräzipitiert DNA-Probe wurde quantifiziert durch qPCR-Primer in Tabelle 1 aufgelistet Als Negativkontrolle, ein etwa 200 Basenpaare DNA-Fragment von Exon 3 des CDX1
Gen wurde mittels PCR unter Verwendung spezifischer Primer (Tabelle 1 ).}

, um die Anreicherung von H3K27me3 auf die REG4
Promotor in den GC-Zelllinien, ChIP Assays wurden durchgeführt unter Verwendung von MKN-1, MKN-28, und HSC-39-Zelllinien zu bestimmen. Kurz gesagt, GC-Zellen (1-2 × 10 ^{7) wurden mit 1% Formaldehyd in PBS vernetzt für 15 min bei 37 ° C, und wurde Glycin zugesetzt reaktive Aldehyde zu quenchen. Nachdem die Zellen mit kaltem PBS gewaschen, die Zellen wurden in SDS-Lyse-Puffer mit Proteinase Inhibitor (Roche Diagnostics) resuspendiert. Nachdem die Proben beschallt worden waren, wurden Chromatin Extrakte enthaltende DNA-Fragmente (mittlere Größe, 500 Basenpaare) immunpräzipitiert unter Verwendung von 2 &mgr; g polyklonalen anti-H3K27me3 Antikörper (Abcam, Cambridge, MA) oder 2 &mgr; g Kaninchen-IgG (Millipore). Jede immunpräzipitiert DNA-Probe wurde von qPCR quantifiziert REG4
Primer 1 (Tabelle 1).}

qPCRs wurden in dreifacher Ausfertigung für jede Probe-Primer-Set durchgeführt und der Mittelwert und Standardabweichung (SD) von die drei Experimente wurde als relative Bestimmungswert berechnet. Am Ende der 40 PCR-Zyklen, Reaktionsprodukte wurden elektrophoretisch auf 8% nicht-denaturierenden Polyacrylamidgelen für visuelle Bestätigung von PCR-Produkten getrennt.

Acknowledgments

Wir danken Herrn Shinichi Norimura für hervorragende technische Unterstützung und Beratung. Diese Arbeit wurde mit der Art der Zusammenarbeit des Forschungszentrums für Molekulare Medizin, Medizinische Fakultät, Universität Hiroshima durchgeführt. Wir danken dem Analysis Center der Life Science, Hiroshima University, für die Nutzung ihrer Einrichtungen.

• PLoS ONE: RhoC Regelt die Proliferation von Magenkrebszellen durch die Interaktion mit IQGAP1
• PLoS ONE: Differential Expression von Phospholipase C Epsilon 1 ist im Zusammenhang mit chronischer atrophischer Gastritis und Magenkrebs