PLoS One: Több-to-Multiple közötti kapcsolatok mikroRNS és célgének Gyomor Cancer

absztrakt katalógusa

A mikroRNS (miRNS) jár transzkripciós szabályozó és sarkalatos szerepet játszanak a kialakulásában. Szerint a miRNS céladatbázisokat egy miRNS szabályozhatják számos gént, mint a célok, míg az egyik gén célzott sok miRNS. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a kapcsolatok között miRNS és céljaikat nem lehet egy-egy. Azonban sok jelentések leírtak csak egy-az-egy, egy-több alkalommal vagy többszörös-egy közötti kapcsolat miRNS és a megcélzott gén a humán rákok. Így azt kell meghatározni, hogy egy kombinációja egyes miRNS szabályozza több cél és be kell vonni kialakulásában. Találni néhány csoportja miRNS amelyek szinergikusan szabályozzák célokat humán gyomorrák (GC), akkor újra elemezni a korábbi miRNS expressziós array adatokat, és megállapította, hogy a 50 miRNS volt akár szabályozott kezelés 5-aza-2'-dezoxicitidin egy GC sejtvonalban. A "TargetScan" miRNS céladatbázishoz jósolta, hogy ezek közül néhány miRNS közös cél géneket. Azt is utalt a GEO adatbázis kifejezés e közös cél gének az emberi GC, amely összefüggésben lehet a gyomor kialakulásában. Ebben a vizsgálatban elemeztük két miRNS kombinációja, miR-224 és -452 és miR-181c és -340. Túlzott expressziója mindkét miRNS kombináció drámai leszabályozott a megcélzott gének, DPYSL2 katalógusa és KRAS katalógusa, és KRAS katalógusa és MeCP2 katalógusa, ill. Ezek a miRNS kombinációk szinergista csökkent sejtproliferációt transzfekciója. Továbbá, kiderült, hogy ezek miRNS voltak leszabályozott keresztül promoter hipermetiláció GC sejtekben. Így valószínű, hogy a kapcsolatok között miRNS és a célok nem egy-egy, hanem több-to-multiple GC, és hogy ezek a bonyolult összefüggések lehet kapcsolatos gyomor kialakulásában. Katalógusa

Citation: Hashimoto Y, Akiyama Y, Y Yuasa (2013) Multiple-to-Multiple közötti kapcsolatok mikroRNS és célgénjeit gyomorrákban. PLoS ONE 8 (5): e62589. doi: 10,1371 /journal.pone.0062589 katalógusa

Szerkesztő: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japán katalógusa

Beérkezett: december 14, 2012; Elfogadva: március 24, 2013; Megjelent: május 8, 2013 katalógusa

Copyright: © 2013 Hashimoto et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: Ez a munka részben támogatta támogatásokból A3 Foresight Program a Japán Társaság a Promotion of Science (JSP) (YY), és ösztöndíjak a JSPS Fiatal tudósok (YH). A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

a mikroRNS (miRNS-ek), egy osztály a kis nem-fehérje-kódoló RNS-ek, azonosították, mint egy új típusú gén szabályozó, amelyek kötődnek a 3'-nem transzlatált régiók (UTRs) a cél-mRNS, miáltal mRNS lebomlás vagy a blokád mRNS transzlációs [1]. Általánosan ismert, hogy a miRNS elváltozások társított tumorigenezis [1]. Szerint a miRNS céladatbázisokat egy miRNS szabályozhatják számos gént, mint a célok, míg az egyik gén célzott sok miRNS. Azonban számos tanulmány kimutatta, egy-az-egy közötti kapcsolat miRNS és annak megcélzott gént. Azt is leírták, hogy a többszörös vagy egy fürt miRNS co-működőképesen szabályozzák egy gén, amely kapcsolódik a karcinogenezis [2] - [4]. Másrészt, többszörös gének által megcélzott egy miRNS [3], [4]. Még több-a-több kapcsolatok között miRNS és célok számoltak segítségével számítógépes elemzések [5], [6]. Ugyanakkor ott már csak néhány papír kísérletileg érvényesítése többszöri to-több kapcsolatok a rákos sejtekben. Katalógusa

A gyomorrák a negyedik leggyakoribb rosszindulatú humán betegségek és a második leggyakoribb oka a rák okozta halál világszerte, a becslések szerint egymillió új esetet diagnosztizálnak évente [7]. Gyomor rák hisztológiailag sorolni két fő típusa, a bél és a diffúz típusú [8]. Diffúz típusú GC gyakran megoldhatatlan és mutat egy szegény beteg prognózisa. Nemrégiben bemutattuk, hogy a veszteség a Cdh1 és Trp53 funkciók indukál diffúz típusú GC segítségével egérmodellben [9]. Bár ez a megállapítás segít nekünk, hogy új emberi gyomorrák terápiák, további vizsgálatok a molekuláris mechanizmusok mögöttes gyomor carcinogenesis szükséges, hogy dolgozzon más megközelítések célzott terápia. Katalógusa

Promoter CpG sziget hiperme az egyik leggyakoribb mechanizmusok amellyel tumor szuppresszor gének inaktiválják a humán rákok [10]. Nemrégiben nyilvánvalóvá vált, hogy egyes miRNS is célpontjai epigenetikus hangtompító a rák [11]. A mi és más csoportok Korábban kimutattuk, hogy gyógyszeres vagy genetikai zavar a DNS-metiláció a rákos sejtvonalakon indukál up-regulációját jelentős számú miRNS [12] - [15]. Ezek az adatok vezettek jelöltek azonosítását tumor-elnyomó miRNS akinek hangtompító jár CpG-sziget metiláció. Eddig metilezése miR-124 család tagjai már azonosították a colorectalis rák és a daganatok más szervek [11]. Ezen túlmenően, a miR-34b /C klaszter egy tipikus CpG-sziget, és lefelé szabályozott gyakori metiláció a kolorektális és gyomor rák [12]. Hasonlóképpen, azt találtuk, hogy a miR-181c metiláció társul gyomor karcinogenezis keresztül szabályozása onkogén gének KRAS katalógusa és NOTCH4 katalógusa [13]. Leszabályozza sok miRNS keresztül metiláció egyszerre jelentkezik a rákos sejtekben, és fokozhatja a többszörös to-több kapcsolatok között miRNS és célokat. Katalógusa

Ebben a vizsgálatban, hogy érvényesítse a többszöri to-több kapcsolatok között miRNS és célok a rákos sejtekben, azt bizonyította, hogy két pár több miRNS, a miR-224 és -452 és miR-181c és -340 volt, több célpont gének és ezzel együtt csökkent sejtburjánzás szabályozása útján a céljaikat humán GC sejtekben. katalógusa

Eredmények katalógusa

50 miRNS arra up-szabályozva GC sejtvonal, KATO-III, miután 5-aza-2'-dezoxicitidin kezelés katalógusa

a jelöltek azonosítása miRNS hogy szinergikusan befolyásolja a target gének újraindítottuk elemeztük korábbi microarray adatok (GEO hozzáférési száma GSE16006) [13]. Úgy gondoltuk, hogy a miRNS szintek felülszabályozott az 5-aza-2'-dezoxicitidin (5-aza-CDR) kezelés, amikor a nettó intenzitás bizonyos 3 foltok voltak, több mint 1,5-szeres. Továbbá, azt is kiválasztott miRNS amelynek az átlagok azt találtuk, hogy fokozott több mint 3-szoros a microarray. Ennek alapján ezek az új kritériumokat, azt találtuk, hogy az 50 miRNS voltak akár szabályozott egy GC sejtvonal, KATO-III (táblázat S1). Mi megerősítette a up-regulációját 5 6 reprezentatív prekurzor miRNS, hogy van, miR-145, -148a, -152, -224 és -340, miután az 5-aza-CdR kezelés RT-PCR (1a ábra).

TargetScan előrejelzett közös célgénjeit a jelölt miRNS katalógusa

e, vagy sem epigenetikusan szabályozott miRNS közös célgénjeit kerestük a TargetScan adatbázis (5.1 verzió) a közös célokat. Szerint TargetScan 50 miRNS sorolható 46 alapján csoportokba vetőmag szekvenciákat. TargetScan azt is kimutatta, hogy ezek a 46 csoport lehet cél 6460 géneket. Ezek közül célgénjeit kiválasztottunk 13, amely kifejezés a jelentések szerint nőtt GC a GEO-adatbázisban (GEO hozzáférési száma GSE2685), vagy, hogy kapcsolatban áll a gyomor karcinogenezis (táblázat S2). Itt elsősorban a négy miRNS, a miR-152, -181c, -224 és -340, mert már beszámolt arról, hogy a miR-181c van epigenetikusan lefelé szabályozni a GC [13] és a CpG szigeteken található az upstream régiójában három másik miRNS (2A ábra és C, valamint ábra S1). 2a ábra is mutatja, hogy a miR-452 fürtözött a miR-224. TargetScan azt jósolta, hogy az öt miRNS képes szabályozni a közös célokat. Például, DPYSL2 katalógusa (dihidropirimidináz-szerű 2, más néven összeomló választ közvetítő protein 2, CRMP2 katalógusa) célozza meg a miR-224, -452, és -181c, KRAS
által miR-224, -452, -181c, -340 és -152, és MeCP2 katalógusa (metil CpG-kötő fehérje 2) által miR-181c és -340 volt (3. ábra).

Expression miR-224, -452, -152 és -340 Csökkent DNS hipermetilációja GC sejtvonalak

Megvizsgáltuk bevonásával epigenetikai változások leszabályozza a miRNS-ek. A kifejezés a miR-224, -340 és -152 növelte 5-aza-CdR kezelés számos GC sejtvonalban (1B ábra). Mi mennyiségileg elemeztük érett miR-224 expresszió 9 GC sejtvonalak, és egy colorectalis rák (CRC) sejtvonal. Nem expressziójának miR-224 volt kimutatható 7 10 rákos sejtvonalat (1C). Azt is elemeztük a kifejezés változás a miR-224 /-452 klaszter Kato-III-kezelt sejtek alacsony dózisú 5-aza-CdR (0,2 umol /l), egy hiszton dezacetiláz inhibitor, Trichostatin A (TSA, 0,3 umol /l), vagy ezek kombinációja két gyógyszer. KATO-III sejtek alacsony dózisú 5-aza-CdR kezelés mutatott fel-szabályozása miR-224 /-452 klaszter, míg a TSA önmagában nem okoz up-szabályozás. A miR-224 /-452 klaszter szinergikusan up-szabályozott KATO-III sejtek kombinált 5-aza-CdR és TSA kezelés (1D). Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a miR-224 és miR-452 lehet alulszabályozott keresztül DNS metiláció GC sejtvonalak, mint az ugyanolyan transzkripciós egység.

Leírták, hogy intronikus miRNS szabályozza keresztül promoter metiláció a befogadó gének [14], [15]. Az eredmények szerint a számítógépes elemzés, a miR-224 /-452 klaszter és a miR-340 található intron 6 GÁBRE katalógusa és intron-2 RNF130 katalógusa, illetve mindkettő tartalmaznak sűrű CpG-szigetek csak a promoter régiókat a fogadó gének (2A ábra és C). Megvizsgáltuk a kapcsolatát az expressziós szintek ezen miRNS-ek és a metilációs állapotát a fogadó gének GC sejtvonalak által MSP elemzés. GC sejtvonalak nélkül miR-224 expressziója mutatott csak metilációs jeleket, míg kifejezés pozitív sejtvonalban erős unmethylation minták (2B). Hasonló összefüggést mutattak ki a miR-340 GC sejtvonalak (2D ábra). Ezek az adatok azt mutatják, hogy az expresszió ilyen miRNS GC sejtvonalak hallgattatni a promoter metiláció a befogadó géneket. Katalógusa

epigenetikusan Szabályozott miRNS lehetnek kapcsolatban GC sejt proliferáció katalógusa

Annak meghatározására, hogy epigenetikusan szabályozott miRNS vannak tumor-elnyomó, vagy nem, értékeltük a hatást az 5-aza-CDR siDICER1 transzfektált KATO-III és DICER1 KO HCT116 (D1KO) sejtek (4a ábra). A kezeletlen KATO-III és a szülői HCT116 sejtek mutattak lassuló proliferációt kezelés után az 5-aza CDR. Másrészt, a siDICER1 transzfektált KATO-III és D1KO sejtek, a hatás az 5-aza-CdR kezelés sejtproliferációra vált gyenge mindkét esetben. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a hatás az 5-aza-CdR csökkent az alacsony vagy nulla DICER1 sejtek, és hogy epigenetikusan szabályozott miRNS játszanak fontos szerepet a GC és a CRC-sejtekben.

Annak érdekében, hogy elemezze a kapcsolat ezek között miRNS-ek és 13 célgének táblázatban látható S2, mi transzfektált KATO-III sejtek siDICER1 és /vagy a kezelt 5-aza CDR. Bár kifejezése 3 ( DPYSL2 katalógusa, KRAS katalógusa és MeCP2 katalógusa) a 13 gén csökkent, miután az 5-aza-CdR kezelés, a kifejezés ezen gének tette nem változik az 5-aza-CdR kezelés követ transzfekciójával siDICER1 (4b ábra).

Kombinációs transzfekciója miR-224 és -452 Elfojtott GC Cell Proliferation

transzfektált GC sejtvonalak miR-224 és /vagy -452 utánozza képviselőjeként miRNS fürtök, vagy a negatív kontroll, majd végzett vízben oldani tetrazolium-8 (WST-8) vizsgálatokban. Hetvenkét órával a transzfekció után azt tapasztaltuk, hogy a méhen kívüli kifejezése miR-224 vagy -452 elnyomja a növekedés két sejtvonal KATO-III és AGS (5A ábra). Nevezetesen, kombinációs transzfekciója miR-224 és -452 utánozza alaposan csökkent a növekedés a két GC sejtvonal (5A ábra). Katalógusa

A miR-224 /-452 Cluster Co-operatívan csökkent expressziója DPYSL2 katalógusa és KRAS Matton

Annak vizsgálatára, hogy vagy nem miR-224 /-452 klaszter valóban kapcsolódik a rendelet a DPYSL2 katalógusa és KRAS katalógusa, elemeztük a kifejeződése DPYSL2 katalógusa transzfekciója után KATO-III és AGS sejteket a miR-224 /-452 klaszter egyedül vagy együtt. Mi végzett RT-PCR és Western-blot-analízissel. A DPYSL2 katalógusa és KRAS katalógusa mRNS szintek csökkentek transzfekció után a miR-224 vagy a miR-452 utánozzák (5B). Érdekes, hogy az esetben, ha a kombinációs transzfekciót miR-224 és -452, expresszióját ezek célgének tovább alulszabályozott (5B, ábra). A down-regulációja DPYSL2 is megfigyelhető volt, a fehérje szinten a két sejtvonal (5C). Vizsgáltuk azt is, expressziós szintjét a többi öt gén, MeCP2, MYC, JunB MUC1 katalógusa és SETDB1 katalógusa, amely nem jelenik meg a célokat miR-224 vagy -452 által TargetScan. Ahogy az várható volt, nem expressziójának változásait az öt gént találtunk Kato III sejtek transzfekció után miR-224 vagy -452 (ábra S2). Ezek az adatok arra utalnak, hogy a miR-224 és -452 kifejezetten leszabályozott DPYSL2 katalógusa és KRAS katalógusa.

DPYSL2 katalógusa járt GC sejt proliferáció

hatását vizsgálták kiütése DPYSL2 katalógusa, amelyről kimutatták, hogy a cél a miR-224 /-452 klaszter, a sejtburjánzást. A transzfekciója DPYSL2 katalógusa siRNS egyértelműen csökkent szintje a DPYSL2 katalógusa átiratok (5D ábra), és gátolta a AGS és KATO-III sejtek 72 óra után a kiütése DPYSL2 katalógusa (5E ábra), jelezve, hogy DPYSL2 van onkogén aktivitását. katalógusa

Kombinációs transzfekciója a miR-340 és -181c Elfojtott GC sejtburjánzást, és az indukált down-regulációja KRAS katalógusa és MeCP2 katalógusa Expression katalógusa

a második példa a több-a-több kapcsolatok között mikroRNS és célgénjeit, elemeztük a kapcsolatát miR-340 /-181c és KRAS /MeCP2 .
Amikor miR-340 és miR-181c-t transzfektáltunk KATO-III sejtek proliferációs szinergikusan alulszabályozott két miRNS (6a ábra). Annak eldöntésére, hogy epigenetikusan szabályozott miR-340 és miR-181c együttműködésével készült befolyásolja a célok, elemeztük a mRNS-szintje KRAS katalógusa és MeCP2. Katalógusa On RT-PCR analízis KRAS katalógusa és MeCP2 katalógusa úgy találták, hogy lefelé szabályozni a miR-340 és miR-181c egyedül, vagy összetett transzfekció KATO-III sejtek (6B). Ami a négy gén, MYC, JunB, MUC1
és a SETDB1 katalógusa, nem mutatja megjósolt helyek e két miRNS által TargetScan, az expressziós szintek nem változtak ebben a vizsgálatban. A reprezentatív adatokat az ábrán látható a 6B. Így a hatás a miR-340 és -181c specifikus lehet a közös cél gének, valamint a miR-224 és -452. Katalógusa

Expression és metilációs állapota a miR-224 és -340 Elsődleges GC esetek

Megvizsgáltuk a metilációs állapotát miR-224 és -340 elsődleges GC esetekben. Denaturált minták miR-224 detektáltunk 15 26 (57,7%) primer GC szövetekben (7a ábra és 1. táblázat). Páros nem rákos gyomor nyálkahártyája alig mutatott metilációs mintázatát a miR-224. Következő, mennyiségileg vizsgáltuk miR-224 szintje elsődleges GC szövetekben és a megfelelő nem rákos nyálkahártyák TaqMan RT-PCR-rel. A jelentős csökkenés a miR-224 expresszió GC szövetekben volt megfigyelhető metiláció-pozitív rákos esetek összehasonlítva a metiláció-negatívak és nem rákos gyomor nyálkahártyája (ábra 7C). Katalógusa

tovább elemezzük a DPYSL2
mRNS szinteket, összehasonlítva a metilációs állapotát miR-224 GC szövetekben: GC a miR-224 metiláció (Ca miR-224 Mt), GC-k a miR-224 unmethylation (Ca miR-224 Un), és a nem -cancerous szövetek unmethylation (N miR-224 Un). A DPYSL2 katalógusa mRNS szint a "Ca miR-224 Mt" csoportban szignifikánsan magasabb volt, mint az "N miR-224 Un" és a "Ca miR-224 Un" csoport, p = 0,049 és p = 0,035, illetve (ábra 7D). Így van összefüggés a metilációs állapotát miR-224 és DPYSL2 katalógusa kifejezést GC szövetekben. Katalógusa

A miR-340 metiláció frekvencia viszonylag alacsony volt az elsődleges GC vizsgált szövetekben (4 26, 15,4%) (7B ábra és 1. táblázat), mivel egyik 26 párosított nem rákos gyomor nyálkahártyája mutatott látszólagos metilációs minták miR-340. Ami a miR-152 metilációs elemzés, igyekeztünk három primer készlet tervezték az upstream régiójában miR-152 tartalmú CpG-szigetek (ábra S1), de egyikük sem teljesen kiegyenlített miR-152 expresszió MSP elemzések (nem közölt adatok).

Discussion

Habár beszámoltak arról, hogy a kifejezés a bizonyos miRNS-ek csökkent több rákos megbetegedések DNS metiláció, a legtöbb leírt jelentések, hogy a kapcsolat aberráns expresszióját miRNS-ek és a célpontja gének egy-egy, egy-több alkalommal vagy többszörös-az-egyhez. Ahhoz, hogy vizsgálja meg annak lehetőségét, többszöri to-több kapcsolatok között miRNS és célok a rákos sejtekben, arra koncentráltunk, két kombinációi miRNS GC sejtekben a miR-224 /-452 klaszter és a miR-181c és -340, ebben a vizsgálatban . Azt találtuk, hogy a két miRNS, a miR-224 és -452 és miR-181c és -340 volt, több célpont gének, DPYSL2 katalógusa és KRAS katalógusa, és KRAS
és MeCP2 katalógusa, illetve, és szinergikusan csökkent sejtburjánzást humán GC sejtvonalak. Figyelemre méltó, hogy egy onkogén, KRAS katalógusa [16], azt találtuk, hogy a célzott négy miRNS, bár jelölt kötőhelyek a négy miRNS-ek eltérnek a 3'-UTR KRAS
(TargetScan). Korábban már beszámoltunk, hogy a miR-181c leszabályozott NOTCH4 katalógusa is [13]. Ily módon a több-a-több kapcsolatok között miRNS és a célokat jelzett nemcsak adatbázisban elemzi, hanem a transzfekciós kísérletek, amelyek emberi sejtekben. Katalógusa

miR-224- és /vagy -340-expresszió negatív GC sejtvonalak kiállított hipermetiláltsági jelek MSP elemzés és a kifejezés a miR-224 és -340 helyreáll demetilációs kezelés alkalmazásával. Továbbá hipermetiláció miR-224 és -340 gyakrabban figyeltek elsődleges GC, mint a megfelelő jóindulatú nyálkahártyák. Ebben a miR-224 metiláció-pozitív esetek, kifejezése miR-224 szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a metiláció-negatívak. Ezek az adatok erősen arra utalnak, hogy az aberráns DNS metiláció az egyik kulcs mechanizmusok mögöttes down-regulációja miR-224 és -340 a GC sejtekben.

Kimutattuk, hogy gátolja a miRNS feldolgozás siDICER1 transzfekcióval vagy használ DICER1 knockout sejtek csökkentette a hatást az 5-aza-a CDR, azaz csökkent sejt proliferációt és down-regulációja célgének, GC és a CRC sejtek. Leírták, hogy a bőséges DICER1, az enzim, amely katalizálja az utolsó lépés miRNS érés, közvetlenül összefügg a tumor progresszióját [17]. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy kóros szabályozása miRNS érés hozzájárul GC és CRC kialakulását. Katalógusa

Azt találtuk, hogy a miR-224 /-452 klaszter abnormálisan lefelé szabályozni a GC keresztül hipermetiláltsági. Namika miR-224 is beszámoltak más daganatok. Expression miR-224, let-7f és miR-516a csökken, petefészekrák, és szinergikusan expressziójának szabályozása kallikrein kapcsolatos peptidáz 10 (KLK10) [18]. miR-224 lefelé szabályozni a metotrexát-rezisztens CRC sejtvonalak képest érzékeny sejtekben [19]. Itt is kiderült, hogy a metilációs állapotát miR-224 korrelált DPYSL2 katalógusa szinten az emberi GC. Mindent összevetve, a miR-224 fontos szerepet játszik, mint egy tumor-szuppresszív miRNS GC valamint számos más daganatok. Ezzel szemben, a miR-224 up-szabályozott hepatocelluláris karcinómákban [20] és a tumora [21] összehasonlítva a normál szövetekben. Így további vizsgálatok szükségesek, hogy tisztázza a miR-224 kialakulásában. Katalógusa

Megvizsgáltuk a közös célok epigenetikusan leszabályozott miRNS. DPYSL2 katalógusa kimutatták, hogy lefelé szabályozni a miR-224 és -452. DPYSL2 fontos szerepet játszik a létesítmény a neuronális polaritás [22]. DPYSL2 is részt vesz a pályák, amelyek szabályozzák a proliferációját nem-neuronális sejtek révén foszforiláció szabályozó fehérjék. DPYSL2 megy keresztül dinamikus foszforiláció változására reagálva kontakt gátlás által indukált nyugalmi állapotának és hiperfoszforilálását DPYSL2 előfordul egy tumor [22]. Bár a szerepe DPYSL2 a GC-k nem világos, a mi siRNS-alapú kiütése DPYSL2 expresszió indukált csökkenését proliferáció a két GC sejtvonal, ami arra utal onkogén aktivitását DPYSL2.

Összefoglalva, eredményeink azt mutatják, hogy több-to-több kapcsolatok között miRNS és a cél gének valóban léteznek GC. Valószínű, hogy az aberráns metiláció csökkenti expressziójának többszörös tumor-szuppresszív miRNS, mint például a miR-224, -452, -340 és -181c, amely azután indukálni túlzott expressziójának többszörös onkogén gének, mint például a KRAS katalógusa DPYSL2 katalógusa, és MeCP2 katalógusa. Ezek a kóros többszöri to-több kapcsolatok között miRNS és célok lenne az egyik legfontosabb alapját képező mechanizmusok gyomor kialakulásában. Ezért, nagyon lehetséges, hogy epigenetikai gyógyszerek normalizálják a kifejezés nem csak a tumor-szuppresszív gének, hanem többszörös tumor-szuppresszív miRNS-ek, így csökken a kóros többszörös-To-többszörös közötti kapcsolatok miRNS-ek és célokat, és így válhat kiváló terápiás gyógyszerek a rák ellen. katalógusa

anyagok és módszerek katalógusa

etikai nyilatkozat katalógusa

írásos beleegyező nyilatkozatot kaptunk valamennyi tantárgy, és az etikai bizottság, a tokiói Orvosi és Fogorvosi Egyetem Gyógyszer jóváhagyott kutatás. katalógusa

sejtvonalak és szövetminták

Azt vizsgálták 9 GC sejtvonalak (KATO-III, MKN45, AGS, MKN74, TGBC11TKB, HSC59, HSC43, HSC58 és GCIY) 2 CRC sejtvonalak (HCT116 és DICER1
knock out HCT116 [23]), és 26 primer GC esetben. MKN45, MKN74, TGBC11TKB és GCIY vásároltunk a RIKEN sejtbank és KATO-III és AGS voltak ATCC (American Type Cell Collection). HSC59, HSC43 és HSC58 kaptuk Dr. Kazuyoshi Yanagihara [24], [25]. KATO III, MKN45, MKN74, HSC59, HSC43 és HSC58 RPMI 1640, és AGS, TGBC11TKB, GCIY és a két CRC sejtvonalak Dulbecco-féle módosított Eagle-tápközegben, minimál esszenciális tápközegben, vagy McCoy 5A, kiegészítve 10% magzati borjú szérum. Műtétileg eltávolított mintákat 26 primer GC betegeket véletlenszerűen kapott Kapcsolt Kórház School of Medicine, Tokiói Orvosi és Fogorvosi Egyetem. Katalógusa

In silico analízis katalógusa

utalt a GEO adatbázis miRNS és génexpressziós profilokat (GEO csatlakozás No. GSE16006 és GSE2685). Azt is használják miRNS céladatbázishoz "TargetScan". Katalógusa

A gyógyszeres kezelés a sejtek és az RNS extrakció katalógusa

demetilációval vizsgálatok sejteket naponta kezeltük 5 mol /l 5-aza-CdR (Sigma Aldrich, St. Louis, MO), 72 órán át. Mi is kezelt sejtek 0,3 | imol /l TSA egyedül, és a kombinált 0,2 umol /l-5-aza-CDR TSA. Teljes RNS-t izoláltunk Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA), vagy egy miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Németország).

kvantitatív, valós idejű reverz transzkripciós polimeráz-láncreakció

Valós idejű reverz transzkripciós polimeráz-láncreakció (RT-PCR) analízis alkalmazásával végeztük egy StepOne Real-time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA), EagleTaq master Mix a ROX (Roche, Mannheim, Németország), egy TaqMan Reverse Transcription kit (Applied Biosystems), és TaqMan miRNS assay (Applied Biosystems) szerint a gyártó utasításainak megfelelően. Az expressziós szintek miRNS alapján számítottuk a mennyisége cél miRNS viszonyított RNU6B kontrollként normalizálni a kezdeti bemenő teljes RNS.

metiiációs elemzésre

biszulfit-kezeiés DNS-t végzett Methylamp (Epigentek, Brooklyn, NY). Metiiációspeeifikus polimeráz láncreakció (MSP) elemzéseket végeztünk a korábban leírtak szerint [26]. A primer szekvenciák és a PCR-termék mérete táblázat S3.

Szintetikus miRNS Transzfekció

KATO-III és AGS sejteket transzfektáltunk egy prekurzor molekula utánzó miR-224, -452, -340 vagy -181c, vagy kódolt szekvencia miRNS (Sigma), és így a végső koncentráció 25-50 nmol /l segítségével egy elektroporációs, neon (Invitrogen), a gyártó utasításai szerint. A 24-72 órával a transzfekció után a sejteket összegyűjtjük, az RT-PCR-rel, vagy Western blot analízissel.

Cell Proliferation Assay

miR-utánzó-transzfektált KATO-III és AGS sejteket szélesztettünk 1 × 10 ^{3 vagy 1 × 10 4 sejt per lyuk a 96 lyukú lemezeken. A sejtproliferációt napon értékeltük 1-4 transzfekció után meghatározzuk a sejtek számát sejt proliferáció reagens WST-8 (Dojindo Molecular Technologies, Inc., Mashikimachi, Japán), a gyártó utasításai szerint.}

miRNS cél Jóslás és Western-blot katalógusa

Az előre jelzett célok miRNS és célzott helyekkel elemeztük TargetScan. Az mRNS expressziós szintek a megjósolt célok tranziensen transzfektált sejteket elemezzük 24 órával a transzfekció után RT-PCR-rel. Western-blot-analízissel végeztük a korábban leírtak szerint [26]. Az elsődleges antitestet használtunk nyúl anti-DPYSL2 (1:500;Ϋ3, Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Mi használt egér anti-α-tubulin (1:1000; SC-8085, Santa Cruz Biotechnology), mint belső kontroll Western blot. A másodlagos antitestek a következők voltak alkalikus foszfatázzal konjugált anti-nyúl IgG-vel és anti-egér IgG-t (1:2000; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Blotokat ImmunoStar AP Hordozó (Bio-Rad Laboratories). Katalógusa

alátámasztó információk katalógusa ábra S1.
sematikus ábrázolása a COPZ2 katalógusa régiót tartalmazó miR-152. Kitöltött négyzetek képviselik a exonjain COPZ2 katalógusa A és egy üres doboz jelöli a transzlálódó régió COPZ2 katalógusa. A hajlított nyíl jelzi a transzkripciós starthely a COPZ2 katalógusa. A függőleges nyíl jelzi a helyét a miR-152. Függőleges vonalak jelzik CpG helyek. Nyílhegyek jelzik vizsgált régiókban az MSP. Katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0062589.s001 katalógusa (TIFF) hotelben ábra S2.
hatásai transzfekciója miR-224 és -452 a KATO-III sejtek. RT-PCR-elemzéseket transzfekció után miR-224 és /vagy a -452. A célgének expresszióját analizáltuk 48h később RT-PCR-rel. miR-224 és -452 kifejezetten leszabályozott DPYSL2 katalógusa és KRAS katalógusa, de nem a többi öt gén vizsgált, amelyek összhangban állnak az eredmények adatbázis-elemzés (3. ábra). katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0062589.s002 katalógusa (TIFF) hotelben táblázat S1.
Expression profilalkotás emberi miRNS Kato-III sejtek után 5-aza-CdR kezelés. katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0062589.s003 katalógusa (XLSX-) hotelben táblázat S2.
listája célgének amelynek expresszióját vizsgáltuk RT-PCR a kezelés után, vagy anélkül 5-aza-CDR és transzfekció 20 nmol /L siDICER1 vagy kódolt siRNS.
doi: 10,1371 /journal.pone .0062589.s004 katalógusa (XLSX-) hotelben táblázat S3.
szekvenciák használt primerek ebben a vizsgálatban. katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0062589.s005 katalógusa (XLSX-) hotelben

Köszönetnyilvánítás katalógusa

Szeretnénk megköszönni Dr. Bert Vogelstein biztosításáért DICER1 knock-out HCT116 sejtvonalban. katalógusa

• PLoS One: hipoxia Serkenti az EMT gyomorrák sejtek révén Autokrin TGF-jelzés
• PLoS One: Flotillin2 Expression korrelál HER2 szintek és rossz prognózissal gyomorrákban