PLoS ONE: više-na-više veza između mikroRNA i ciljnih gena u želučanom Cancer

Sažetak pregled

mikroRNA (miRNAs) djeluju kao transkripcije regulatori i imaju ključne uloge u karcinogeneze. Prema Mirna ciljne baze podataka, jedan Mirna mogu regulirati mnoge gene kao svoje ciljeve, a jedan gen može biti na meti mnogih miRNAs. Ovi rezultati pokazuju da su odnosi između miRNAs i njihovih ciljeva ne može biti jedan-na-jedan. Međutim, brojni izvještaji samo opisao jedan-na-jedan, jedan-na-više ili multiple-na-jedan odnos između Mirne i njene ciljnog gena u ljudskim karcinoma. Dakle, potrebno je utvrditi da li ili ne kombinacija nekih miRNAs će regulirati više ciljeva i biti uključeni u karcinogeneze. Da biste pronašli neke skupine miRNAs koje mogu sinergijski reguliraju svoje ciljeve u ljudskoj raka želuca (GC), ponovno smo analizirali prethodni Mirna izraz array podatke i utvrdio da 50 miRNAs su povećana na tretmanu s 5-aza-2'-deoksicitidina u GC stanicama. U "TargetScan" Mirna meta podataka predvidio da su neki od tih miRNAs imaju zajedničke ciljnih gena. Također, osvrnuo na GEO baze podataka za iskazivanje tih zajedničkih ciljnih gena u ljudskoj GCS, koje bi mogle biti u vezi s želučanim karcinogeneze. U ovoj studiji analizirali smo dva Mirna kombinacije, Mir-224 i -452, i Mir-181C i -340. Prekomjerna ekspresija obje Mirna kombinacija dramatično dolje regulira svoje ciljne gene, DPYSL2 pregled i KRAS pregled i KRAS pregled i MeCP2 pregled, respektivno. Ove Mirna kombinacije sinergijski smanjio proliferaciju stanica nakon ubacivanja. Nadalje, otkrili smo da su ti miRNAs podregulirani preko promotora Hipermetilacija u GC stanicama. Dakle, vrlo je vjerojatno da su odnosi između miRNAs i njihove mete ne jedan-na-jedan, ali više-na-više u GCS, te da ti složeni odnosi mogu biti povezane s želučanim karcinogeneze

Izvor:. Hashimoto Y, Akiyama Y, Yuasa Y (2013.) Više za višestruke odnose između mikroRNA i ciljnih gena u rak želuca. PLoS ONE 8 (5): e62589. doi: 10,1371 /journal.pone.0062589 pregled

Urednik: Hiromu Suzuki, Sapporo Medicinski fakultet, Japan pregled

Primljeno: 14. prosinca 2012. godine; Prihvaćeno: 24 ožujka 2013; Objavljeno: 8. svibnja 2013 pregled

Copyright: © 2013 Hashimoto et al. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Ovo djelo je podržan u sklopu koje potpore iz A3 dalekovidnosti programu Japanske društva za promicanje znanosti (JSPS) (YY) i istraživačke stipendije u JSPS za mlade znanstvenike (YH). U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod

mikroRNA (miRNAs), razred malih RNA nisu za kodiranje proteina, su identificirani kao novi tip regulatora gena koji se vežu na 3'-netranslatiranim područjima (UTRs) od ciljne mRNA, što rezultira u degradaciju mRNA ili mRNA blokade prevođenja [1]. Opće je poznato da su Mirna promjene povezane s tumorigenezi [1]. Prema Mirna ciljne baze podataka, jedan Mirna mogu regulirati mnoge gene kao svoje ciljeve, a jedan gen može biti na meti mnogih miRNAs. Međutim, brojna istraživanja pokazala jedan-na-jedan odnos između Mirne i njene ciljnog gena. Također je izvijestio da više ili skupina miRNAs suradnjom regulirati gen, koji se odnose na karcinogeneze [2] - [4]. S druge strane, više geni su na meti jednog Mirna [3], [4]. Čak i više-na-više veza između miRNAs i ciljeva su izvijestili pomoću računalnih analiza [5], [6]. Međutim, bilo je samo nekoliko radova eksperimentalno ovjeri više za višestruke odnose u stanicama raka. Pregled

Rak želuca je četvrti najčešći ljudski maligna bolest, a drugi najčešći uzrok raka povezanih smrti u svijetu, a procjenjuje milijun novih slučajeva godišnje [7]. Želučani karcinom histološki se svrstati u dvije glavne vrste, crijevne i difuzne vrste [8]. Difuzna tipa GC često tvrdoglav i pokazuje lošu prognozu bolesnika. Nedavno smo pokazali da gubitak od Cdh1 i Trp53 funkcija inducira difuzni tip GC miševima modela [9]. Iako će nam ovo otkriće pomoći u razvoju novih ljudskih želučanih terapije raka, daljnja istraživanja na molekularni mehanizmi u podlozi želučane karcinogeneze su potrebne za razvoj drugih pristupe za ciljanu terapiju. Pregled

Promotor CpG otok Hipermetilacija je jedan od najčešćih mehanizama kojima tumor supresor gena inaktivirani rakom u čovjeka, [10]. U posljednje vrijeme, postalo je jasno da su neki miRNAs su ciljevi epigenetičke ušutkavanja u karcinomima [11]. Naši i druge skupine ranije su pokazali da farmakološko ili genetski poremećaj metilacije DNA u staničnim linijama karcinoma inducira se regulacijom znatnijim brojem miRNAs [12] - [15]. Ti podaci je identificirana kandidata tumora potiskuju miRNAs čija prigušenje je povezana s CpG otok metilacije. Do sada, metilacija članova obitelji miR-124 je određen u karcinomima debelog crijeva i u tumorima drugim organima [11]. Osim toga, Mir-34b /c klaster ima tipičnu otok CpG, a dolje regulira putem čestih metilacije u debelom crijevu i želučanih karcinoma [12]. Isto tako, otkrili smo da Mir-181C metilacije je povezan s želučanim karcinogeneze putem regulacije onkogenih gena Kraš
i NOTCH4 pregled [13]. Down-regulacija mnogih miRNAs kroz metilacije istovremeno odvija u stanicama raka, te može povećati više za višestruke odnose između miRNAs i ciljeve. Pregled

U ovom istraživanju, kako bismo provjerili više-to-više veza između miRNAs i ciljevima u stanicama raka, pokazali smo da dva para više miRNAs, Mir-224 i -452, a Mir-181C i -340, imali više ciljnih gena i sinergijski smanjene proliferacije stanica kroz regulaciju svojih ciljeva u ljudskim GC stanicama. pregled

Rezultati pregled

50 miRNAs su up-regulirana u staničnoj liniji GC, Kato-III, nakon 5-aza-2'-deoksicitidin tretman pregled

kako prepoznati miRNAs kandidatima koje sinergistički utječu na njihovo ciljne gene, ponovno smo analizirali naš prethodni podaci microarray (GEO pristupanje br GSE16006) [13]. Smatrali smo da je Mirna bile su povećana na 5-aza-2'-deoksicitidin (5-aza-CDR) liječenja kada je neto intenzitet pojedinih 3 mjesta su više od 1,5 puta. Osim toga, mi također odabrana miRNAs od kojih su pronađene prosjeci biti povećana za više od 3 puta na microarray analize. Na temelju tih novih kriterija, otkrili smo da 50 miRNAs su up-regulirana u staničnoj liniji GC, Kato-III (tablica S1). potvrdili smo regulaciji 5 od 6 reprezentativnih prekursora miRNAs, to jest, Mir-145, -148a, -152, -224 i -340, nakon 5-aza-CDR liječenje pomoću RT-PCR (Slika 1A).

TargetScan Predviđeni zajednički cilj genima Kandidat miRNAs

Kako bi se utvrdilo da li ili ne epigenetically nadzirane miRNAs imaju zajedničke ciljnih gena, tražili smo od TargetScan baze podataka (verzija 5.1) za njihove zajedničke ciljeve. Prema TargetScan, 50 miRNAs mogu podijeliti u 46 skupine na temelju njihovih sjemena sekvenci. TargetScan je također pokazalo da su ti 46 skupine mogu ciljati 6,460 gene. Među tim ciljnih gena, odabrali smo 13, od čega je prijavljeno izraz koji se povećao u GC u GEO baze podataka (GEO pristupanja br GSE2685) ili da se odnose na želučanu karcinogeneze (Tablica S2). Ovdje ćemo se usredotočiti na četiri miRNAs, Mir-152, -181c, -224 i -340, jer smo već izvijestili da je Mir-181C je epigenetically dolje regulirana u GC [13] i CpG otoci nalaze se u uzvodnim područjima tri druga miRNAs (slika 2a i C, a na slici S1). Slika 2a također otkriva da Mir-452 je grupirani s MIR-224. TargetScan predvidio da pet miRNAs može regulirati zajedničke ciljeve. Na primjer, DPYSL2 pregled (dihydropyrimidinase-kao 2, također poznat kao urušavanja odgovor posrednika proteina 2, CRMP2 pregled) je na meti Mir-224, -452, i -181c, KRAS
od Mir-224, -452, -181c, -340 i -152, i MeCP2 pregled (metil CpG obvezujuća proteina 2) Mir-181C i -340, odnosno (Slika 3). pregled

Izražavanje Mir-224, -452, -152 i -340 Smanjen na DNA Hipermetilacija u GC staničnim linijama

ispitali smo uključenost epigenetičkim promjena u down-regulaciju miRNAs. Izraz Mir-224, -340 i -152 povećan je za 5-aza-CDR liječenja u nekoliko GC staničnih linija (Slika 1b). Kvantitativne analizirani zreli miR-224 ekspresiju u 9 GC stanicama i staničnu liniju kolorektalni rak (CRC). Ne izraz Mir-224 otkrivena je u 7 od 10 tumorskih staničnih linija (Slika 1C). Također smo analizirali promjenu ekspresije miR-224 /-452 klastera u KATO III-stanice tretirane sa niskom dozom 5-aza-CDR (0,2 umol /l), inhibitor HDAC, trihostatin A (TSA, 0.3 umol /l), ili kombinacijom ovih dvaju lijekova. KATO-III stanice s niskom dozom 5-aza-CDR liječenju izlaže up-regulaciji Mir-224 /-452 klastera, dok TSA sami po sebi ne uzrokuje up-regulacije. Mir-224 /-452 klaster sinergijski je viša u KATO-III stanice s kombiniranim 5-aza-CDR i TSA liječenja (Slika 1D). Ovi rezultati pokazuju da je Mir-224 i Mir-452 može se regulirati na dolje kroz DNA metilacije u GC staničnim linijama što su isti transkripcije jedinici. Pregled

To je izvijestio da su intronske miRNAs regulirana promotora metilacije svog domaćina geni [14], [15]. Prema rezultatima računalne analize, Mir-224 /-452 klaster i Mir-340 nalaze se u introna 6 u Gabre pregled i introna 2 u RNF130 pregled, odnosno, oba od kojih sadrži gustu CpG otoke samo u promotorskim regijama gena domaćina (slika 2a i C). Istraživali smo odnos između razine ekspresije tih miRNAs i status metilacije svojih domaćina gena u staničnim linijama GC strane MSP analize. GC stanične linije bez Mir-224 ekspresije izložena samo metilacije signala, dok se izraz pozitivnih staničnih linija izlagao jake unmethylation uzoraka (slika 2b). Sličan odnos je otkriven za Mir-340 u GC stanicama (Slika 2D). Ovi podaci pokazuju da je ekspresija tih miRNAs u staničnim linijama GC može biti ušutkan preko promotora metilacije svojih domaćina gena. Pregled

Epigenetically regulirane miRNAs može biti povezano s GC staničnu proliferaciju pregled

Kako bi se utvrdilo je li epigenetically regulirano miRNAs su tumor potiskuju ili ne, procijenili smo učinak 5-aza-CDR u siDICER1 transfektiranoj Kato-III DICER1 KO HCT116 (D1KO) stanica (Slika 4A). Netretirane KATO III-a roditeljskih HCT116 stanice pokazuju sporiji proliferacije nakon tretmana s 5-aza-CDR. S druge strane, u siDICER1-transficiranim stanicama KATO-III i D1KO, učinak 5-aza-CDR tretmana na proliferaciju stanica smalaksavamo u oba slučaja. Ovi rezultati ukazuju na to da je učinak 5-aza-CDR je smanjen u niskim ili null DICER1 stanica, te da epigenetically nadzirane miRNAs igraju važnu ulogu u GC i CRC stanica. Pregled

Kako bi se analizirali odnos između njih miRNAs i 13 ciljnih gena prikazani u tablici S2, transfektirane da KATO III-stanica s siDICER1 i /ili obradi s 5-aza-CDR. Iako, izraz 3 ( DPYSL2 pregled, KRAS pregled i MeCP2 pregled) od 13 gena su smanjeni nakon 5-aza-CDR liječenja, ekspresija tih gena nije ne mijenja se na 5-aza-CDR liječenja, nakon čega slijedi transfekcijom siDICER1 (slika 4b). pregled

combinational Transformacija Mir-224 i -452 potisnuti GC stanične proliferacije pregled

transfektirane smo GC stanične linije s mir-224 i /ili -452 oponaša kao predstavnik Mirna klastera, odnosno negativna kontrola, a zatim provesti tetrazolij-8 testovima (WST-8) vodom riješen. Sedamdeset i dva sata nakon transfekcije, primijetili smo da izvanmaternične izraz Mir-224 ili -452 potisnuti rast dvije stanične linije, Kato-III i AGS (Slika 5a). Naime, combinational transfekcija Mir-224 i -452 oponaša intenzivno smanjio rast od dva GC staničnim linijama (slika 5A). Pregled

Mir-224 /-452 Klaster suradnjom smanjena ekspresija DPYSL2 pregled i KRAS

da bi istražili da li ili ne Mir-224 /-452 klaster zapravo se odnosi na regulaciju DPYSL2 pregled i KRAS pregled, analizirali smo ekspresiju DPYSL2 pregled nakon transfekcije KATO-III i AGS stanica s klasteru mir-224 /-452 same ili zajedno. Proveli smo RT-PCR i analize Western blot. DPYSL2 pregled i Kraš pregled količine bile su smanjeni nakon transfekcije s Mir-224 ili Mir-452 imitira (slika 5B). Zanimljivo je da u slučaju combinational transfekcije s Mir-224 i -452, ekspresija tih ciljnih gena je dalje regulirano (slika 5B). Down-regulacija DPYSL2 također uočeno na proteinskoj razini u dvije stanične linije (Slika 5C). Također smo ispitali razine ekspresije drugih pet gena, MeCP2, myc, JUNB, MUC1 pregled i SETDB1 pregled, koji nisu bili prikazani kao mete za Mir-224 ili -452 do TargetScan. Kao što se očekivalo, nisu pronađeni izražajnih promjene tih pet gena u KATO-III stanica nakon transfekcije Mir-224 ili -452 (Slika S2). Ovi podaci ukazuju na to da Mir-224 i -452 posebno regulirati na dolje DPYSL2 pregled i KRAS pregled. Pregled

DPYSL2 pregled je bio povezan s GC staničnu proliferaciju

ispitali smo učinak obaranje DPYSL2 Netlogu koji je prikazan da bude meta Mir-224 /-452 klastera, na proliferaciju stanica. Transfekcija u DPYSL2 pregled siRNA jasno smanjena razina DPYSL2 pregled transkripti (Slika 5D), te inhibira rast AGS i KATO-III stanice 72 sata nakon obaranje DPYSL2 pregled (Slika 5E), što ukazuje da DPYSL2 ima onkogeni aktivnost. pregled

combinational Transformacija Mir-340 i -181c potisnuti GC staničnu proliferaciju i induciraju Down-regulacija KRAS pregled i MeCP2 pregled Expression pregled

Kao drugi primjer višestrukih za višestruke odnose između mikroRNA i ciljnih gena, analizirali smo odnos između Mir-340 /-181c i Kraš /MeCP2 . pregled Kada miR-340 i miR-181C su transfektirani u KATO-III stanice, proliferaciju sinergijski podregulira dva miRNAs (slika 6a). Da bi se utvrdilo da li ili ne epigenetically regulirana Mir-340 i Mir-181C suradnjom utjecati na njihove ciljeve, analizirali smo razine mRNA KRAS pregled i MeCP2. Pregled na RT-PCR analize, KRAS pregled i MeCP2 pregled utvrđeno je da se dolje regulirana Mir-340 i sama Mir-181C, ili combinational transfekcijom u KATO-III stanice (Slika 6b). Kao što je za četiri gena, myc, JUNB, MUC1 pregled i SETDB1 pregled i bez predviđenih mjesta za ova dva miRNAs po TargetScan, razine ekspresije nisu promijenili u ovoj studiji. I podaci prikazani su na slici 6B. Dakle, efekti Mir-340 i -181c mogu biti specifične za njihove zajedničke ciljnih gena, kao i Mir-224 i -452. Pregled

Ekspresija i Metilacija Status Mir-224 i -340 u osnovnoj GC predmetima pregled

ispitali smo status metilacije Mir-224 i -340 u slučajevima primarne GC. Metilni obrasci Mir-224 su nađeni u 15 od 26 (57,7%) primarnih GC tkivima (slika 7A i tablica 1). U paru non-kancerogen želuca sluznica jedva izložena obrasca metilacije Mir-224. Dalje, kvantitativne analize razine Mir-224 u osnovnim GC tkiva i odgovarajuće ne-kancerozne sluznice pomoću TaqMan RT-PCR. Značajno smanjenje Mir-224 izražavanja u GC tkiva zabilježen je u slučaju raka metilacije-pozitivne u odnosu na metilacije negativnih one i ne-kancerozne želučane sluznice (Slika 7c). Pregled

detaljnije analizirati DPYSL2 pregled razine mRNA u usporedbi sa statusom metilacije Mir-224 u GC tkiva: GCS s Mir-224 metilacije (Ca Mir-224 MT), GCS sa Mir-224 unmethylation (Ca Mir-224 ne), a ne -cancerous tkiva s unmethylation (N mir-224 ne). DPYSL2 pregled razina mRNA u "Ca Mir-224 Mt« bio znatno veći od onih u "N Mir-224 Un" i "Ca Mir-224 UN" grupe, p = 0,049 ip = 0,035, odnosno (Slika 7D). Prema tome, postoji korelacija između statusa metilacije Mir-224 i DPYSL2 pregled izražavanja u GC tkivima. Pregled

Mir-340 metilacije frekvencija bila je relativno niska u primarni GC tkiva ispitanih (4 od 26, 15,4%) (Slika 7B i tablica 1), dok nitko od 26 paru ne-kancerogen želuca sluznica izlagao prividne metilaciju obrasce Mir-340. Što se tiče Mir-152 metilacije analize, pokušali smo tri primera seta dizajnirane u uzvodnom području Mir-152 sadrže CpG otoci (Slika S1), ali niti jedan od njih u potpunosti odgovaraju Mir-152 Izraz na MSP analize (podaci nisu prikazani).

Rasprava pregled

Iako je izvijestio da je ekspresija nekih miRNAs smanjena je u nekoliko vrsta raka kroz DNA metilacije, većina izvješća opisuje se da je odnos između ekspresiji od miRNAs i njegovih ciljnih gena je jedan-na-jedan, jedan na višestruke multiple-na-jedan. Ispitati mogućnost višestrukih za višestruke odnose između miRNAs i ciljeva u stanicama raka, usredotočili smo se na dva kombinacijama miRNAs u GC stanicama, Mir-224 /-452 klaster i Mir-181C i -340, u ovoj studiji , Otkrili smo da su dva seta miRNAs, Mir-224 i -452, a Mir-181C i -340, imali više ciljnih gena, DPYSL2 pregled i KRAS pregled i KRAS pregled i MeCP2 pregled, redom, a sinergistički smanjene proliferacije stanica u ljudskim staničnim linijama GC. Uočljivo je da onkogena, KRAS pregled [16], je utvrđeno da je na meti četiri miRNAs, iako kandidati vezna mjesta za četiri miRNAs se razlikuju u 3 'UTR od Kraš
(TargetScan). Mi smo ranije izvijestili da je Mir-181C dolje regulira NOTCH4 pregled stvari [13]. Dakle, više-na-više veza između miRNAs i ciljeva koje su upućuje ne samo baze podataka analize, ali i transfekcijom eksperimenata koji uključuju ljudske stanice.

Mir-224- i /ili -340-izraz-negativne GC stanične linije eksponati Hipermetilacija signali na MSP analize i ekspresije Mir-224 i -340 vratiti na demethylating sredstva za liječenje. Nadalje, Hipermetilacija Mir-224 i -340 je češća kod primarnih GCS od odgovarajućih noncancerous sluznicu. U Mir-224 metilacije pozitivnih slučajeva, izraz Mir-224 bio je znatno niži nego u metilacije-one negativne. Ovi podaci snažno ukazuju na to da je nenormalna metilacije DNA je jedan od ključnih mehanizama u podlozi-naniže Mir-224 i -340 u GC stanicama. Pregled

Mi smo pokazali da inhibicija Mirna obradu siDICER1 transfekcijom ili pomoću DICER1 nokaut stanica smanjen učinak 5-aza-CDR, odnosno smanjene proliferacije stanica i regulacije na niže ciljanih gena, u GC i CRC stanica. Ona je izvijestila da je obilje DICER1, enzima koji katalizira završni korak Mirna sazrijevanja, izravno je povezana s progresije tumora [17]. Ovi rezultati ukazuju na to da je nenormalna regulacija Mirna sazrijevanja pridonosi GC i formiranje CRC. Pregled

Otkrili smo da je Mir-224 /-452 klaster je nenormalno dolje regulirano GCS kroz Hipermetilacija. Netipična izraz Mir-224 također je izvijestila u drugim tumorima. Izražavanje Mir-224, neka-7f i Mir-516a je smanjen u raka jajnika, a oni sinergijski regulira ekspresiju kalikrein vezane peptidaza 10 (KLK10) [18]. Mir-224 je dolje regulirana metotreksata otporan CRC staničnim linijama u usporedbi s u osjetljivim stanicama [19]. Ovdje ćemo također otkrio da je metilacije status Mir-224 je povezana s DPYSL2 pregled razini u ljudskom GCS. Uzeti zajedno, Mir-224 ima važnu ulogu kao tumor-supresije Mirne na GC, kao i na nekoliko drugih vrsta raka. Nasuprot tome, Mir-224 je viša u hepatocelularnim karcinomima [20] i meduloblastoma [21] u usporedbi s u normalnim tkivima. Dakle, daljnje studije su potrebne pojasniti ulogu Mir-224 u karcinogeneze. Pregled

Istraživali smo zajedničke ciljeve epigenetically dolje regulirana miRNAs. DPYSL2 pregled pokazalo se da je dolje regulirana Mir-224 i -452. DPYSL2 igra važnu ulogu u uspostavljanju neurona polariteta [22]. DPYSL2 je također uključena u puteve koje reguliraju razmnožavanje ne-neroskih stanica kroz njegovu fosforilacije regulatornim proteinima. DPYSL2 prolazi dinamičke promjene fosforilacije odgovor na kontakt mirovanje inhibicije izazvanu i Hiperfosforilacija DPYSL2 događa u tumoru, [22]. Iako je uloga DPYSL2 u GCS nije jasno, naš siRNA-based obaranje DPYSL2 izražavanja izazvala je smanjenje proliferacije u dva GC stanicama, što ukazuje na onkogeni aktivnost DPYSL2. Pregled

Ukratko, naši rezultati pokazuju da više-to-više veza između miRNAs i ciljnih gena zaista postoje u GC. Vrlo je vjerojatno da je nenormalna metilacije smanjuje ekspresiju višestrukih tumora potiskuju miRNAs, kao što su Mir-224, -452, -340 i -181c, koji je tada induciraju prekomjerna ekspresija više onkogena gena, kao što su Kraš Netlogu DPYSL2 pregled i MeCP2 pregled. Ovi nenormalni više za višestruki odnosi između miRNAs i ciljeva će biti jedan od važnih mehanizama koji stoje iza želuca karcinogeneze. To je, dakle, vrlo je moguće da su epigenetski lijekovi mogu normalizirati ekspresiju ne samo tumorske potiskuju gena, ali i više tumora potiskuju miRNAs, čime dovodi do smanjenja abnormalnih više za višestruko odnosa miRNAs i ciljeve, te stoga može postati izvrsni se lijekovi protiv raka. pregled

materijali i postupci

etika Izjava pregled

Pismeni informirani pristanak koji je dobiven od svih subjekata, a Etičko povjerenstvo Tokyo medicinskih i stomatoloških fakulteta Sveučilišta u medicina je odobrila ovo istraživanje. pregled

stanične linije i uzorci tkiva

proučavali smo 9 GC stanične linije (Kato-III, MKN45, AGS, MKN74, TGBC11TKB, HSC59, HSC43, HSC58 i GCIY), 2 CRC stanične linije (HCT 116 i DICER1
knock out HCT 116 [23]), te 26 slučajeva primarni GC. MKN45, MKN74, TGBC11TKB i GCIY su kupljeni od Riken banke stanica, a KATO-III i AGS su od ATCC (American Type Collection). HSC59, HSC43 i HSC58 dobiveni su od Dr. Kazuyoshi Yanagihara [24], [25]. KATO-III, MKN45, MKN74, HSC59, HSC43 i HSC58 su uzgojene u RPMI 1640 i AGS, TGBC11TKB, GCIY i dva CRC stanične linije u Dulbeccovom modificiranom Eagle mediju, minimalni esencijalni medij ili McCoyeva 5A, uz dodatak 10% fetalnog goveđeg serum. Kirurški resected primjerci iz 26 pacijenata primarnih GC su nasumce dobiven od povezanih bolnice Medicinskog fakulteta, Tokyo medicinske i Sveučilište Dental. Pregled

U kompjutora Analiza pregled

tekstu smo do GEO baze podataka za Mirne i profila genske ekspresije (pristupanje GEO br GSE16006 i GSE2685). Također smo koristili Mirna ciljne baze podataka "TargetScan". Pregled

Drug tretiranja stanica i RNA Vađenje pregled

Za dimeiliran studije, stanice svakodnevno su tretirane s 5 umol /l 5-aza-CDR (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) na 72 sata. Također pomiješa stanica sa 0.3 mola /l TSA sami i u kombinaciji 0,2 umol /l 5-aza-CDR i TSA. Ukupna RNA je izolirana koristeći Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) ili miRNeasy mini kit (Qiagen, Hilden, Njemačka). Pregled

kvantitativni stvarnom vremenu reverznom transkripcijom lančanom reakcijom polimeraze pregled

real-time reverzne transkripcije-lančana reakcija polimeraze (RT-PCR) analiza provedena su pomoću StepOne real-time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA), EagleTaq Master Mix sa Rox (Roche, Mannheim, Njemačka), a TaqMan reverzne transkripcije kita (Applied Biosystems) i TaqMan Mirna eseji (Applied Biosystems), u skladu s uputama proizvođača. Razina ekspresije Mirna izračunati su na bazi od iznosa ciljne Mirna odnosu na onu od RNU6B kao kontrola da normalizira početnu unos ukupne RNA. Pregled

Metilacija Analiza pregled

bisulfita liječenje DNA izvodi s Methylamp (Epigentek, Brooklyn, NY). lančana reakcija polimeraze (MSP) analiza metilacije specifični su provedena kao što je prethodno opisano [26]. Sekvencijama i PCR veličine proizvoda prikazani su u tablici S3. Pregled

Sintetička Mirna TRANSFICIRANJE pregled

KATO-III i AGS stanice su transficirane s prekursor molekule oponašajući Mir-224, -452, -340 ili -181c ili kodirani slijed Mirni (Sigma) kako bi se dobilo konačnu koncentraciju od 25-50 nmol /l pomoću electroporator, neonski (Invitrogen), u skladu s uputama proizvođača. Na 24-72 sati nakon transfekcije, stanice su sakupljene za RT-PCR i Western blot analize. Pregled

proliferacije stanica
stanice

miR-oponašatelj transfektirane KATO-III i AGS su stavljene na 1 × 10 ^{3, ili 1 × 10 4 stanica po jažici na ploči s 96 jažica. stanična proliferacija je procijenjena na dane 1-4 nakon transfekcije određivanjem broja stanica s proliferacija stanica reagensa WST-8 (Dojindo Molecular Technologies, Inc, Mashikimachi, Japan), u skladu s uputama proizvođača. pregled}

Mirna ciljana Predviđanje i Western blot-pregled

Predviđena meta miRNAs i njihovim ciljnim mjestima su analizirani pomoću TargetScan. Razina ekspresije mRNA iz predviđenih ciljeva u prolazno transfeciranih stanica su analizirani na 24 sati nakon transfekcije pomoću RT-PCR. Western analize blot je izveden kako je prethodno opisano [26]. Primarna protutijela korištena je kunić anti-DPYSL2 (1:500,Ϋ3, Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Koristili smo miša anti-a-tubulin (1:1000, SC-8085, Santa Cruz Biotechnology) kao interna kontrola za Western blot. Sekundarnih protutijela su alkalna fosfataza-konjugiranog anti-zečjeg IgG i anti-mišjim IgG (1:2000, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Mrlje su razvijeni s ImmunoStar AP supstrata (Bio-Rad Laboratories). Pregled

popratne podatke pregled Slika S1. pregled Shematski prikaz COPZ2
regiji koja sadrži Mir-152. Ispunjene kutije predstavljaju eksona COPZ2 pregled A i prazna kutija označava neprevedene regiju COPZ2 pregled. Savijanjem strelica označava mjesto početka transkripcije COPZ2 Netlogu. Vertikalni strelica pokazuje položaj MIR-152. Vertikalne linije označavaju CpG mjesta. Strelice označavaju područja istražuju MSP pregled doi:. 10,1371 /journal.pone.0062589.s001 pregled (TIFF) pregled Slika S2.
Učinci transfekcijom Mir-224 i -452 u KATO-III stanice. RT-PCR analize nakon transfekcije s MIR-224 i /ili -452. Ekspresija ciljnih gena je analizirana 48h poslije pomoću RT-PCR. Mir-224 i -452 posebno regulirati na dolje DPYSL2 pregled i KRAS pregled, ali ne i drugi pet gena ispituje, koji su u skladu s rezultatima analize baze podataka (Slika 3). pregled doi: 10,1371 /journal.pone.0062589.s002 pregled (TIFF) pregled Tablica S1. pregled Expression profiliranje ljudske miRNAs u KATO-III stanica nakon 5-aza-CDR tretman pregled doi:. 10,1371 /journal.pone.0062589.s003 pregled (XLSX) pregled Tablica S2. pregled Popis ciljnih gena čija ekspresija se ispituje pomoću RT-PCR nakon liječenja s ili bez 5-aza-CDR i transfekcija s 20 nmol /L ili kodirane siDICER1 siRNA pregled doi:. 10,1371 /journal.pone .0062589.s004 pregled (XLSX) pregled Tablica S3.
Sekvence klica korištenih u ovom istraživanju pregled doi:. 10,1371 /journal.pone.0062589.s005 pregled (XLSX) pregled

Priznanja

Želimo zahvaliti dr Bert Vogelsteinu za pružanje DICER1 knock-out stanična linija HCT 116. pregled