PLO ON: galektin-3 Olakšava pokretljivost stanica na rak želuca do doreguliranje proteaze-activated receptor-1 (PAR-1) i matriks metaloproteinaze-1 (MMP-1)

Sažetak pregled

Pozadina pregled

galektin-3 je poznato da regulira metastaza raka. Međutim, osnovni mehanizam nije definiran. Kroz DNA microarray studije nakon galektin-3 utišavanja, pokazali smo da se ovdje galektin-3 igra ključnu ulogu u regulaciju iskaza proteaza aktiviranih receptora-1 (PAR-1) i matriks metaloproteinaze-1 (MMP-1) PAR-1 time promovira želučane metastaza raka. pregled

Metodologija /glavne nalaze

ispitali smo razine ekspresije galektina-3, PAR-1 i MMP-1 u rak želuca tkivima bolesnika i učinci utišavanje tih proteina s posebnim iRNK i da ih pretjerano izražavanje pomoću specifičnih Lenti-virusni konstrukte. Također smo zaposleni zebraste ribice modela embrija za analizu In vivo
invazije želučane stanica raka. Te su studije pokazale da: a) galektin-3 utišavanje smanjuje ekspresiju PAR-1. b) galektin-3 prekomjerna ekspresija povećavaju staničnu migraciju i invaziju, a to povećanje može poništiti PAR-1 utišavanja, što znači da galektin-3 povećava staničnu migraciju i invaziju putem PAR-1 doreguliranje. c) galektin-3 izravno komunicira s AP-1 transkripcijski faktor, a to se veže PAR-1 promotora i vozi PAR-1 transkripcije. d) galektin-3 također pojačava fosfo-paxillin, a PAR-1 nizvodno cilj, povećanjem MMP-1 ekspresija. MMP-1 prigušivanje blokovi fosfo-paxillin pojačanje i invazija stanica uzrokovana galektin-3 over-izražavanja. e) odsutnost bilo galektin-3, PAR-1 ili MMP-1 značajno smanjiti migraciju stanica u žilama u zebraste ribice modelu embrija. f) galektin-3, PAR-1 i MMP-1 vrlo izraženi i lokalizirani u malignim tkivima bolesnika s rakom želuca. pregled

Zaključci /Značaj pregled

galektin-3 igra ključ uloga aktiviranja površinski receptor ćelije kroz proizvodnju proteaze i jača želudac metastaza raka. Galektin-3 ima potencijal da služi kao farmakološkog cilj za prevenciju želučanog metastaziranja raka pregled

Izvor. Kim S-J, Shin J-Y, Lee K-D, Bae Y-K, Choi I-J, Park SH, et al. (2011) galektin-3 Olakšava pokretljivost stanica na rak želuca do doreguliranje proteaze-activated receptor-1 (PAR-1) i matriks metaloproteinaze-1 (MMP-1). PLoS ONE 6 (9): e25103. doi: 10,1371 /journal.pone.0025103 pregled

Urednik: Jean-Marc Vanacker, Institut de Génomique Fonctionnelle de Lyon, Francuska pregled

Primljeno: 18. svibanj 2011; Prihvaćeno: 23. kolovoz 2011; Objavljeno: 22. rujna 2011 pregled

Copyright: © 2011 Kim et al. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Ova studija je podržan od strane National Cancer Center (NVK) Republike Koreje bespovratnih sredstava (NCC-0910150 i NCC-0810060), inovativno istraživanje Instituta za staničnu terapiju, Republika Koreja (A062260) i ovog istraživanja bio je podržan od strane Basic442 Science Research programa putem National Research Foundation (NRF) financira Ministarstvo obrazovanja, znanosti i tehnologije (1031790-1), Republika Koreja. U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

Tumori koji se šire (metastazirati) iz njihovog izvornog mjesta na drugo područje tijela, nazivaju metastatskog raka. metastatski tumori imaju lošu prognozu i visoku smrtnost [1]. Potpuni razumijevanje biološkog mehanizma (e) koji su uključeni u metastaziranje i racionalna pristupa prevenciji ili kontroli metastaze mogu dovesti do praktični pristupi za poboljšanje preživljavanje pacijenata pogođenih s metastatskog raka. U prethodnim istraživanjima, otkrili smo da galektin-3 povećava rak želuca pokretljivost stanica koje se reguliraju fascin-1, te aktin-vezanje citoskeleta protein [2]. Galektin-3 je 31 kDa ugljikohidrate prepoznavanja proteina, koji su uključeni u tumorogenezi, rast stanica raka i metastaza [3], [4], [5] i visoka ekspresija u nekoliko humanih karcinoma je utvrđeno da koreliraju s lošom prognozom i metastatski karcinom. pregled

Kako bi razjasnili ulogu galektin-3 u metastaziranje raka, pokucao dolje smo svoj izraz u želučanim stanicama raka koristeći svoj siRNA i ispituje rezultate u ekspresiji gena DNK analize mikropolja [6]. Među dosadašnjim rezultatima, našli smo značajno smanjenje razine proteaze se aktiviraju receptor-1 (PAR-1), član obitelji transmembranskih G-protein receptore [7], a njegov aktivator, matrica metaloproteaze-1 ( MMP-1) (Slika S1). Cijepati PAR-1 auto-fosforilirana i transducirati na izvanstanične signal (e) kroz različite puteve, i igra kritičnu ulogu u metastaze tumora [7], [8], [9]. Prekomjerna ekspresija PAR-1 je u nekoliko vrsta raka, uključujući melanome, dojke i želučane raka. MMP-1 je također viša u raznim uznapredovalog raka, a značajna negativna korelacija primijećena je između njegove ekspresije i preživljavanje pacijenta [10], [11], [12], [13]. Također je nekoliko studija utvrdili da MMP-1 igra ključnu ulogu u metastazi raka dojke [14], jetre i debelog crijeva [15], te želučanog raka [16], [17], među ostalima. Čini se da je jednom luči, MMP-1 potiče invaziju stanica raka kroz razgradnji izvanstaničnog matriksa i /ili submukozalnim slojeva limfe [10], [14]. Brojne studije pokazale da inhibicija MMP uzrokuje inhibiciju stanične invazije [18], [19]. Pregled

hese nalazi nas je do hipotezu da galektin-3, PAR-1 i MMP-1 može biti uključen u povećanje migraciju i invaziju raka želuca. Da bi testirali tu hipotezu, proveli smo istraživanja zbog njihove uloge u želučanih stanica raka. U oba in vitro
i in vivo
studije, koristili smo zebraste ribice modela embrija za određivanje njihov utjecaj na migracije i invazije stanica raka sa živih organela. Također smo utvrdili razine ekspresije galektin-3, st-1 i MMP-1 u malignim tkivima od pacijenata s rakom želuca za kliničke korelacije između tih proteina u ljudskim uzorcima. pregled

Rezultati

Ušutkavanje galektin -3 ili PAR-1 smanjuje migraciju i invaziju stanica raka želuca pregled

razina ekspresije galektin-3 i PAR-1 bile visoke u većini staničnih linija raka želuca. ušutkani smo galektin-3 i PAR-1 u MKN-28 stanica zapošljavaju odgovarajuće siRNA. Tretman s galektin-3 siRNA smanjene razine ekspresije i galektin-3 i PAR-1, dok PAR-1 siRNA liječenje pada samo PAR-1 ekspresiju, dok nema razlika uočena je u galektin-3 (Slika 1A). Transfekcija SNU-638 stanica, koji je u početku ne pokazuju ekspresiju galektin-3, sa galektin-3-kodiranje plazmida rezultirala je povećanom ekspresijom PAR-1 i galektin-3 (Slika 1B). Utišavanje ili galektin-3 ili PAR-1 smanjuje ukupan broj od migracije ( p izvoznici < 0,001) (slika 1C) i invaziju stanica ( p izvoznici < 0,001) (Slika 1D), gotovo za pola. Ovi podaci su pokazali da je galektin-3 povećana PAR-1 ekspresija i oba galektin-3 i PAR-1 modulirani migraciju želuca stanica raka i invaziju. Pregled

galektin-3 povećava migracija rak želuca stanica /invaziju povećanjem PAR-1 izraz pregled

ispitali smo odnos između galektin-3-izazvana povećanja stanične migracije i invazije s jedne strane i PAR-1 ekspresije s druge strane. zaraženi smo SNU638 stanica sa lentivirus sadrži galektin-3 kasetu izražavanja, te ispitali izraze galektin-3 i PAR-1, i migracije izmjerene stanica. otkrili smo da prekomjerna ekspresija galektin-3 bio je praćen povećanim PAR-1 mRNA i protein izraza (slika 2a), te migraciju stanica ( p pregled < 0,001) (Slika 2B) i stanična invazivnost ( p izvoznici < 0,001) aktivnosti (Slika 2C). Ta su povećanja smanjena za PAR-1 ušutkavanja. Ovi rezultati sugeriraju da je galektin-3 promovira migraciju i invaziju stanica želuca raka kroz regulaciji PAR-1. Pregled

galektin-3 potiče PAR-1 transkripcije kroz interakciju s AP-1 kompleksa pregled

zatim smo pokušali razjasniti kako je galektin-3 regulira PAR-1 ekspresija. Zato što je izvijestio da je AP-1 transkripcije aktivnosti regulira galektin-3 [20], usredotočeni smo na ulogu tog faktora transkripcije u tom pogledu (Slika 2D). Izvršili smo imunoprecipitacije studija i ustanovili da galektin-3 izravno u interakciji s obje Fra-1 i C-Jun na AP-1 kompleksa, te da je ta interakcija bila povezana s up-regulaciji AP-1 transkripcije aktivnosti (Slika 2e). Dalje, ispitali smo aktivnost vezanja na DNA AP-1 sa i bez galektin-3 pomoću chip analiza (Slika 2F). otkrili smo da AP-1 kompleksa vezanog promotor PAR-1 u prisutnosti galektin-3, ali ne i u odsutnosti. Također ocjenjuje transkripcijsku aktivnost AP-1 pomoću Luciferaze nakon transfekcije reporterskog plazmida koji sadrži AP-1 vezanje sekvence ispred luciferaznog vožnje minimalnog promotora u lacZ ili galektin-3 prekomjerno eksprimiraju SNU-638 stanica ( p pregled < 0,001) (Slika 2G). Transkripcijsku aktivnost AP-1 je značajno povećao galektin-3 prekomjerno eksprimiraju stanice, ali ne u lacZ prekomjerno eksprimiraju stanice. Ovi rezultati sugeriraju da galektin-3 olakšano vezanje PAR-1 promotora interakcijom sa AP-1 kompleksa, čime se povećava PAR-1 ekspresija regulaciji transkripcije. Pregled

galektin-3 povećava ekspresiju MMP-1 i aktivacija PAR-1 odašiljanih pregled

MMP-1 je objavljeno da regulira PAR-1 aktivaciju preko cijepanja PAR-1 ograničenog unutarstanične signalizacije i utjecati na staničnu invaziju [21]. Kao što je prikazano na slici S1, pokazali smo da galektin-3 regulira MMP-1 ekspresija. Stoga, utvrdili smo međuodnosi galektin-3, MMP-1 i PAR-1. analizirali smo razine ekspresije mRNA MMP-9, koji je nizvodna meta PAR-1 [8], a nakon utišavanje galektin-3, MMP-1 i PAR-1 pojedinačno (Slika 3A). A galektin-3 utišavanje smanjuje ekspresiju svih triju molekula (MMP-1, PAR-1 i MMP-9), MMP-1 utišavanje reducira samo MMP-9 ekspresija a ne i galektin-3 i PAR-1. Zanimljivo, PAR-1 utišavanje proizvodila iste učinke kao i MMP-1 ušutkavanja. Također, otkrivena fosforilaciju citoskeleta proteina paxillin (pY181), zaštitni znak PAR-1 aktivacije [22], [23]. Nakon utišavanje galektin-3, MMP-1 i PAR-1 Pojedinačno, phosphorylaion od paxillin je smanjen, što je predložio galektin-3 također regulirano PAR-1 aktivnost. Također provjereni na smanjenje aktivnosti MMP-9 nakon odsutnost galektin-3, MMP-1 i PAR-1 pojedinačno (Slika 3A).

galektin-3 pretjerano eksprimiraju SNU638 stanice pokazuju povećanu razinu ekspresije MMP 1 i PAR-1 protein, kao i njihove mRNA, osim fosforiliranog paxillin (pY181). U tim stanicama, MMP-1 utišavanje smanjuje fosforilaciju paxillin bez promjene ekspresije galektin-3 i PAR-1 (Slika 3B). Nadalje, MMP-1 utišavanje reducira invazije stanica koja se aktivira pomoću galektin-3 prekomjerna ekspresija ( p pregled < 0,001) (Slika 3C), što znači da galektin-3 povećana ekspresija MMP-1 dovodi do aktivacija PAR-1 signaliziranje. pregled

Prekomjerna ekspresija MMP-1 u stanicama raka povećava staničnu invaziju kroz aktivaciju PAR-1 odašiljanih pregled

potvrdili smo da doreguliranje MMP-1 po galektin-3 je važna za aktivaciju PAR-1 signalizacije i povećane invaziju želučanih stanica raka. Je lentivirus (pLECE3 Vector) sadrži MMP-1 ekspresijskih kazeta reguliran CMV promotora je pripremljen i inficirane u AGS želuca stanica raka (Slika 4A-B). Kao što se očekivalo, MMP-1, prekomjerna ekspresija povećao invazijski potencijal želučanih stanica karcinoma, i PAR-1 utišavanje bitno poništavaju ovo povećanje ( p pregled < 0,001) (Slika 4B). To je također potvrđeno činjenicom da prekomjerna ekspresija MMP-1 povećanog fosforilaciju paxillin, što dodatno utišavanje PAR-1 blokiran takva fosforilacija (slika 4A). U MMP-1 hipereksprimiraju stanice, galektin-3 utišavanje smanjuje ekspresiju PAR-1, ali ne i da se MMP-1, a također i fosforilaciju paxillin i staničnu invazivni potencijal (Slika 4A-B). Ovi opažanja ukazivala da prekomjerna ekspresija MMP-1 povećava stanica raka invasivity aktiviranjem PAR-1 signalizaciju. Uzeti zajedno, ovi rezultati sugeriraju da galektin-3 povećava ekspresiju i PAR-1 i MMP-1, a da je povećana ekspresija MMP-1 aktiviran PAR-1 signalizacije, što zauzvrat, olakšati invaziju stanica raka. Ti događaji su shematski prikazani na slici 4C, pregled

odsutnost galecin-3, PAR-1 ili MMP-1 blokova želuca migracija stanica raka in vivo pregled u zebraste ribice modelu pregled

Transgenični zebraste ribice, Tg (kdrl: EGFP) ^{s843 pregled [24], izraziti EGFP posebno u krvnim žilama. Odgovarajuće zebraste ribice embriji su transparentni sa zelenim fluorescentnim plovila. zaposleni smo ove ribe provesti In vivo
studije ljudske migracije želučanog karcinoma stanica (Slika 5a). Kada je crveno fluorescentno obilježeni AGS stanice su ubrizgava u žumanjčana vreća od zebraste ribice embrija na 48 HPF (sati nakon oplodnje), većina transplantiranih AGS stanica nalazi se u središtu žumanjčana vreća embrija do 4 sata nakon transplantacije ( HPT). Nakon 26 HPT, i normalna i scRNA transfektirane stanice premješten u prtljažniku regije, a boravio je u posudi od debla i /ili repa embrija na 50 HPT. Međutim, broj migriranih AGS stanice, u kojoj je svaki od galektin-3, PAR-1 ili MMP-1 ušutkavani značajno smanjen (slika 5B). Također smo pobrojali zebraste ribice embrija koje prikazuju migracije stanica, a rezultati su prikazani (Slika S2). Osamdeset četiri do devedeset tri posto zebraste ribice embrija koji su transplantiranih s kontrolnim stanicama ili scRNA tretiranih stanica prikazane stanica koje migriraju u svoje deblo i stražnja plovila na 50 HPT. Međutim, samo 7-11% zametaka koji su transplantiranih sa stanicama u kojima galektin-3, PAR-1 ili MMP-1 su ušutkani, prikazuje migraciju stanica. Ovi nalazi sugeriraju da prvi, zebraste ribice modela embrija se može koristiti za praćenje migracije želučanih stanica raka kao životinju, i drugo, da utišavanje svake od galektin-3, PAR-1 i MMP-1 uzrokuje značajno smanjenje u migracija rak želuca stanica in vivo pregled. pregled}

Iskazi galektin-3, PAR-1 i MMP-1 su povišene, paralelno, u malignim tkivima oboljelih od raka želuca pregled

Odredili smo mRNA i razine ekspresije proteina u galektin-3, t-1 i MMP-1 u normalnim i malignim tkivima od 20 bolesnika raka želuca, a zatim zaposleni RT-PCR pomoću slika J analizator. Kao što je prikazano na slici 5C i slici S3, 73,7% pacijenata oboljelih od raka pokazala veće razine ekspresije galektin-3 i 70% njih pokazalo je veće razine PAR-1 i MMP-1 u svojim malignim tkivima u odnosu na njihove normalne kolege. Štoviše, među galektin-3 pozitivnih bolesnika, 71,4% su bili i PAR-1 pozitivan, a 64,3% su bili i MMP-1 pozitivni (Slika 5D). Ovi podaci ukazuju da postoji paralelna povećanje ekspresije galektin-3, kao i PAR-1 i MMP-1, kod malignih želučane tkiva. Također smo otkrili da ovi proteini lokalizirani u malignim dijelovima tkiva, a ne u ne-malignim dijelovima (Slika 5c). Galektin-3 bio je prisutan i u citosolu i u jezgru, a PAR-1 i MMP-1 se vidi uglavnom u citosolu i membrane unutar područja (slika 5C). Ovi nalazi sugeriraju da su oba PAR-1 i MMP-1 izraze značajno korelira s galctin-3 ekspresije u bolesnika s rakom želuca. Pregled

Rasprava pregled

Ova je studija pokazala da galektin-3 poboljšane migracija želučane stanica raka i invaziju. Mehanistički, to povezano galektin-3 na doreguliranje površinski PAR-1 stanica receptora i aktivnost MMP-1 proteaze. To je u skladu s izvješća pokazuju korelaciju između ekspresije PAR-1 i invazije tumora i metastaza u želučanim i nekoliko drugih vrsta raka [25], [26], [27]. Ova studija je prva koja pokazuju izravnu interakciju galektin-3 i AP-1 složene komponente, c-Jun i fra-1, i reguliranje PAR-1 ekspresije po AP-1 transkripcijski faktor. Budući da je već prikazano drugima da prekomjerna ekspresija fra-1 potiče rak invaziju i metastaziranje stanica [28], up-regulaciji PAR-1 c-Jun i fra-1 činilo se da je mogući mehanizam koji objašnjava povezanost od galektin-3 inducirane doreguliranje površinski PAR-1 stanica receptora i aktivnost MMP-1 proteaze. Ova mogućnost je podržan od strane našeg otkrića paralelnih i lokalizirani izrazima galektin-3 i PAR-1 u malignim tkivima oboljelih od raka želuca. Pregled

To je roman primjedba da galektin-3 povećava MMP-1 ekspresija , Jasno je da je prekomjerna ekspresija MMP-1 se može povećati aktivnost želučane invazije stanica blokiranjem stanice do stanice i stanice za matrične interakcije degradacijom ECM. Dakle, povećanje MMP-1 ekspresije promovira galektin-3 može imati dvostruke učinke, naime, PAR-1 aktivaciju i degradaciju ECM, a obje su kritični za želučane metastaza raka. Međutim, kako je galektin-3 regulira MMP-1 ekspresija je još uvijek nejasna, jer je ekspresiju MMP-1 je regulirana nizom kompleksnih događaja, uključujući interferencija između nekoliko transkripcijskih faktora, kao što su AP-1, signal sonde i aktivator transkripcija-3, MAP kinaze i hipoksije-induktivni faktor-1 do hipoksije [29], [30], [31]. pregled

Utvrđivanje zebraste ribice ( Danio rerio pregled) Model embrij za proučavajući migraciju i invaziju želučanih stanica raka je posebno postignuće ove studije jer prikladni životinjski modeli nisu bili dostupni za proučavanje ljudskog želuca metastaza raka do sada. Zebraste ribice model za proučavanje genetski rak i /ili tumorskih ksenografta, ima mnoge prednosti, uključujući izvodljivosti naprijed i natrag genetske analize, transparentnost embrija [32], i prikladnost za GFP označavanje plovila [32], [33], [34]. Ovo istraživanje je pokazalo da RFP označeni želučane stanice raka napao krvne žile, dok galektin-3, MMP-1 ili PAR-1 utišao želučane stanice raka ne mogu. Dakle, zebraste ribice embrij izgleda kao da se obećavajući model za proučavanje invazije i metastaziranja stanica raka, iako su daljnja istraživanja jasno su potrebne kako bi potvrdili ovaj nalaz. Pregled

Na kraju, naša su istraživanja pokazala da galektin-3 ubrzano raka želuca pokretljivost stanica po doreguliranje u PAR-1 i MMP-1. Daljnja istraživanja jasno su potrebne da se utvrdi uloga galektin-3 u metastaza raka i njegovu prikladnost kao terapijski cilj za odabrane vrste raka.

Materijali i metode

tkiva

Parovi od 2 mm veličine uzorak biopsije dobivene su iz želučanog adenokarcinoma tkiva od 20 bolesnika podvrgnutih dijagnostičku endoskopiju i endoskopske submukozalnim disekcije u Nacionalnom centru raka u Koreji, nakon dobivanja pisane informirani pristanak. Uzorci tkiva su zamrznuti u tekućem dušiku pri -70 ° C neposredno nakon biopsije do upotrebe. Neke od uzoraka tkiva su paraffindized za imunohistokemijskim studijama, prema potrebi. Ove studije su odobreni od strane Institutional Review Board of National Cancer Center (# NCCNSH 03-024). Pregled

Kultura stanica i siRNA transfekcija

umjereno se razlikuju ljudski adenokarcinom stanične linije karcinoma želuca, AGS, MKN- 28 SNU-638 su dobiveni iz Koreje Cell Line banke i održavane su prema ranijem [35] opisano. siRNA koristi u transfekcijama, svi nabavljeni su od Invitrogen (Carlsbad, CA). Njihove sekvence su galektin-3 (LGAL3) siRNA; 5'-AUAUGAAGCACUGGUGAGGUCUAUG-3 ', 1-PAR siRNA; 5'-CCCAUCUGUGUACACCGGAGUGUUU-3 ', i MMP-1 siRNA; 5'-GGAGAAAUAGUGGCCCAGUGGUUGA-3 '. Transfekcije provedene su pomoću Lipofectamine RNAiMAX reagensa (Invitrogen) prema uputama proizvođača. Indukcija prolazne galektin-3 pojačanom ekspresijom u SNU-638 stanica postiže korištenjem pcDNA3.1 /NT-galektin-3 s pcDNA3.1 /NT-GFP. Za liječenje normalizacijsku kontrolu, želučani stanične linije raka bili su liječeni s 1 ug do LTX reagensa (Invitrogen). Pregled

Izolacija RNA i RT-PCR analiza pregled

Ukupna RNA je izolirana iz humanih stanica raka želuca a uzorci pacijenata tkiva, pomoću Trizol reagensa (Invitrogen) prema uputama proizvođača. Reverzne transkriptaze PCR je proveden pomoću Reverse sustava Transkripcija (Promega Corp. SAD), prema uputama proizvođača. korištene su početnice: 5'-ATGGCAGACAATTTTTCGCTCC-3 '(smislena) i 5'-ATGTCACCAGAAATTCCCAGTT-3' (anti-sense) za humani LGAL3 (galektin-3) gena; 5'-CCAAAACTGAGCATAAGTCC-3 '(osjećaj) i 5-AGGATGGAGCAAATGTAGTG-3' (anti-sense) za ljudsku F2R (PAR-1) gena; 5'-ACAGCTTCCCAGCGACTCTA-3 '(smislena) i 5'-CAGGGTTTCAGCATCTGGTT-3' (anti-sense) za ljudski MMP-1 gena; 5'-CTCGAACTTTGACAGCGACA-3 '(smislena) i 5'-GCCATTCACGTCGTCCTTAT-3' (anti-sense) za ljudski MMP-9 gena; 5'-AGCCTCGCCTTTGCCGA-3 '(smislena) i 5'-CTGGTGCCTGGGGCG-3' (anti-sense) za humani gen P-aktin; 5'-GGCTGCTTTTAACTCTGGTA-3 '(smislena) i 5'-ACTTGATTTTGGAGGGATCT-3' (anti-sense) za humani gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH). PCR je izvedena u volumenu od 20 ul primjenom Ex Taq (Takara). Amplifikacije ciklus (denaturacije na 95 ° C tijekom 1 minute, sljepljivanja 60 ° C tijekom 1 minute i ekstenzije koraka na 72 ° C tijekom 2 minute) se ponavlja 32 puta, nakon čega slijedi konačno proširenje 10 minuta pri 72 ° C. Pregled

Izgradnja galektin-3 izražavanje Lenti-virusni vektor i zarazu pregled

pune dužine humanog galektin-3 izražavanja izgraditi pcDNA3.1-NT-GFP-gal3, pcDNA3.1-NT-GFP vektor i Lenti-virusni vektor dovedene da prekomjerno eksprimiraju LacZ, galektin-3 (1-250) u pLL3.7 je prethodno opisano [2]. Ljudski F2R se klonira u pLECE3 u BamH1 i Not1 restrikcijskih mjesta enzima, stvarajući pLECE3-F2R (PAR-1) izgraditi. Kompletni cDNAs F2R, MMP-1, i kontrole mRFP se koristiti za PCR amplifikaciju, uz primerima navedene u Data S1 i Rezultirajući PCR fragmenti su klonirani u pLECE3 vektor pomoću Pac1 i Hpa1 restrikcijska mjesta, stvarajući pLECE3 -MMP-1 konstrukt. Također, mRFP lokalitet pGEM-T-Easy vektor je prebačeno na pLL3.7 vektora zamjenjuje GFP regiju pomoću AGE1 i EcoR1 mjesta restrikcijskih enzima, kako bi pLL3.7-mRFP. Lenti-viralna proizvodnja vektor je opisano ranije, [2] pregled

Western blot analiza pregled

stanični lizat ekstrakti su pripravljeni s RIPA puferom (1% NP-40,. 0,1% natrij dodecil sulfata, 0,5 % desoxycholate; 150 mM NaCl; 50 mM Tris, pH 7.5) i proteaze inhibiter koktel. 20 ug ukupnog proteina svakog lizata je otopljeno u 8-12% SDS PAGE gelovima i elektro-preneseni na PVDF membrane u i potom blokira 5% obranog mlijeka u 0.05% Tween-20 sa 1 × PBS (PBST). Poliklonska primarnih antitijela, anti-galektin-3, anti-ThrombinR (PAR-1), anti-c-Jun, anti-fra-1 i anti-β-aktin (Santa Cruz), anti-MMP1 (Calbiochem), anti- paxillin i anti-fosfo paxillin (pY181) (Epitomics) su inkubirani s mrlja na 1:1000 razrjeđenje u minimalnim količinama od 5% BSA (goveđi serum albumin) u puferu PBST za 1 sat sobnoj temperaturi ili preko noći na 4 ° C. Anti-mišji ili anti-zečje koza-HRP konjugirani sekundarnih antitijela (GE Healthcare UK Limited) se inkubiraju pri 1:5000 razrjeđenju 5% BSA u puferu PBST 1,5 sata na sobnoj temperaturi. Proteini od interesa su detektirane pojačanom kemiluminescencijom (ECL) (Amersham Corp, Arlington Heights, IL, USA). Pregled

Imunoprecipitacija pregled

stanični lizat ekstrakti su bili pripremljeni sa IP puferom (+ 20 mM Hepes, 1 % Triton X-100, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 100 mM NaF, 10 mM natrijev pirofosfat, 1 mM natrijevog ortovanadata, 0,2 mM PMSF, 10 ug /ml proteaze koktela inhibitora) na ledu kroz 30 minuta. Nakon uklanjanja ostataka pomoću centrifugiranja (13200 rpm na 4 ° C u trajanju od 20 minuta), supernatanti su podvrgnute preclearing fazi s protein A /G zrnca agaroze na 4 ° C tijekom 30 minuta u rotoru. Supernatanti su dobiveni nakon kratkog centrifugiranja (2000 rpm na 4 ° C kroz 4 min) su bili podvrgnuti imunoprecipitaciji korištenjem anti-galectin3 u uobičajenom IgG-a (negativna kontrola). Imunoprecipitati se ispiru dva puta u IP- puferu (20 mM Hepes, 1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 100 mM NaF, 10 mM natrijev pirofosfat). Nakon 30 jal 2 × SDS-uzorak za dodavanje pufera, nakon čega slijedi grijanje na temperaturi 95 ° C tijekom 5 minuta. Nakon supernatant dobiven nakon kratkog centrifugiranja, njihovi proteinski razinama su određena kroz Western blot analize izvode. Pregled

Imunohistokem pregled

Za galektin-3 i PAR-1 imunohistokemijski, deparafmizirane dijelove tkiva želučane oboljelima od raka su ostavljene u mikrovalnoj pećnici tijekom 15 minuta, u citratnom puferu (Vector Laboratories), i zatim inkubirane s 3% H _{2O 2 15 minuta radi blokiranja endogene peroksidaze, a zatim inkubiranjem s 10% normalnom kozjem serumu (Vector laboratorija) u 1 × PBS tijekom 10 minuta. Primarni antitijela su koristili anti-galektin-3 (1:200) anti-MMP1 (Epitomics) i anti-PAR-1 (1:200) protutijela (Santa Cruz), a sljedeći korak je učinjeno u skladu s uputama Vectastain®ABC opreme (Vector Laboratories). Produkti su vizualizirani diaminobenzidin (DAB) kits (Vector Laboratories). Pregled}

želatinske zimografije pregled

Kondicionirani mediji dobiveni su iz kultura MKN-28 stanične linije karcinoma želuca i koncentrirana primjenom vivaspin 6 (Sartorius ). Supernatanti su koncentrirane u 6 × Foz puferu su odvojeni na 10% SDS gelu koji sadrži 1 mg /ml želatine. Svaki je inkubiran u 100 ml zimografiia reakcijskog pufera i obojeni s Bio-siguran ™ coomassie G-250 (Bio-Rad Laboratories). Nakon destaining, oštri prozirne trake ukazuju Želatinolitička aktivnost su vizualizirani na plavoj pozadini. Pregled

Transfilter migraciju i invaziju testovi pregled

Za migracija transfilter i invazije testa koristili smo MKN-28 i SNU-638 Stanice. Stanice su transficirane s iRNK 1 dan, izolirani i doda u gornjim komorama pore umeće transjažična s kolagenu tipa l (BD bioznanosti) prevučene filtri testa migracije i Matrigel (BD Bioscience) obložena filtera, na pokusima invazije. RPMI 1640 s 10% FBS i 1% antibiotika (Gibco) je dodan u donjoj komori i zatim se inkubira 20 sati. Migracije i invazivnih stanica kvantificirane su nakon H &E bojenjem. Svaki eksperiment je proveden u tri podaci prikazani kao srednje vrijednosti. Pregled

kromatina imunoprecipitacijski testovi pregled

kromatina imunoprecipitacije (Chip) Testovi su provedeni upotrebom garniture Chip testu (Millipore). Uzorci su naneseni na posuđu nakon galektin-3 siRNA liječenje i pokusi su provedeni u skladu s uputama proizvođača. Anti-galektin-3, anti-c-Jun, anti-fra-1 i normalni miš /zečji IgG su korišteni za Imunoprecipitat kompleksa DNA sadrži. Prije PCR primeri su pripravljeni na AP-1 s PAR-1 promotora veznih mjesta -666 (5'-CACTGT CGACGTCTCCACAT-3 ') i PAR-1 promotora mjesto -307 (5'-GGGCCTAGAAGTCCAA ATGA-3'). PCRjeizvedenas bivši TAQ (Takara). Pregled

Luciferaze testovi pregled

AP-1 Reporterski plazmid koji je dobiven od dr Sung-PIL Yoon Nacionalnog centra raka u Koreji i studije učinaka galektin-3 na AP-1 transkripcije aktivnosti u lacZ i galektin-3 pretjerano izražavanje stanice su provedena u skladu s prethodnom izvješću [2]. Nakon 48 sati, stanice su sakupljene, a aktivnost luciferaze je mjerena korištenjem sustava za procjenu luciferaze (Promega) prema uputama proizvođača. Svaki pokus je proveden u tri primjerka i podaci prikazani kao srednje vrijednosti pregled

migracija stanica test pomoću zebraste ribice modela

transgena zebraste ribice linija Tg (kdrl: EGFP). ^{s843 pregled, [24], u kojoj EGFP je posebno izraženo u krvnim žilama, što se održava u skladu s prihvaćenim standardnim operativnim postupcima [36] odobren od strane njega i uporaba odbora institucionalna životinja na National Cancer Center u Koreji; Broj dozvola: NCC 11-116. Dobili smo zebra-ribe embrija iz Nacionalnog centra rak zebraste ribice aqua-sobu. Transplantacija stanica raka je izveden prema Nicoli et al [37] uz male modifikacije. Ukratko, dechorionated embriji se anestezira tricaine (Sigma) i stanice raka su injektirani (150 do 200 po embrija) u središtima embrionalnih žumanjka vrećice na 48 HPF (sati nakon oplodnje) pomoću mikromanipulatora (Narishige) i pneumatskim Picopump (WPI ) opremljena borosilikatnog stakla iglom. Embriji su se održavale nakon postupcima transplantacije i ispitani su za migraciju stanica raka fluorescentnim mikroskopom. Za snimanje, embriji i ličinke se tretira s N-feniltiourea (Sigma) sa 12 HPF za sprečavanje pigmentacije i ispitani fluorescentnom invertiranog mikroskopa (Zeiss Carl) pod epifluorescentnim optike. Fluorescentne slike su snimljene CCD kamerom (Carl Zeiss). Stabilni fluorescentne želučani stanične linije AGS (mRFP) su generirani od strane Lenti-virus infekcije s pLL3.7-mRFP slijedi FACS sortiranje. Pregled}

Microarray analiza podataka pregled

Microarray je izvedena u AGS, raka želuca stanična linija nakon utišavanje od galektin-3 kao što je opisano ranije [6]. Rezultati microarray prenesene su na GEO (GSE29630). pregled

Statistika analiza pregled

Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD od najmanje 5-10 slika dobivenih od tri neovisna pokusa pomoću mikroskopa (× 100, × 200), ako nije drugačije naznačeno. Statistička analiza je provedena jednosmjerna ANOVA testom korištenjem Prism softvera. Podaci smatra važnom, ako p pregled. ≪ 0,05 pregled

popratne podatke
Slika S1. pregled ušutkao galektin-3 sa siRNA u želučani stanice raka do promjena u staničnoj pokretljivosti povezanih gena. A među DNA analize mikropolja, odabrali smo pokretljivost stanica srodnih genu MMP-1, MMP-3, FSCN1 (Fascin-1), F2R (PAR-1), TIMP-2 SERPINE1 (PAI-1) i pokazuje puta omjer promjene , B Otkrivanje mRNA ekspresije MMP-1, MMP-3, FSCN1 (Fascin-1), F2R (PAR-1), TIMP-2 SERPINE1 (PAI-1) uz pomoću PCR. β-aktin je korišten kao normalizacijsku kontrolu
doi:. 10.1371 /journal.pone.0025103.s001
(TIF)
Slika S2.
broj zebraste ribice embrij iseljene omjer stanica. Otkrivanje raka želuca stanica AGS (RFP) brojeva nakon presadili od AGS (RFP) u zebraste ribice ribe embrija s liječenja specifične siRNA (galektin-3, MMP-1 i PAR-1) s negativna kontrola scRNA (slika 5A-B). To su pokazali brojne iseljene stanica po embyos se broje i prikazani kao postotak pregled doi:. 10,1371 /journal.pone.0025103.s002 pregled (TIF) pregled slika S3. pregled RT-PCR analiza na razini mRNA galektin-3, MMP-1 i PAR-1 u bolesnika s karcinomom želuca.

• PLoS ONE: Tumor-Log Tečajevi pozitivnih limfnih čvorova-Metastaza inscenacije sustav, obećavajući novi inscenacije sustav za rak želuca nakon D2 resekcije u China
• PLoS ONE: Honokiol inducira kalpain posredovani reguliran glukozom Protein-94 odcjepljenja i apoptozu u ljudskim stanicama raka želuca i smanjuje tumorske Growth