PLOS ONE: MUC4 y MUC1 expresión en Adenocarcinoma de estómago se correlaciona con la invasión de buques y metástasis de ganglios linfáticos: un estudio inmunohistoquímico de las primeras gástrico Cancer

Extracto

Hemos informado anteriormente que la expresión MUC4 es un factor de mal pronóstico en varios carcinomas. Nuestro estudio anterior también mostró que la expresión de MUC1 en el cáncer gástrico, incluidas las etapas tempranas y avanzadas es un factor de mal pronóstico. En el presente estudio, los perfiles de expresión de MUC4 y MUC1 fueron examinados por inmunohistoquímica (IHC) utilizando dos anticuerpos monoclonales anti-MUC4 (MAb), 8G7 y 1G8, y anti-MUC1 MAb DF3 en 104 especímenes de gastrectomía de adenocarcinoma gástrico temprano con submucosa invasión (pT1b2), incluyendo 197 lesiones subtipo histológico. Antes del estudio IHC de los especímenes humanos, se evaluó la especificidad de los dos MAbs por Western Blot y IHC de dos mRNA MUC4 que expresan líneas celulares de cáncer gástrico. MAb 8G7 reacciona claramente, mientras que MAb 1G8 no mostró ninguna reactividad, o bien en transferencia de Western o IHC. En la IHC de los cánceres gástricos, las tasas de expresión de MUC4 /8G7 detectadas por MAb 8G7, MUC4 /1G8 detectadas por MAb 1G8 y MUC1 /DF3 detectadas por MAb DF3 en los tipos bien diferenciados (70%, 38/54; 67%, 36/54; 52%, 28/54) fueron significativamente más altos que los tipos en mal diferenciados (18%, 10/55; 36%, 20/55; 13%, 7/55) ( P
< 0,0001; P = 0,0021
; P Hotel < 0,0001), respectivamente. La expresión MUC4 /8G7 estaba relacionado con la invasión linfática (r = 0,304, P = 0,033
). Por otro lado, la expresión MUC4 /1G8 se relaciona con invasión linfática (r = 0,395, P
= 0,001) y metástasis de ganglios linfáticos (r = 0,296, P
= 0,045). La expresión de MUC1 /D F3 estaba relacionado con la invasión linfática (r = 0,357, P = 0,032
) y la invasión venosa (r = 0,377, P = 0,024
). En conclusión, la expresión de MUC4, así como MUC1 en el cáncer gástrico temprano es un marcador útil para predecir factores de mal pronóstico relacionados con la invasión de vasos

Visto:. Tamura Y, M Higashi, Kitamoto S, S Yokoyama, Osako M, Horinouchi M, et al. (2012) MUC4 y MUC1 expresión en Adenocarcinoma de estómago se correlaciona con la invasión de buques y metástasis de ganglios linfáticos: un estudio inmunohistoquímico del cáncer gástrico precoz. PLoS ONE 7 (11): e49251. doi: 10.1371 /journal.pone.0049251

Editor: H. Fazlul Sarkar, Wayne Facultad de Medicina de la Universidad del Estado, Estados Unidos de América

Recibido: 17 Agosto, 2012; Aceptado: 5 Octubre de 2012; Publicado: 13 Noviembre 2012

Derechos de Autor © 2012 Tamura et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este estudio fue apoyado en parte por Princes Cancer Research Fund Takamatsu a S. Yonezawa; Subvenciones-en-Ayudas a la Investigación Científica de la Investigación Científica (B) 23.390.085 a S. Yonezawa; Investigación Científica (C) 21590399 para M. Higashi; Los científicos jóvenes (B) 24701008 a S. Yokoyama; La investigación científica en las áreas prioritarias 239349 a S. Kitamoto (JSP Fellowship) del Ministerio de Educación, Ciencia, Deportes, Cultura y Tecnología, Japón; una Fundación de Investigación del páncreas Japón para S. Yokoyama; y la Fundación Memorial Kodama, Japón, para M. Higashi. S. Batra es apoyado en parte por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones CA78590 (, CA163120, CA133944 y CA111294). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. No se recibió financiación externa adicional para este estudio

Conflicto de intereses:.. Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses en relación con el trabajo en el estudio

Introducción

El cáncer gástrico es el cuarto cáncer más común en todo el mundo y más de 90% de los cánceres gástricos son adenocarcinomas [1]. Recientemente, en Japón, la detección temprana por el examen endoscópico de rutina en las clínicas de gastroenterología ha dado como resultado diagnósticos precisos y tratamientos quirúrgicos o endoscópicos eficaces, lo que resulta en un tiempo relativamente mejor pronóstico. En el análisis de 11.261 pacientes con cáncer gástrico tratados con resección gástrica, la TNM tasa de supervivencia a 5 años para la etapa IA fue del 91,8% y para la fase IB la tasa de supervivencia fue del 84,6% [2]. Para los cánceres gástricos tempranos, una disección endoscópica de la submucosa (ESD) es el tratamiento de primera elección en Japón, pero los criterios de la cirugía adicional, incluyendo la disección de los ganglios linfáticos después de la EDS están siendo controvertida [3].

Nuestra serie de inmunohistoquímica (IHC) estudios de expresión de mucina en diversos neoplasmas humanos han demostrado que la expresión de la mucina MUC1 (pan-epitelial mucina asociada a la membrana) está relacionada con la proliferación invasiva de los tumores y los pobres resultados de los pacientes, mientras que la expresión de MUC2 la mucina (tipo intestinal secretora de mucina) está relacionada con la proliferación no invasiva de los tumores y un resultado favorable para los pacientes [4], [5]. Nuestro estudio anterior mostró que la expresión de MUC1 en el cáncer gástrico es un factor de mal pronóstico [6].

MUC4 se informó por primera vez como mucina traqueobronquial [7] y es una mucina asociada a la membrana [8]. En nuestra serie de estudios, la expresión de MUC4 en colangiocarcinoma intrahepático, adenocarcinoma ductal pancreático, carcinoma de las vías biliares extrahepáticas, adenocarcinoma de pulmón y carcinoma de células escamosas oral fue un factor independiente de mal pronóstico y es un marcador útil para predecir el resultado de los pacientes [ ,,,0],5], [9], [10], [11], [12], [13]. Por desgracia, hay pocos estudios sobre el perfil de expresión MUC4 en el cáncer gástrico humano. En el presente estudio se analizaron los perfiles de expresión de MUC4, así como MUC1 en los primeros tejidos de cáncer gástrico, y se encontró que MUC4 y MUC1 expresión en los cánceres gástricos tempranos se convertiría en factores de mal pronóstico por invasión de vasos linfáticos, invasión de vasos sanguíneos y los ganglios linfáticos metástasis
.

a medida que se conocen anticuerpos monoclonales anti-MUC4 (MAb), 8G7 y 1G8, para detectar diferentes sitios de la molécula MUC4. El MAb 8G7 reconoce una secuencia de repetición en tándem (STGDTTPLPVTDTSSV) de la subunidad MUC4α humana [14]. El MAb 1G8 se eleva contra la secuencia de rata (rata ASGP-2), y reconoce un epítopo en la rata ASGP-2 de la subunidad, que corresponde a la subunidad MUC4β humano, y muestra una reactividad cruzada con muestras humanas [15]. Por lo tanto, se ha prestado una especial atención a la comparación de dos MAbs anti-MUC4 por Western Blot y IHC de dos líneas celulares de cáncer gástrico, antes del estudio IHC de los tejidos de cáncer gástrico humano. Por otra parte, ya que no hay controversia en cuanto a la importancia pronóstica de estos anticuerpos monoclonales anti-MUC4, una revisión de la literatura de expresión MUC4 en varios tipos de cáncer también se realizó.

Materiales y Métodos

Pacientes y muestras de tejidos

Gastrectomía especímenes de 104 cánceres gástricos tempranos, que muestran la invasión submucosa, pT1b2, con o sin metástasis en los ganglios linfáticos, se recuperaron del archivo entre 1994 y 2008 de la Asociación médica del hospital de Kagoshima-shi. La edad media de los pacientes fue de 65,7 (S. D., 9,8; rango, 39-92 años; edad media, 66 años); 64 casos eran varones y 40 casos eran mujeres. Este estudio se realizó de conformidad con los principios rectores de la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital de Kagoshima-shi Medical Association (KMAH 2011-02-02). Consentimiento informado por escrito se obtuvo de todos los pacientes. En los casos con más de dos tipos histológicos mezclados en una lesión, cada patrón histológico fue evaluada de forma independiente, de acuerdo con la Clasificación japonesa de carcinoma gástrico (JCGC) [16].

Evaluación de anticuerpos monoclonales para MUC4

células y condiciones de cultivo.

líneas celulares de cáncer gástrico humano líneas celulares de cáncer de páncreas se adquirieron de la American Type Culture Collection (Panc1 y CAPAN1) ((SNU-16 y NCI-N87) y Manassas, VIRGINIA). Tanto las células de cáncer gástrico se mantuvieron en RPMI-1640 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO); células Panc1 se mantuvieron en DMEM (Sigma-Aldrich); células Capan1 se mantuvieron en DMEM /F-12 (Sigma-Aldrich). Todos los medios se complementaron con 10% de suero bovino fetal (GIBCO, Breda, Países Bajos) y 100 U /ml de penicilina /100 mg /ml de estreptomicina (Sigma-Aldrich). Todas las células se incubaron en 5% de CO2 a 37 ° C y se mantienen a niveles sub-confluente.

La extracción de RNA y RT-PCR.

El ARN total se extrajo de las células utilizando el RNeasy mini kit (Qiagen, Hilden, Alemania) y se cuantifica por NanoDrop espectrofotómetro ND-1000. El ARNm obtenido (2 ug) se transcribió de forma inversa en ADNc con el Alto RNA Capacidad de kit cDNA (Applied Biosystems, Foster City, CA). Los siguientes cebadores se diseñaron para la posterior PCR: MUC4, 5'-TGGGACGATGCTGACTTCTC-3 ', 5'-CCCCGTTGTTTGTCATCTTTC-3'; ACTB, 5'-CTCTTCCAGCCTTCCTTCCTG-3 ', 5'-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3'. PCR se realizó con los AmpliTaq Gold Fast PCR Master Mix (Applied Biosystems) siguiendo el protocolo del fabricante.

extracción de proteínas y Western Blot.

lisados ​​de células totales se prepararon usando tampón RIPA que contiene cóctel inhibidor de proteasa (Nacalai Tesque, Kyoto, Japón). La concentración de proteínas se midió por el ensayo de BCA (Thermo Scientific, Rockford, IL). Una cantidad igual de lisado de proteína se resolvió en 2% de gel de agarosa que contiene SDS y pasivamente transferida a una membrana de PVDF durante la noche a temperatura ambiente. Las membranas se bloquearon con 1% de leche descremada /PBST durante 2 horas y se sometieron al procedimiento de inmunodetección estándar usando anticuerpos primarios específicos. Los anticuerpos primarios son las siguientes: anti-humano MUC4 MAb 8G7 (1:1000, generada por el Dr. Surinder K. Batra, Universidad de Nebraska Medical Center, Omaha, NE) y 1G8 (1:1000, comprado a Invitrogen, Camarillo, CA), y anti-humana a-tubulina MAb DM1A (1:2,000, Sigma-Aldrich).

la inmunocitoquímica para las células cultivadas.

para la tinción MUC4 en células cultivadas, las células fueron sembradas en portaobjetos de 8 cámaras (Becton Dickinson and Company, lagos Franklin, NJ) y se incubaron durante la noche. Las células se fijaron con 3,7% de formaldehído durante 10 minutos a temperatura ambiente y se tiñeron con MAb 8G7 (1:24,000) y MAb 1G8 (1:4,000) durante la noche a 4 ° C, respectivamente. la detección de la señal se realizó por un método de inmunoperoxidasa usando un kit de Vectastain Elite ABC (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) según las instrucciones del fabricante.

Inmunohistoquímica para tejidos humanos

IHC para los humanos carcinomas gástricos se realizó utilizando los siguientes anticuerpos en secciones de corte máximo en cada tumor. MUC4 fue detectada por dos MAbs, 8G7 y 1G8. Para el estudio comparativo, la expresión de MUC1 también fue examinado por el anticuerpo monoclonal DF3 (IgG de ratón, TFB, Tokio, Japón). IHC se realizó por el método de la inmunoperoxidasa como sigue. La recuperación del antígeno se realizó mediante el antígeno CC1 tampón de recuperación (pH 8,5 EDTA, 10037 ° C, 30 min., Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) para todas las secciones. Después de la incubación con los anticuerpos primarios (MAb MUC4 /8G7 diluyó 1:3000, 37 ° C, 32 min .; MAb MUC4 /1G8 diluyó 1:500, 37 ° C, 24 min .; MAb MUC1 /DF3 diluyó 1:50, 37 ° C, 32 min.) en solución salina tamponada con fosfato pH 7,4 (PBS) con 1% de albúmina de suero bovino, las secciones se tiñeron en una XT automatizado de tinción de portaobjetos Benchmark utilizando un kit de detección de diaminobencidina (DAB ultraView, Ventana Medical Systems). Para simplificar, MUC4 /8G7, MUC4 /1G8 y MUC1 /D F3 se utilizan para indicar los antígenos de mucina detectados por cada anticuerpo.

La puntuación de los resultados y el análisis estadístico.

Cuatro cegado investigadores ( YT, MH, MG y SY) evaluaron los datos de tinción IHC de forma independiente. Cuando la evaluación fue diferente entre los cuatro, la decisión final se tomó por consenso. Los resultados fueron evaluados con base en el porcentaje de células de carcinoma teñidas positivamente, y los datos porcentuales se clasificaron en seis grados utilizando el sistema de puntuación siguiente: negativo, ninguna de las células de carcinoma manchadas; débil, < 5% de las células de carcinoma manchadas; 1+, ≥5% a < 25%; 2+, ≥25% a < 50%; 3+, ≥50% a < 75%; y 4+: ≥75% teñido. Los casos con ≥5% de las células de carcinoma teñidas fueron considerados positivos. El análisis estadístico se realizó mediante métodos no paramétricos utilizando Excel-Estadística de software ver.3 generada por Hisae Yanai, Facultad de Ciencias, Universidad de Saitama (OMS Publishing, Japón)
.

La supervivencia de los pacientes se comparó entre el grupo con positivo MUC4 /8G7, MUC4 /1G8 o MUC1 /DF3 expresión y el grupo con expresión negativa según el método de Kaplan-Meier, y las diferencias entre las curvas de supervivencia se analizaron utilizando la prueba de log-rank. Una probabilidad de P < 0,05 se consideró estadísticamente significativa

Resultados

Evaluación de dos anticuerpos monoclonales para MUC4

Para investigar la diferencia en la especificidad de anticuerpos entre 8G7 y 1G8, nosotros también. llevó a cabo RT-PCR, transferencia de Western y el análisis IHC usando dos líneas celulares de cáncer gástrico, SNU-16 y NCI-N87 células. El ARNm MUC4 se detectó en las dos líneas celulares de cáncer gástrico (Fig. 1A). En consonancia con el informe anterior [14], nuestros datos muestran que 8G7 reconoce una proteína de muy alto peso molecular (más de 500 kD, que era del tamaño esperado para MUC4 nativo). Por el contrario, 1G8 no muestra bandas inmunorreactivas (Fig. 1B). El mismo resultado se observó en el análisis IHC (Fig. 1C).

tinción inmunohistoquímica de muestras Gastrectomía

La tinción inmunohistoquímica de la mucosa gástrica no neoplásica.

En la no mucosa -neoplastic de los casos con cáncer gástrico, MUC4 /8G7 se expresa a veces en el citoplasma de epitelio mucosa de superficie, y con frecuencia, pero débilmente en el citoplasma de las glándulas fúndicas y pilórica (Figura S1 a y D). MUC4 /1G8 se expresó con frecuencia en el ápice celular y el citoplasma del epitelio mucoso de la superficie, y con frecuencia, pero débilmente en el citoplasma de las glándulas fúndicas y pilórica (Figura S1 B y E), y se observó constantemente en el endotelio vascular. MUC1 /DF3 se expresa a veces en el epitelio mucosa de superficie, y siempre en las glándulas fúndicas (particularmente intensamente en los vértices de células), pero no en las glándulas pilórica (Figura S1 C y F).

tinción inmunohistoquímica de adenocarcinoma gástrico.

se examinaron muestras de gastrectomía de 104 tipos de cáncer gástrico precoz (pT1b2), ya que querían evitar los grandes cambios degenerativos que se observan con frecuencia en los tejidos con cáncer avanzado, y para ajustar el escenario para la comparación exacta entre resultados de IHC y los factores clínico-patológicos.

Cuando más de dos tipos histológicos se mezclaron en una lesión en las muestras de gastrectomía de 104 cánceres gástricos tempranos, cada patrón histológico fue evaluada de forma independiente, de acuerdo con la JCGC [16]. Por lo tanto, en las muestras de gastrectomía 104, podríamos evaluar 197 carcinoma focos de varios tipos histológicos en total
.

Entre los 197 lesiones, había 15 lesiones de adenocarcinoma papilar (PAP) (Figs. 2A-D), 39 de adenocarcinoma tubular bien diferenciado (tub1) (Figs. 2E-H), 52 de adenocarcinoma tubular moderadamente diferenciado (tub2) (Figs. 2I-L), 6 de los carcinomas mucinosos (MUC) (Figs. 2 M-P), 8 de tipo sólido adenocarcinoma pobremente diferenciado (POR1) (Fig. 2T-T), 47 de tipo no sólido adenocarcinoma pobremente diferenciado (por2) (Fig. 2U-X) y 30 de carcinoma de células en anillo de sello (SIG) (Figs. 2Y-b), basado en el contexto de la clasificación histológica común de cáncer gástrico en JCGC [16]. De acuerdo con el contexto en la clasificación de la OMS de los tumores del estómago [17], así como que, en JCGC [16], pap y tub1 se clasificaron en "adenocarcinoma bien diferenciado", y POR1 y por2 se clasificaron en "pobremente diferenciado adenocarcinoma ". Los datos de la tasa de expresión de MUC4 /8G7, MUC4 /1G8 y MUC1 /D F3 se resumen en la figura 3. El número detallado y porcentaje de células neoplásicas con tinción positiva utilizando el sistema de puntuación se resume en la Tabla S1.

perfil de expresión de MUC4 /8G7.

Entre las 197 lesiones de adenocarcinoma, MUC4 /8G7 se expresó en 83 lesiones (42%). MUC4 /8G7 mostró una tasa significativamente mayor de la expresión positiva (≥5% de las células de carcinoma manchada) en tipos bien diferenciados (pap + tub1: 70%, 38/54) que la de los tipos pobremente diferenciados (POR1 + por2: 18% , 10/55) ( P Hotel < 0,0001) (figura 3A, flechas).. MUC4 /8G7 se expresó principalmente en el citoplasma de las células neoplásicas de Papanicolaou (Fig. 2B), tub1 (Fig. 2F) y tub2 (Fig. 2J), en los casos con expresión positiva.

Perfil de Expresión de MUC4 /1G8.

Entre los 197 lesiones de adenocarcinoma, MUC4 /1G8 se expresó en 95 lesiones (48%). MUC4 /1G8 mostraron tasas significativamente mayores de la expresión positiva en tipos bien diferenciados (PAP + tub1: 67%, 36/54) que en mal tipos diferenciados (POR1 + por2: 36%, 20/55) ( P
= 0,0021) (Fig. 3B, flechas). MUC4 /1G8 se expresó principalmente en los vértices de células de papilla (Fig. 2C), tub1 (Figs. 2G) y tub2 (Fig. 2C), o en la sustancia mucina intracitoplasmática de sig (Fig. 2a), en los casos con expresión positiva.

perfil de expresión de MUC1 /D F3.

Entre las 197 lesiones de adenocarcinoma, MUC1 /D F3 se expresó en 62 lesiones (31%). MUC1 /D F3 mostraron tasas significativamente más altas de la expresión positiva en tipos bien diferenciados (PAP + tub1: 52%, 28/54) que la de los tipos pobremente diferenciados (POR1 + por2: 13%, 7/55) ( P
< 0,0001) (Fig 3C, flechas).. MUC1 /D F3 se expresó principalmente en los vértices de células de papilla, tub1 y tub2 (Fig. 2L), en los casos con expresión positiva.

Comparación de la expresión de mucina en cada tipo histológico.

en tub1, las tasas de expresión de MUC4 /8G7 y MUC4 /1G8 fueron significativamente mayores que la de MUC1 /DF3 ( P
= 0,0106 y P
= 0,039, respectivamente) (Fig. 3, * 1). En por2, la tasa de expresión de MUC4 /1G8 fue significativamente mayor que la de MUC4 /8G7 ( P
= 0,0286) o la de MUC1 /DF3 ( P
= 0,0005) (Fig. 3, * 2). En sig, tasa de expresión de MUC4 /1G8 fue significativamente mayor que la de MUC4 /8G7 ( P
= 0,0158) o la de MUC1 /DF3 (sig, P
= 0,0019) (Fig . 3, * 3). En los otros tipos histolgical (PAP, tub2, muc y POR1), no hubo diferencias significativas en las tasas de expresión entre MUC4 /8G7, MUC4 /1G8 y MUC1 /D F3 (Fig. 3).

Relación entre el MUC4 o MUC1 expresión y la invasión de vasos linfáticos, invasión de vasos sanguíneos y la metástasis en ganglios linfáticos.

evaluación semicuantitativa de invasión linfática (ly), invasión venosa (v) y el estado de la metástasis de ganglios linfáticos (N) se define en el JCGC [dieciséis]. invasión linfática (Ly) se evaluó de la siguiente manera; ly0, sin invasión linfática; ly1, mínima invasión linfática; LY2, invasión linfática moderada; y LY3, marcada invasión linfática. Para la invasión venosa (v), evaluación similar (v0 a v3) se realizó mediante tinción elástica (Victoria-Blue) que se añadió a la tinción con hematoxilina-eosina. El número total de ganglios linfáticos y el número de ganglios linfáticos afectados en cada estación ganglionar (N) se registraron de la siguiente manera; N0, sin metástasis en los ganglios linfáticos regionales; N1, metástasis en 1-2 ganglios linfáticos regionales; y N2, metástasis en 3-6 ganglios linfáticos regionales. Se observó metástasis en ganglios linfáticos regionales en 55 pacientes (N1, N2; 41 casos, 14 casos). No hubo correlación significativa entre los tipos histológicos e invasión linfática, invasión venosa o el estado de los ganglios linfáticos metástasis.

En cada caso, la puntuación más alta de los seis grados de IHC (negativa, débil, 1+, 2+, 3+ o 4+) en los diferentes tipos histológicos se contó como la puntuación de IHC en cada individuo, por ejemplo, "Puntuación de IHC 4+" para un caso con [puntuación tub1, 3+; El marcador tub2, 4+]. Se evaluó la correlación entre la puntuación de IHC y la mente, y los factores V N en cada paciente. Como se muestra en la Tabla 1, la expresión MUC4 /8G7 estaba relacionado con la invasión linfática (r = 0,304, P = 0,033
). La expresión MUC4 /1G8 estaba relacionado con la invasión linfática (r = 0,395, P
= 0,001) y metástasis en los ganglios linfáticos (r = 0,296, P = 0,045
). La expresión de MUC1 /D F3 estaba relacionado con la invasión linfática (r = 0,357, P = 0,032
) y la invasión venosa (r = 0,377, P = 0,024
).

Además, se analizó la correlación entre los resultados de IHC MUC4 /8G7, MUC4 /1G8 y MUC1 /D F3. Como se muestra en la Tabla 2, se observó una correlación entre la puntuación MUC4 /8G7 y la puntuación MUC4 /1G8 (r = 0,486, P Hotel < 0,0001). En contraste, no hubo correlación entre la puntuación MUC4 /8G7 y la puntuación de MUC1 /D F3 (r = 0,267, P = 0,202
), y no hubo correlación entre la puntuación MUC4 /1G8 y la puntuación de MUC1 /D F3 (r = 0,245, P = 0,269
).

Relación entre MUC4 o MUC1 expresión y la supervivencia.

entre los 104 pacientes, el seguimiento de los datos obtenidos fue de 87 pacientes. La mediana de tiempo de seguimiento fue de 47,5 meses (rango, 0-193 meses). En los 87 pacientes, un paciente murió del carcinoma gástrico 39 meses después de la cirugía, un paciente mostró metástasis en el hígado, pero sobrevivió durante 78 meses, y dos pacientes murieron de otras enfermedades. En 85 pacientes con exclusión de dos pacientes murieron de otras enfermedades, Kaplan-Meier fue probada usando la prueba de log-rank. Entre el grupo positivo y el grupo negativo (MUC4 /8G7 + vs -, MUC4 /1G8 + vs - o MUC1 /D F3 + vs -), log-rank test de supervivencia global (MUC4 /8G7, P = 0,27; MUC4 /1G8, P = 0,37; MUC1 /D F3, P = 0,22) y la supervivencia libre de progresión (MUC4 /8G7, P = 0,85; MUC4 /1G8, P = 0,23; MUC1 /D F3, P = 0,83) no mostraron diferencias significativas. Un análisis más detallado de los 42 pacientes sobrevivieron durante más de 5 años también mostró diferencias significativas.

Discusión

Recientemente, hemos informado de que la expresión de MUC4 es un factor de mal pronóstico independiente de los adenocarcinomas pancreatobiliares [ ,,,0],10], [11], [12], así como adenocarcinoma de pulmón [13] y el carcinoma de células escamosas oral de [9]. MUC1 también se ha informado de que un factor de mal pronóstico en diversos tumores humanos [4], [5]. Nuestro estudio anterior en los cánceres gástricos, incluyendo tanto los cánceres tempranos y cánceres avanzados demostró que MUC1 es un factor pronóstico útil para un peor pronóstico en los pacientes [6]. En el presente estudio, la relación entre la expresión de la mucina y los resultados del paciente no puede ser evaluada, debido a que los cánceres gástricos están en la fase temprana en pT1b2 y la mayoría de los pacientes han tenido un resultado favorable. Sin embargo, se obtuvieron los siguientes resultados: (1) El MUC4 /8G7, MUC4 /1G8 y expresiones MUC1 /DF3 estaban relacionados con la invasión linfática. (2) La expresión MUC4 /1G8 se relaciona con metástasis en los ganglios linfáticos. (3) La expresión /DF3 MU1 estaba relacionado con la invasión venosa. En Japón, la EDS es el tratamiento de elección para los cánceres gástricos tempranos [3]. El examen de MUC4, así como MUC1 en las muestras de ESD pueden aclarar si la cirugía adicional, incluyendo la disección de ganglios linfáticos o seguimiento frecuente para la metástasis son necesarios.

Nuestros estudios previos demostraron que no hubo correlación entre siginificant MUC4 expresión y la expresión de MUC1 [10], [11], [12], [13]. Asimismo, en el presente estudio de los cánceres gástricos en la etapa inicial, no hubo correlación entre la expresión de siginificant MUC4 y MUC1. Tanto la expresión MUC4 y MUC1 en el cáncer gástrico puede estar relacionada con los factores de mal pronóstico, como la invasión linfática, invasión venosa y metástasis en ganglios linfáticos, por medio de diferentes mecanismos.

En el estudio previo de los cánceres gástricos usando Mab 8G7, Senapati et al. demostraron que la expresión MUC4 /8G7 no se asoció con el tipo de tumor, etapa o con el grado de diferenciación [18]. Curiosamente, sus resultados mostraron una tasa de expresión de 42% en la etapa de los cánceres I (n = 19), que está de acuerdo con nuestros datos (MUC4 /8G7: 42% y MUC4 /1G8: 48%) en el presente estudio que examina la etapa I cánceres (n = 104). Sin embargo, nuestro estudio reveló que tanto MUC4 /8G7 y MUC4 /1G8 expresiones fueron diferentes entre los tipos histológicos, y fueron significativamente mayores en los tipos bien diferenciados que en el tipo pobremente diferenciado. expresión MUC1 /DF3 también fue significativamente mayor en los tipos bien diferenciados que en el tipo mal diferenciado. Hemos informado de que la expresión de MUC1 fue alta en el adenocarcinoma bien diferenciado en los cánceres gástricos incluyendo cánceres avanzados, y la alta expresión de MUC1 puede afectar a la supervivencia de los pacientes con adenocarcinoma bien diferenciado del estómago [6]. La alta expresión de MUC4 en el adenocarcinoma bien diferenciado también puede afectar a la supervivencia de pacientes con cáncer gástrico. En nuestro estudio anterior [6], la tasa de alta expresión de MUC1 /DF3 fue significativamente mayor en los tipos de cáncer gástrico avanzado que en el cáncer gástrico precoz. La relación de la expresión MUC4 con la invasión de los cánceres gástricos sería un área de estudio interesante.

Hay controversia sobre el significado pronóstico de MUC4 /8G7 y expresión MUC4 /1G8. Por lo tanto, hemos revisado 19 artículos del estudio MUC4 IHC solicitado diversos tejidos de cáncer humano (Tabla 3). La importancia de MUC4 /8G7 y MUC4 /1G8 no pudo evaluarse en 8 de los 19 estudios. Un estudio usando el anticuerpo anti-MIUC4 policlonal informó de que la expresión MUC4 está relacionada con un resultado fovorabel [19], tres estudios no muestran ninguna correlación entre la expresión MUC4 y pronóstico [20], [21], [22], los otros tres estudios no lo hicieron tiene algún comentario sobre la correlación entre la expresión MUC4 y el pronóstico [18], [23], [24], y el resto de estudio de cáncer de tiroides no informó MUC4 expresión en el cáncer [25]. Por otro lado, en los otros 11 artículos, no hubo una diferencia aparente de la importancia pronóstica entre la expresión MUC4 /8G7 y expresión MUC4 /1G8. La mayoría de los estudios que utilizan 8G7, que se generó contra MUC4 humana, la expresión MUC4 /8G7 se relaciona con el comportamiento agresivo del tumor o de un mal resultado en los carcinomas humanos [9], [10], [11], [12], [13], [ ,,,0],26]. En contraste, la mayoría de los estudios que utilizan 1G8, que se planteó en contra de rata ASGP-2, describen que la expresión MUC4 /1G8 se relaciona con un resultado favorable [27], [28], [29], [30], aunque un estudio de páncreas adenocarcinoma describe que la expresión MUC4 /1G8 se relaciona con pobre supervivencia [31]. Esta diferencia clara plantea la cuestión de si 8G7 y 1G8 tienen esencialmente diferentes personajes. El Mab 1G8 se planteó el uso de rata Muc4 epítopo [15]. MUC4 humano y de rata Muc4 muestra más del 60% de similitud de secuencia de péptido [32], pero no son idénticos. Es de destacar que IHC usando MAb 1G8 siempre muestra la tinción positiva en el endotelio vascular, que es algo inusual como la expresión de MUC4 que es uno de los miembros de mucinas.

Por lo tanto, se evaluó la especificidad de la MAb 8G7 y MAb 1G8 por transferencia de Western y IHC de dos líneas celulares de cáncer gástrico. Nuestro análisis de transferencia Western mostró que MAb 8G7 reconoce una proteína muy alto peso molecular (más de 500 kD, que era del tamaño esperado para MUC4 nativo), mientras que MAb 1G8 no muestra bandas inmunorreactivas. El análisis IHC también mostró MAb 8G7 tinción positiva pero tinción negativa MAb 1G8 en las dos líneas celulares de cáncer gástrico. MUC4 mRNA se expresó también en las dos líneas celulares de cáncer gástrico en el presente estudio, como se muestra en el estudio previo análisis de las líneas celulares de cáncer de páncreas en RT-PCR y análisis Northen blot [33], [34]. Tanto MAb 8G7 y MAb 1G8 reaccionan con los tejidos de cáncer gástrico humano, aunque las ubicaciones de MUC4 /8G7 y expresión MUC4 /1G8 mostraron una marcada diferencia. En los tejidos de cáncer gástrico, MUC4 /8G7 se expresó principalmente en el citoplasma de las células neoplásicas de Papanicolaou y bañera, mientras que MUC4 /1G8 se expresó principalmente en los vértices de células de papilla y bañera o sustancia mucina intracitoplasmática de sig. Puesto que el patrón de expresión citoplasmática de MUC4 /8G7 se ve también en el adenocarcinoma pancreático, colangiocarcinoma intrahepático, hepáticas de carcinoma del conducto biliar adicional, adenocarcinoma de pulmón y carcinoma oral de células escamosas [9], [10], [11], [12], [13 ], el patrón de expresión intracitoplasmática MUC4 /8G7 en tejidos de cáncer gástrico puede ser razonable. En contraste, el patrón de expresión lineal de MUC4 /1G8, junto con los vértices de células de los tejidos de cáncer gástrico puede reflejar funciones desconocidas o características de la subunidad MUC4β detectadas por MAb 1G8 generado contra epítopo de rata [15], ya que el presente estudio demostró que MUC4 /1G8 expresión se relaciona con la invasión linfática y metástasis de ganglios linfáticos que son factores de mal pronóstico, incluso en el cáncer gástrico precoz. Particularmente en por2 y sig, la tasa de expresión de MUC4 /1G8 fue significativamente mayor que la de MUC4 /8G7 o la de MUC1 /DF3. Además, hubo una correlación entre la expresión siginificant MUC4 /8G7 y expresión MUC4 /1G8 en los pacientes examinados. Por lo tanto, la señal de IHC de MUC4 /1G8 detecta en las muestras de gastrectomía puede mostrar un significado importante del epítopo detectado por MAb 1G8, aunque no hubo reactividad de expresión MUC4 /1G8 en líneas celulares de cáncer gástrico humano (SNU-16 y NCI N87). El epítopo detectado por el anticuerpo monoclonal 1G8 es un área de interés para estudios futuros.

En conclusión, en el presente estudio de los cánceres gástricos tempranos, se observaron MUC4 /8G7, MUC4 /1G8 y MUC1 /DF3 expresiones principalmente en bien adenocarcinomas diferenciados. La expresión MUC4 /8G7 estaba relacionado con la invasión linfática. La expresión MUC4 /1G8 estaba relacionado con la invasión linfática y metástasis en los ganglios linfáticos. La expresión de MUC1 /D F3 estaba relacionado con la invasión linfática y la invasión venosa. El examen de la expresión MUC4 y MUC1 en los cánceres gástricos se convertiría en un marcador útil para predecir factores de mal pronóstico relacionados con la invasión de vasos, incluso en la etapa inicial.

Apoyo a la Información
Figura S1.
en la mucosa no neoplásica de los casos con cáncer gástrico, MUC4 /8G7 se expresa a veces en el citoplasma de epitelio mucosa de superficie, y con frecuencia, pero débilmente en el citoplasma de las glándulas fúndicas y pilórica (A y D). MUC4 /1G8 se expresó con frecuencia en el ápice celular y el citoplasma del epitelio mucoso de la superficie, y con frecuencia, pero débilmente en el citoplasma de las glándulas fúndicas y pilórica (B y E), y se observó constantemente en el endotelio vascular. MUC1 /DF3 se expresa a veces en el epitelio mucosa de superficie, y siempre en las glándulas fúndicas (particularmente intensamente en los vértices de células), pero no en las glándulas pilórica (C y F). aumento original x 100 (A, B, C), x 400 (D, E, F)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0049251.s001 gratis (TIF)
Tabla S1.
número detallado y el porcentaje de células neoplásicas con tinción positiva utilizando el sistema de puntuación
doi:. 10.1371 /journal.pone.0049251.s002 gratis (DOC)

Reconocimientos

agradecemos al Sr. Y. Atsuchi, el Sr. K. Matsuo, Sra. C. Baba, Sra. Y. Nishimura, Sra. S. Yoshimura y la Sra I. Hojo por su asistencia técnica.

• PLOS ONE: Altos niveles de Aromático Aminoácidos en el jugo gástrico durante las primeras etapas de la progresión del cáncer gástrico
• PLoS ONE: CYP2E1 RsaI /PstI polimorfismo y el cáncer gástrico Susceptibilidad: Meta-análisis basado en 24 estudios de casos y controles