PLoS ONE: MUC4 und MUC1 Expression in Adenokarzinom des Magens Korreliert mit Gefäßinvasion und Lymphknotenmetastase: Eine immunhistochemische Untersuchung von Magenfrühkarzinomen

Abstrakt

Wir haben zuvor berichtet, dass MUC4 Ausdruck ein schlechter prognostischer Faktor bei verschiedenen Karzinomen ist. Unsere frühere Studie zeigte auch, dass MUC1-Expression in Magenkrebs, einschließlich der frühen und fortgeschrittenen Stadien ist ein schlechter prognostischer Faktor. In der vorliegenden Studie wurden die Expressionsprofile von MUC4 und MUC1 wurden durch Immunhistochemie (IHC) unter Verwendung von zwei Anti-MUC4 monoklonale Antikörper (MAbs), 8G7 und 1G8 und anti-MUC1 MAb DF3 in 104 gastrectomy Proben der frühen Adenokarzinom des Magens mit Submukosa-geprüft Invasion (pT1b2), einschließlich 197 histologischen Subtyp Läsionen. Vor der IHC Studium der Humanproben, werteten wir die Spezifität der beiden MAbs durch Western Blot und IHC von zwei MUC4 mRNA Linien Magenkrebszellen exprimiert. MAb 8G7 reagierten deutlich, während MAb 1G8 keine Reaktivität zeigte in beiden Western-Blot oder IHC. In der IHC der Magenkrebs, entdeckt die Expressionsraten von MUC4 /8G7 von MAb 8G7, MUC4 /1G8 erkannt von MAb 1G8 und MUC1 /DF3 von MAb DF3 erfasst in gut differenzierte Arten (70%, 38/54; 67%, 36/54; 52%, 28/54) waren signifikant höher als die in schlecht differenzierten Arten (18%, 10/55; 36%, 20/55; 13%, 7/55) ( P
< 0,0001; P
= 0,0021; P
< 0,0001) sind. Der Ausdruck MUC4 /8G7 wurde mit Lymphgefäßinvasion (r = 0,304, P
= 0,033) bezogen. Auf der anderen Seite wurde die MUC4 /1G8 Ausdruck mit Lymphgefäßinvasion (r = 0,395, P
= 0,001) und Lymphknotenmetastasen (r = 0,296, P
= 0,045) bezogen. Die MUC1 /DF3-Expression wurde mit Lymphgefäßinvasion (r = 0,357, P
= 0,032) und venöse Invasion (r = 0,377, P
= 0,024) bezogen. Abschließend ist der Ausdruck von MUC4 sowie MUC1 in der frühen Magenkrebs ein nützlicher Marker schlechte prognostische Faktoren im Zusammenhang mit Gefäßinvasion zur Vorhersage

Citation. Tamura Y, Higashi M, S Kitamoto, Yokoyama S, Osako M, Horinouchi M, et al. (2012) MUC4 und MUC1 Expression in Adenokarzinom des Magens Korreliert mit Gefäßinvasion und Lymphknotenmetastase: Eine immunhistochemische Untersuchung von Magenfrühkarzinomen. PLoS ONE 7 (11): e49251. doi: 10.1371 /journal.pone.0049251

Editor: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, Vereinigte Staaten von Amerika

Empfangen: 17. August 2012; Akzeptiert: 5. Oktober 2012; Veröffentlicht: 13. November 2012

Copyright: © 2012 Tamura et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Studie wurde teilweise von der Princes Takamatsu Cancer Research Fund auf S. Yonezawa unterstützt; Grants-in-Aid für wissenschaftliche Forschung für wissenschaftliche Forschung (B) 23.390.085 auf S. Yonezawa; Wissenschaftliche Forschung (C) 21590399 M. Higashi; Young Scientists (B) 24.701.008 auf S. Yokoyama; Wissenschaftliche Forschung auf Schwerpunktbereiche 239349 S. Kitamoto (JSPS-Stipendium) aus dem Ministerium für Bildung, Wissenschaft, Sport, Kultur und Technologie, Japan; ein Pancreas Research Foundation of Japan S. Yokoyama; und der Kodama Memorial Foundation, Japan M. Higashi. S. Batra wird zum Teil durch die National Institutes of Health Zuschüsse (CA78590, CA163120, CA133944 und CA111294) unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zu veröffentlichen. Keine zusätzliche externe Finanzierung für diese Studie erhalten

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt in Bezug auf die Arbeit in der Studie haben

Einführung

Magenkrebs ist die vierthäufigste Krebsart weltweit und mehr als 90% von Magenkrebs sind Adenokarzinome [1]. Vor kurzem hat in Japan, Früherkennung von der Routine endoskopischen Untersuchung in der Gastroenterologie Kliniken genaue Diagnosen führte und wirksame chirurgische oder endoskopische Behandlung, in einer relativ besseren Prognose führt. Bei der Analyse von 11.261 Patienten mit durch Magenresektion behandelt Magenkrebs, die TNM 5-Jahres-Überlebensrate für Stadium IA betrug 91,8% und für die Stufe IB war die Überlebensrate 84,6% [2]. Für die frühen Magenkrebs, eine endoskopische Submukosadissektion (ESD) ist die erste Wahl der Behandlung in Japan, aber die Kriterien der zusätzlichen Operation einschließlich Lympknotendissektion nach der ESD noch umstritten sind [3].

Unsere Serie Immunhistochemie (IHC) Untersuchungen zur in verschiedenen menschlichen Neoplasmen Expression Mucin haben gezeigt, dass die Expression des MUC1 Mucin (pan-epitheliales Membranassoziierten Mucin) der mit invasiven Proliferation der Tumoren und schlechten Prognose der Patienten, während die Expression in Beziehung steht die MUC2 Mucin (Darm-Typ sekretorischen Mucin) mit dem nicht-invasive Proliferation der Tumoren und ein positives Ergebnis für die Patienten [4], [5] bezogen. Unsere frühere Studie zeigte, dass MUC1-Expression in Magenkrebs ist ein schlechter Prognosefaktor [6].

MUC4 wurde zuerst als tracheobronchial Mucin berichtete [7] und ist ein membranassoziiertes Mucin [8]. In unserer Studienreihe, die Expression von MUC4 in intrahepatischen cholangiocarcinoma, duktalen Adenokarzinom des Pankreas, war extrahepatischen Gallengangskarzinom, Lungenadenokarzinom und orale Plattenepithelkarzinom ein unabhängiger Faktor für schlechte Prognose und ist ein nützlicher Marker das Ergebnis der Patienten vorherzusagen [ ,,,0],5], [9], [10], [11], [12], [13]. Leider gibt es nur wenige Untersuchungen des MUC4 Expressionsprofil in menschlichen Magenkrebs. In der vorliegenden Studie untersuchten wir die Expressionsprofile von MUC4 sowie MUC1 in der frühen Magenkrebs Gewebe, und fand, dass die Expression MUC4 und MUC1 in den frühen Magenkrebs schlechte prognostische Faktoren durch Lymphgefäße Invasion würde, Blutgefäßinvasion und Lymphknoten Metastasierung.

Als anti-MUC4 monoklonale Antikörper (MAbs), 8G7 und 1G8, verschiedene Standorte von MUC4 Moleküls zu erkennen, sind bekannt. Der MAb 8G7 erkennt eine Tandem-Repeat-Sequenz (STGDTTPLPVTDTSSV) des menschlichen MUC4α Untereinheit [14]. Der MAb 1G8 angehoben gegen die Rattensequenz (rat ASGP-2), und erkennt ein Epitop auf der Ratte ASGP-2-Untereinheit, die für das menschliche MUC4β Untereinheit entspricht, und zeigt eine Kreuzreaktivität mit humanen Proben [15]. So wurde ein besonderes Augenmerk auf den Vergleich von zwei anti-MUC4 MAbs durch Western-Blotting und IHC von zwei Magenkrebszelllinien gezahlt, bevor die IHC Studie der menschlichen Magenkrebsgewebe. Da darüber hinaus Kontroverse über die prognostische Bedeutung dieser anti-MUC4 MAbs ist, wurde eine Literaturübersicht von MUC4 Expression in verschiedenen Krebsarten ebenfalls durchgeführt.

Materialien und Methoden

Patienten und Gewebeproben

Gastrectomy Proben von 104 frühen Magenkrebs, die submuköse Invasion zeigen, pT1b2, mit oder ohne Lymphknotenmetastasen wurden aus der Datei zwischen 1994 und 2008 von der Kagoshima-shi Medical Association Krankenhaus abgerufen. Das mittlere Alter der Patienten betrug 65,7 (S. D., 9.8, Bereich, 39-92 Jahre, Durchschnittsalter 66 Jahre); 64 Fälle waren männlich und 40 Fälle waren Frauen. Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den Leitsätzen der Deklaration von Helsinki, und genehmigt von der Ethikkommission für Kagoshima-shi Medical Association Hospital (KMAH 2011-02-02) durchgeführt. Informiert, schriftliche Einwilligung wurde von allen Patienten erhalten. In den Fällen mit mehr als zwei histologischen Typen in einer Läsion gemischt, jedes histologischen Muster unabhängig bewertet wurde, gemäß der japanischen Classification of Gastric Carcinoma (JCGC) [16].

Evaluation of Monoclonal Antibodies für MUC4

Zellen und Kulturbedingungen.

menschlichen Magenkrebszelllinien (SNU-16 und NCI-N87) und Bauchspeicheldrüsenkrebs-Zelllinien (PANC1 und CAPAN1) von der American Type Culture Collection (Manassas gekauft wurden, VA). Beide Magenkrebs-Zellen wurden in RPMI-1640 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) gehalten wird; PANC1 Zellen wurden in DMEM (Sigma-Aldrich) gehalten wird; Capan1 Zellen wurden in DMEM /F-12 (Sigma-Aldrich) gehalten. Alle Medien wurden mit 10% fötalem Rinderserum (GIBCO, Breda, Niederlande) und 100 U /ml Penicillin /100 ug /ml Streptomycin (Sigma-Aldrich) supplementiert. Alle Zellen wurden in 5% CO2 bei 37 ° C und gehalten bei subkonfluenten Ebenen.

RNA-Extraktion und RT-PCR inkubiert.

Gesamt-RNA wurde aus den Zellen unter Verwendung des RNeasy Mini extrahierte (Qiagen, Hilden, Deutschland) und von Nanodrop ND-1000-Spektrophotometer quantifiziert. Die erhaltene mRNA (2 ug) wurde umgekehrt mit dem High Capacity-RNA zu cDNA-Kits (Applied Biosystems, Foster City, CA) in cDNA transkribiert. Die folgenden Primer wurden für die nachfolgende PCR entworfen: MUC4, 5'- TGGGACGATGCTGACTTCTC-3 ', 5'-CCCCGTTGTTTGTCATCTTTC-3'; ACTB, 5'-CTCTTCCAGCCTTCCTTCCTG-3 ', 5'-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3'. PCR wurde mit den AmpliTaq Gold Schnelle PCR Master Mix (Applied Biosystems) nach dem Protokoll des Herstellers durchgeführt.

Proteinextraktion und Western Blot.

Insgesamt Zelllysate wurden unter Verwendung von RIPA-Puffer-Protease-Inhibitor-Cocktail enthält, (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan). Die Proteinkonzentration wurde durch das BCA-Assay (Thermo Scientific, Rockford, IL) gemessen. Eine gleiche Menge an Protein-Lysat wurde auf einem 2% Agarose-Gel mit SDS gelöst und passiv auf PVDF-Membran über Nacht bei Raumtemperatur überführt. Die Membranen wurden mit 1% Magermilch /PBST über 2 Stunden unterzogen und dem Standardimmundetektionsverfahren mit spezifischen primären Antikörpern blockiert. Die primären Antikörper sind wie folgt: Anti-Human-MUC4 MAb 8G7 (1:1000, erzeugt durch Dr. Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, Omaha, NE) und 1G8 (1:1000, erworben von Invitrogen, Camarillo, CA) und Anti-Human-a-Tubulin-MAb DM1A (1:2,000, Sigma-Aldrich).

Immunzytochemie für kultivierte Zellen.

für MUC4 Färbung in kultivierten Zellen wurden die Zellen in 8-Kammer Dias (Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ) und über Nacht inkubiert. Zellen wurden über Nacht bzw. bei 4 ° C, mit 3,7% Formaldehyd für 10 Minuten bei Raumtemperatur und gefärbt mit MAb 8G7 (1:24,000) und MAb 1G8 (1:4,000) fixiert. Signalerkennung wurde von einem Immunperoxidase-Verfahren durchgeführt unter Verwendung eines Vectastain Elite ABC-Kit (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Immunhistochemie für menschliche Gewebe

IHC für die menschliche Magenkarzinomen wurde unter Verwendung der folgenden Antikörper in den maximalen Schnittabschnitte in jedem Tumor erfolgen. MUC4 wurde durch zwei MAbs, 8G7 und 1G8 erkannt. Für die Vergleichsstudie wurde MUC1-Expression auch von MAb DF3 (Maus IgG, TFB, Tokyo, Japan) untersucht. IHC wurde durch die Immunperoxidase-Verfahren wie folgt durchgeführt. Antigen-Retrieval wurde mit CC1 Antigen-Retrieval-Puffer (pH 8,5 EDTA, 10037 ° C, 30 min., Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) durchgeführt für alle Abschnitte. Nach der Inkubation mit den primären Antikörpern (MAb MUC4 /8G7 1:3000 verdünnt, 37 ° C, 32 min .; MAb MUC4 /1G8 1:500 verdünnt, 37 ° C, 24 min .; MAb MUC1 /DF3 1:50 verdünnt, 37 ° C, 32 min.) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung pH 7,4 (PBS) mit 1% Rinderserumalbumin, wurden die Schnitte auf einer Benchmark XT Färbeautomat unter Verwendung eines Diaminobenzidin-Nachweis-Kit (ultraview DAB, Ventana Medical Systems) gefärbt. Der Einfachheit halber MUC4 /8G7, MUC4 /1G8 und MUC1 /DF3 werden verwendet, um die Muzinantigene von jedem Antikörper nachgewiesen anzuzeigen.

Scoring der Ergebnisse und statistische Analyse.

Vier Ermittler geblendet ( YT, MH, MG und SY) unabhängig evaluiert die IHC-Färbung Daten. Wenn die Auswertung unter den vier unterschied, wurde eine endgültige Entscheidung durch Konsens getroffen. Die Ergebnisse wurden auf der Grundlage der Prozentsatz der positiv gefärbten Karzinomzellen bewertet, und die Prozentangaben wurden in sechs Klassen klassifiziert die folgende Bewertungssystem verwendet: negativ, keine der Karzinomzellen gefärbt; schwach, < 5% der Karzinomzellen gefärbt; 1+, ≥5% bis < 25%; 2+, ≥25% bis < 50%; 3+, ≥50% bis < 75%; und 4+: ≥75% gefärbt. Fälle mit ≥5% der Karzinomzellen gefärbt wurden als positiv betrachtet. Die statistische Analyse von nicht-parametrischer Verfahren wurde unter Verwendung von EXCEL-Statistiken ver.3 Software erzeugt durch Hisae Yanai, Fakultät für Naturwissenschaften, Saitama University (OMS Publishing, Japan).

Das Überleben der Patienten wurde zwischen der Gruppe mit positiver Vergleich MUC4 /8G7, MUC4 /1G8 oder MUC1 /DF3 Ausdruck und die Gruppe mit negativer Ausdruck nach der Kaplan-Meier-Methode, und die Unterschiede zwischen den Überlebenskurven wurden mit dem Log-Rank-Test getestet. Eine Wahrscheinlichkeit von P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen

Ergebnisse

• PLoS ONE: Hohe Niveaus von aromatischen Aminosäuren im Magensaft während der frühen Stadien von Magenkrebs Progression
• PLoS ONE: CYP2E1 RsaI /PstI Polymorphismus und Magenkrebs Immission: Meta-Analysen Basierend auf 24 Fall-Kontroll-Studies