PLOS ONE: Orientación CDH17 Suprime la progresión tumoral en el cáncer gástrico mediante la regulación negativa de Wnt /β-catenina señalización

Extracto

Aplicaciones

El cáncer gástrico sigue siendo una de las principales causas de muerte por cáncer en todo el mundo. Los pacientes suelen presentar con fines de invasión o metástasis locales, para los que no existen terapias eficaces disponibles. Después de los estudios previos que identificaron la molécula de adhesión cadherina-17 (CDH17) como un marcador potencial para el carcinoma gástrico, hemos realizado estudios de prueba de principio para desarrollar estrategias terapéuticas racionales dirigidas a CDH17 para el tratamiento de esta enfermedad.

Métodos

la inmunohistoquímica se utilizó para estudiar la expresión de CDH17 en 156 carcinomas gástricos, y la relación entre la supervivencia y la expresión CDH17 se estudió mediante análisis multivariados. El efecto de RNA knockdown interferencia mediada de CDH17 sobre la proliferación de líneas celulares de carcinoma gástrico se examinó in vitro e in vivo, así como los efectos sobre la señalización aguas abajo por inmunotransferencia.

Resultados

CDH17 fue consistentemente hasta reguladas en los cánceres gástricos humanos, y la supervivencia global en pacientes con CDH17 regulación positiva era más pobre que en aquellos sin expresión de este gen (tasa de 5 años de supervivencia global de 29,0% vs. 45,0%, p < 0,01). Los ensayos funcionales demostraron que CDH17 knockdown inhibió la proliferación celular, la adhesión, la migración, invasión, clonogenicidad y inducen la detención G0 /G1. En ratones, shRNA mediada desmontables CDH17 marcadamente inhibe el crecimiento tumoral; la inyección intratumoral de CDH17 shRNAs resulta en efectos antitumorales significativos en modelos de tumores trasplantados. Los mecanismos que subyacen a la inhibición antitumorales CDH17 implican la inactivación de la señalización /β-catenina vía.

Conclusión

Nuestros resultados identifican CDH17 como biomarcador del carcinoma gástrico y atractiva diana terapéutica para este tipo de cáncer agresivo.

Visto: Qiu Hb, Zhang Ly, Ren C, Zeng Zi, Wu Wj, Luo Hy, et al. (2013) Orientación CDH17 suprime el avance tumoral en el cáncer gástrico mediante la regulación negativa de Wnt /β-catenina. PLoS ONE 8 (3): e56959. doi: 10.1371 /journal.pone.0056959

Editor: Cara Gottardi, Universidad de Northwestern Feinberg School of Medicine, Estados Unidos de América

Recibido: 22 Octubre, 2012; Aceptado 16 de enero de 2013; Publicado: 15 Marzo 2013

Derechos de Autor © 2013 Qiu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales (30672408 a RHX). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

el cáncer gástrico es la cuarta causa más común de muerte por cáncer en el mundo. Aunque la incidencia de cáncer gástrico ha disminuido drásticamente en algunos países desarrollados en la última década, se estima que un total de un millón de nuevos casos que se diagnostican cada año [1]. Los pacientes con esta enfermedad suelen tener un pronóstico desalentador, que representa el 10% del total de muertes de cáncer [2]. Incluso después de la cirugía radical, más de la mitad de los pacientes se repita. compromiso de los ganglios linfáticos, la profundidad de la invasión tumoral y la localización del tumor han sido identificados como los factores de pronóstico clínico-patológicos más significativos [3], [4].

La invasión local y metástasis a distancia ocurren comúnmente en el carcinoma gástrico avanzado. El proceso de invasión y metástasis es complejo y requiere de la desregulación de una variedad de elementos celulares incluyendo moléculas de adhesión críticos. Cadherina pertenece a una de las familias de moléculas de adhesión y juega un papel crucial en el establecimiento de interacción célula-célula [5]. Cadherina-17 (CDH17), que también se llama hígado-intestino (LI) cadherina o péptido humano transportador-1 (HPT-1), es un miembro estructuralmente única de la cadherina superfamilia [6], [7]. Considerando que las denominadas cadherinas clásicas, como E-, N- y P-cadherina, tienen cinco repeticiones de cadherina dentro del dominio extracelular, CDH17 consta de siete repeticiones de cadherina. Por otra parte, CDH17 tiene sólo 20 aminoácidos en el dominio citoplásmico, mientras que las cadherinas clásicas tienen un dominio citoplásmico muy conservadas que consiste en los aminoácidos 150-160. CDH17 se expresa en ratones y seres humanos casi exclusivamente en las células epiteliales tanto de embrionario y adulto intestino delgado y colon, sin expresión detectable en el estómago y el hígado [8].

Utilizando enfoques genómicos y proteómicos integradores, los investigadores tienen comenzado a identificar nuevos oncogenes y supresores de tumor en el cáncer gástrico. Los estudios previos de cohortes clínicas identificaron CDH17 como un marcador potencial para la enfermedad de carcinoma gástrico [9], [10]. A pesar de estos hallazgos clínicos significativos, las funciones moleculares de CDH17 siguen siendo desconocidos, y su papel en el carcinoma gástrico tumorigénico todavía no ha sido confirmada. En este caso, el objetivo fue diseccionar los mecanismos de señalización oncogénicas de CDH17 en el contexto de carcinoma gástrico y evaluaron los efectos de la orientación CDH17 como un enfoque terapéutico potencial para el cáncer gástrico.

Métodos

Los pacientes

La población del estudio consistió en 156 pacientes consecutivos (106 hombres y 50 mujeres) programados para cirugía de enero 1, 2002 a diciembre 31, 2006 at Sun Yat-Sen Universidad del Centro del cáncer, Guangzhou, china. Todos los pacientes incluidos en este estudio tenían un diagnóstico confirmado histológicamente de carcinoma gástrico primario que se ha analizado más patológicamente después de la cirugía. La cirugía consistió en gastrectomía total o subtotal en todos los pacientes; una técnica estandarizada se utilizó para la resección quirúrgica y la linfadenectomía, como se describe en otra parte [3]. Los pacientes que se sometieron a cirugía de resección no, y los de tipo I Siewert cardias adenocarcinoma fueron excluidos del estudio. Espécimen y tamaños tumorales fueron registrados por los patólogos. Se seleccionaron áreas representativas de tumor y se congelaron-SNAP. pTNM clasificación seguido los criterios de la 6ª edición de la UICC [11] .La edad media de los pacientes fue de 57,2 años (rango: 27-78 años) la edad, sexo, tipo de cirugía, la localización del tumor, el estadio TNM, la quimioterapia, la muestra de longitud, tamaño del tumor, y la diferenciación histológica, se registraron para cada paciente en una base de datos. Todos los pacientes que se sometieron a cualquier tipo de quimioterapia estaban en el 5-FU, platino o regímenes basados ​​en taxol. Todos los pacientes, después de salir del hospital, entraron en un programa de seguimiento de acuerdo con el protocolo estándar [12]. El seguimiento fue cerrado en abril de 2010. El estudio fue aprobado por el comité de ética en Sun Yat-sen Centro de Cáncer de la Universidad, todos los participantes dieron su consentimiento informado por escrito para participar en este estudio.

Líneas celulares y CDH17 anticuerpo

líneas celulares de carcinoma gástrico, AGS, MKN-45, HGC-27, MGC-803 BGC-823 y SGC-7901 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA), Recursos de investigación del cáncer japonés Banco (Tokio, Japón) y la Universidad médica de Beijing (Pekín, china). Las células se cultivaron en medio RPMI 1640 (Sigma), suplementado con 10% de suero fetal bovino (Invitrogen) y 1% de penicilina-estreptomicina (Invitrogen). Un anticuerpo monoclonal de ratón para CDH17 (ab54511) fue de Abcam (Cambridge, MA).

CDH17 corto horquilla RNA (shRNA)

El Puro pLKO.1 (7 kb) constructo lentiviral contiene una promotor U6 y el VIH-1 señal de empaquetamiento de ARN con elementos de resistencia pruomycin- y ampicilina clonaron 3 'del promotor de la fosfoglicerato quinasa humana (hPGK). A cpptCTE se insertó 5 'del promotor hPGK. CDH17 construcciones shRNA humanos fueron generados por ligación de los siguientes oligómeros hibridados en los sitios únicos de Agel y EcoRI del puro pLKO.1: CDH17 shRNA hacia adelante (5'-CCG GCC ACT TTC ATA TCG TCC GGA ACT CGA GTT CCA GCG GAT ATG GTG AAA GTT TTT G-3 ') e inverso (5'-AAT TCA AAA ACC ACT TTC ATA TCG TCC GGA ACT CGA GTT CCA GCG GAT ATG GTG AAA G-3'). preparaciones lentivirales se produjeron mediante co-transfección pLKO.1 puro vector vacío con CDH17 shRNA, y virus helper plásmidos de encapsidación pCMVΔR8.9 y pMG.G (en una relación 10:10:01) en células 293T. La transfección se realizó usando lipofectamina y el reactivo PLUS (Invitrogen). Los lentivirus se recogieron a las 24, 36, 48 y 60 h después de la transfección. Dos controles se establecieron, en el que las células de cáncer gástrico o bien no recibieron ningún tratamiento, o se transfectaron con vectores revueltos no específica RNAi (Mock). La infección se llevó a cabo en presencia de 8 g /ml de polibreno. fueron seleccionados después de la infección, AGS y MKN-45 células para la expresión estable de los shRNAs utilizando 2 mg /ml de puromicina. Se lisaron las células para el análisis de transferencia de Western 10 días después de la infección.

Immunoblotting y subcelular fraccionamiento

lisados ​​de proteína se preparan a partir de monocapas de línea de células usando tampón de lisis (NP-40,50 mM Tris 1% -HCl, pH 8,0, fluoruro de sodio 100 mM, pirofosfato de sodio 30 mM, molibdato de sodio 2 mM, EDTA 5 mM, ortovanadato de sodio 2 mM) que contiene inhibidores de la proteasa (10 mg /ml de aprotinina, 10 mg /ml de leupeptina, 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo ). Las concentraciones de proteína se determinaron utilizando el ensayo de proteínas Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories Hercules, CA, EE.UU.). Los lisados ​​celulares se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecil sulfacte de sodio (SDS-PAGE), y las proteínas separadas se transfirieron electroforéticamente a membranas Immobilon-P (Millipore). Después de bloquear por leche no grasa, las membranas se incubaron independientemente en P53 anticuerpos primarios (Cell SignalingΠ2), MDM2 (Zymed!-7100), P21 (Zymed!-7000), ciclina D1 (Santa Cruz sc-753 ), Rb (Señalización celular΢9), β-catenina (Zymed, 13-8400), GSK3 (Santa Cruz, SZ-7291) y p-GSK3 (Ser9) (Señalización celularΥ6). La membrana se lavó varias veces en PBS con 0,1% de Tween 20 y escaneado en el infrarrojo de dos colores del sistema formador de imágenes de detección de LI-COR Odyssey (LI-COR Bioscience) según las instrucciones del fabricante.

fraccionamientos subcelulares se realizaron utilizando tampones de lisis de células específicas y etapas de centrifugación repetidas (kit de extracto nuclear de Motivo activo, Carlsbad, CA) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. fracciones de células se disolvieron en tampón RIPA, y la concentración de proteína se midió usando el ensayo de cuantificación de proteínas BCA. Los extractos de proteína (20 mg) se disolvieron adicionalmente en 1 x tampón de Laemmli, se sometieron a electroforesis en un SDS-PAGE 10% y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa como se describe anteriormente. Se realizaron análisis de transferencia de Western de la polimerasa poli-ADP-ribosa (PARP, de Cell Signaling Technology Inc, Beverly, MA) y superóxido dismutasa 2 (SOD2, desde ABFrontier, Seúl, Corea) para confirmar la separación adecuada de proteínas nucleares y citosólicas.

cuantitativa con transcripción inversa-PCR (QPT-PCR)

ARN total fue extraído a partir de líneas celulares y tejidos de adenocarcinoma gástrico congelados por el reactivo TRIzol (Invitrogen). La transcripción inversa del ARN total (2 Ag) se realizó usando un kit Advantage RT para PCR (Clontech), y el ADNc se sometió a PCR durante 28 ciclos de amplificación con los cebadores siguientes: CDH17 Fw, 5'-ACAATCGACCCACGTTTCTC y CHD17 rv, 5 '-ATATTGTGCACCGGGATCAT. β-actina se utilizó como control.

La inmunohistoquímica (IHC)

Un total de 156 fijados en formalina y se seleccionaron muestras de tejido de cáncer gástrico incluidos en parafina para el estudio IHC. tinción IHC se realizó en secciones de tejido 5-micras rehidratadas a través de alcoholes graduados. actividad de la peroxidasa endógena fue bloqueada con peróxido de hidrógeno 0,3% durante 15 min. Los portaobjetos se trataron microondas en 10 mM de tampón de citrato (pH 6,0) para 10 min. La unión no específica fue bloqueada con suero normal de conejo 10% para 20 min. Los portaobjetos de tejidos se incubaron con anti-CDH17 (dilución 1:50) durante 60 min a 37 ° C en una cámara húmeda. Los portaobjetos se incubaron con inmunoglobulina de conejo biotinilado anti-ratón a una concentración de 1:100 durante 30 min a 37 ° C luego se hace reaccionar con un conjugado de estreptavidina-peroxidasa durante 30 min a 37 ° C y finalmente se incubó con diaminobencidina 3-3 'como un sustrato cromógeno. Para excluir una falsa señal positiva, controles negativos se incluyeron en cada prueba mediante la sustitución del anticuerpo primario con suero de bloqueo. Dos observadores independientes cegados a la información clínico-patológico anotaron los toboganes. La definición de tinción fue como sigue: negativo, con 0% a menos del 5% de las células tumorales que muestran inmunorreactividad; débil, 5-40% de las células tumorales que muestran inmunorreactividad; positiva, más de 40% de las células tumorales que muestran inmunoreactividad. Los casos positivos se futher sub-clasifican en CDH17 + (inmunoreactividad: 40-60%), CDH17 2+ (inmunoreactividad: 60-80%) y CDH17 3+ (inmunoreactividad: 80-100%).

En ensayos in vitro para evaluar el fenotipo tumoral

los procedimientos experimentales para el crecimiento celular, la formación de focos, agar suave, la migración celular, la curación de heridas y ensayos de ciclo celular se describen en la documentación Métodos S1.

experimentos de rescate

el rescate de CDH17 en shCDH17 AGS y líneas de células MKN-45 se describen en la documentación Métodos S1.

en vivo modelos de ratón de cáncer gástrico

Este estudio se llevó en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio de los Institutos nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética del Experimentos con Animales de Sun Yat-sen Centro de Cáncer de la Universidad (Número de Permiso: 09-0238). Toda la cirugía se realizó bajo anestesia con pentobarbital sódico, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. Después de la anestesia, los ratones desnudos fueron sacrificados por dislocación cervical.

formación de tumores en ratones desnudos.
Tumorigénesis

In vivo se investigó por medio de experimentos de xenoinjerto de tumor. Aproximadamente el 2 × 10 ^{control se inyectaron células AGS 6 infectados con CDH17 shRNA, células AGS infectadas con vectores maqueta ARNi y las células AGS parentales s.c. en la derecha y las patas traseras izquierdas de ratones desnudos de 4 semanas de edad (30 ratones, 10 por condición). La formación de tumores en ratones desnudos se monitorizó durante un período de 8 semanas. El volumen del tumor se calculó mediante la fórmula V = 0,5 x L x W 2. [13]}

portadores del tumor modelo de ratón.

tumores subcutáneos fueron inducidos en ratones desnudos usando células AGS como anteriormente mencionadas. Una semana después de la inoculación, los ratones fueron tratados con anti-CDH17 shRNA. Cada ratón recibió 100 l de injectionscontaining intratumoral 1 × 10 ^{9 copias de CDH17 o lentivirus simulada, dos veces por semana durante 2 semanas. Cinco ratones fueron utilizados en cada grupo. El crecimiento del tumor se controlaron diariamente.}

Estadísticas

Los análisis estadísticos se realizaron con el programa SPSS 13.0. Las diferencias entre las variables se evaluaron mediante χ2 análisis o pruebas de la t de 2 colas de Student. Los datos se presentan como la media ± SD a menos que se indique lo contrario. La supervivencia global (OS) y curvas de supervivencia libre de enfermedad (DFS) se calcularon por el método de Kaplan-Meier, y las diferencias entre los dos grupos se compararon mediante la prueba de log-rank. Un valor de p menor de 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.

Resultados

CDH17 es altamente expresado en células de carcinoma gástrico y se relaciona con los pobres resultados clínicos

En primer lugar, se analizó el nivel de expresión de CDH17 en 156 especímenes de carcinoma gástrico por IHC: 69 (44,3%) de los 156 casos fueron positivos, mientras que los 87 casos restantes (55,7%) fueron negativos o débiles para la expresión CDH17 (Fig. 1). El nivel de expresión fue de +, 2 + 3 + y en 21 (13,5%), 20 (12,8%) y 28 (17,9%) casos, respectivamente. Estos hallazgos indican que CDH17 puede desempeñar un papel importante en la tumorigénesis del cáncer gástrico. Por último, comparamos las características clínicas y patológicas de los pacientes con y sin expresión CDH17. No se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los dos grupos con respecto al género, la edad, el tamaño del tumor, localización del tumor, la profundidad de la invasión tumoral, metástasis en los ganglios linfáticos, metástasis a distancia y el estadio TNM (Tabla 1).

A continuación, se investigó el impacto potencial de estado de la expresión CDH17 en la supervivencia a largo plazo de los pacientes mediante el análisis univariante y multivariante. La mediana de seguimiento fue de 24,3 meses, al final del seguimiento, 68 pacientes seguían con vida, 87 pacientes habían muerto de tumor, y 1 paciente habían muerto por otra causa; la tasa de supervivencia a 5 años relacionada con el cáncer en toda la serie fue del 37,8%. Los análisis univariados mostraron una asociación entre la supervivencia global y la localización del tumor, la diferenciación histológica, el estadio TNM y la expresión CDH17 (Tabla S1). En el análisis multivariado, sitio del tumor (p = 0,02) diferenciación histológica (p = 0,02), el estadio TNM (p < 0,001) y la expresión CDH17 (p < 0,01) fueron factores pronósticos independientes para la supervivencia global. Higo. 2A muestra la diferencia en la supervivencia global entre los pacientes con y sin expresión CDH17. La mediana de supervivencia global fue de 15,9 meses en los pacientes con expresión CDH17 en comparación con 26,6 meses en los que CDH17 expresión negativa o débil (P < 0,01), lo que corresponde a una reducción del 16% en la mortalidad. Por otra parte, la supervivencia libre de enfermedad de análisis (DFS) se realizó en 131 pacientes que se sometieron a una resección R0. Al final del seguimiento, 69 (52,7%) pacientes seguían vivos y 62 (47,3%) pacientes habían muerto a causa de la recurrencia del tumor o metástasis a distancia, los análisis multivariados mostraron los resultados similares, diferenciación histológica, localización tumoral, la profundidad de la invasión tumoral (pT), los ganglios linfáticos-metástasis (pN etapa) fueron factores pronósticos independientes para la supervivencia libre de enfermedad (datos no mostrados). También se encontró que los pacientes sin expresión CDH17 tienen un mejor pronóstico que aquellos que con la expresión CDH17 en el tejido tumoral (Figura 2B.) (p < 0,01). La supervivencia global se reduce en pacientes con alta expresión de CDH17 (IHC 2+, 3+) que en los pacientes con CDH17 + expresión (Fig. 2C). La mediana de supervivencia global de los pacientes cuyos tumores tenían una mayor expresión CDH17 fue de 10,9 meses para CDH17 3+, 21.1 meses para CDH17 2+, y 25,7 meses en los asignados a ser CDH17 + expresión (p < 0,01).

CDH17 expresado en líneas celulares gástrico humano

se evaluó si las líneas celulares de carcinoma gástrico humano expresa CDH17 y por lo tanto podría ser utilizado para evaluar más a fondo la función potencial de esta proteína. Hemos seleccionado un panel de 6 gástricos líneas celulares de carcinoma con diferente potencial metastásico: AGS, MKN-45, HGC-27, MGC-803 BGC-823 y SGC-7901. CDH17 nivel de ARNm se midió mediante QRT-PCR análisis. Se apreció una fuerte expresión en la línea celular de carcinoma gástrico primario y metastásico (AGS y MKN-45) (Fig. S1 A). análisis de transferencias de Western confirmó la expresión de proteínas de alta CDH17 en AGS (establecido a partir de un tumor primario) y MKN-45 (metastásico) (Fig. S1B).

Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que CDH17 es importante para la iniciación y la metástasis del cáncer gástrico; al menos un subconjunto de líneas celulares de carcinoma gástrico así con credenciales conserva-expresión de CDH17 lo que permite la caracterización funcional adicional.

CDH17 caída induce efectos anti-tumorales in vitro

A continuación, hemos derribado en CDH17 -AGS líneas celulares de carcinoma gástrico y MKN-45 usando shRNAs CDH17-específicas. La caída cedido > 75% de reducción, tanto en los niveles de proteína y ARNm (Fig 3A.). Luego se evaluó las propiedades tumorigénicas y metastásicas (proliferación, la formación de colonias, adhesión, invasión y del ciclo celular) de las células deficientes CDH17 cáncer gástrico (células shCDH17) en comparación con las células control por vectores infectados de forma simulada.

CDH17 shRNA knockdown mediada por resultado un crecimiento significativamente reducido de células de líneas celulares de carcinoma gástrico (P < 0,001) (Fig 3A, derecha.). la formación de focos también se inhibió significativamente (P < 0,001) en las células shCDH17 comparación con las células Mock (Fig 3B, Izquierda.), se obtuvo un resultado similar en agar blando, en los que la formación de colonias se redujo significativamente en células shCDH17 (P < 0,001; Fig. 3B, derecha). El papel de CDH17 en la metástasis se estudió mediante ensayos de curación de heridas y transwell. CDH17 caída fue capaz de disminuir la movilidad celular (Fig. 3C, izquierda), como se determina por el ensayo de la herida. ensayo Transwell reveló que la reducción de la expresión de CDH17 disminuye significativamente la adhesión celular (P < 0,001) (Fig. 3C, derecha). Para explorar el mecanismo subyacente a la inhibición del crecimiento por CDH17 caída, las distribuciones del ciclo celular de células con horquilla CDH17 shRNA y Mock se determinaron por citometría de flujo: las células shCDH17 fueron detenidas en la fase G0 /G1, con un menor número de células en la fase M /G2 (Fig . 3D). El efecto antitumoral de CDH17 caída también fue visto en la línea celular de carcinoma gástrico metastásico MKN-45 (Fig. S2A-E). De acuerdo con las normas aceptadas que aseguren la calidad y la precisión de los experimentos de RNAi [14], hemos realizado experimentos de rescate de la re-expresión CDH17 en AGS y MKN-45 shCDH17 células (Fig. S3 A-B). Restauración de expresión CDH17 en AGS y MKN-45 células devolvió las células con el fenotipo de los padres, lo que confirma que los efectos antitumorales de CDH17 caída no se debieron a efectos fuera del objetivo. Los experimentos de rescate revelaron que después de la restauración de la expresión de CDH17 en esas dos líneas celulares, la tumorigenicidad y el potencial metastásico aumentaron a niveles similares de AGS parentales y MKN-45 células (Fig. S3C-F). Estos resultados proporcionan una fuerte evidencia de las funciones oncogénicas de CDH17 en células de carcinoma gástrico.

CDH17 como una diana in vivo para la terapia del cáncer gástrico

examinó si se requiere CDH17 para la formación de tumores y la invasión de células de carcinoma gástrico en un modelo de ratones desnudos. Nos inyecta por vía subcutánea shCDH17, Mock y las células AGS parentales en ratones desnudos. Los tumores son normalmente visibles macroscópicamente en el dorsal flanquea en un plazo de 6 a 8 semanas de la inyección de células. 1 ratón de ambos padres y el AGS grupos Mock murió durante la tercera semana después (se utilizaron puntos finales) de inyección. Los ratones fueron asesinados 8 semanas después de la inyección de células tumorales. En el grupo de ratones inyectados con células shCDH17, 2 ratones muestra ningún nódulo tumoral, y 8 ratones mostraron formación significativa reducción del tumor en comparación con los ratones inyectados con células simuladas. El tamaño del tumor y el peso se redujeron significativamente en los ratones inyectados con células shCDH17 comparación con los ratones inyectados con células simuladas (Fig. 4A). Estos resultados muestran que la reducción de la expresión CDH17 puede suprimir significativamente la tumorigenicidad in vivo.

A fin de evaluar el efecto de CDH17 caída en el crecimiento del tumor primario, que luego investigó si la administración in vivo de CDH17 shRNA podría impedir el crecimiento de una xenoinjerto de tumor establecido a partir de células AGS parentales en ratones desnudos. Una semana después de la inoculación del tumor, cuando el tumor había alcanzado aproximadamente 100 mm ^{3, se realizó una inyección intratumoral de CDH17 shRNA o vector mock a una dosis de 10 9 partícula viral /inyección en el sitio del tumor. La inyección se administró dos veces por semana, durante 2 semanas. En los animales inyectados con el vector Mock, los tumores crecieron progresivamente durante el curso del experimento. Por el contrario, la inyección intratumoral de CDH17 shRNA resultó en tumores significativamente menores en cada punto de tiempo, incluyendo la medición final volumen (Fig. 4B). El examen de las células tumorales por CDH17 IHC demostrado una notable baja regulación de destino CDH17 previsto en las células tratadas shCDH17 (P < 0,05; Fig. 4B). Estos resultados demuestran que en la regulación por disminución in vivo de CDH17 en células de carcinoma gástrico reduce la formación de tumores en ratones, lo que implica que CDH17 es una diana terapéutica para el cáncer gástrico.}

Down-regulación de la señalización /β-catenina Wnt por CDH17 knockdown

Hemos interrogado varias vías con el fin de descubrir el mecanismo molecular de la inhibición mediada por caída CDH17 del crecimiento del cáncer gástrico, la proliferación y la metástasis. Encontramos varios miembros de la vía /β-catenina vía para ser expresados ​​diferencialmente entre shCDH17 y células de los padres. β-catenina expresión, la fosforilación de GSK-3β, y la expresión de ciclina D1 disminuyeron; y Rb expresión aumentó en ambos AGS y células MKN-45 shCDH17. Además, la expresión de p53, MDM2 y la clave del ciclo celular p21 regulador aumentado en desmontables células-CDH17. (Fig. 5A). En un ensayo de indicador de luciferasa TOPFLASH /FOPFLASH (Fig. 5B), la restauración de CDH17 en ambos AGS y MNK-45 células aumentó significativamente la fuerza de las señales TCF /LEF en comparación con los controles shCDH17. Además, como se muestra a modo de análisis de inmunotransferencia, se detectó un aumento tanto de la proteína total y nuclear β-catenina después de la restauración de CDH17 en AGS y MKN-45, en comparación con el shCDH17 (Fig. 5C) .Together, estos resultados indican que CDH17 desmontables resultados en la regulación a la baja de la vía /β-catenina en las células de cáncer gástrico. Esto, a su vez, sugiere que CDH17 mantiene el potencial de proliferación a través de la vía de señalización /β-catenina Wnt.

Discusión

CDH17 es una novela cadherina, su estructura es diferente de las de las cadherinas clásicas en que el dominio N-terminal y la porción citoplásmica no muestra una homología significativa con cadherinas clásicas [6]. La función biológica de CDH17 aún se desconoce. Numerosos estudios han informado de niveles elevados de CDH17 en diversos cánceres humanos, que une la expresión de esta proteína con el pronóstico y el riesgo assesment [10], [15]. CDH17 sobreexpresión se ha informado en adenocarcinoma gástrico [9], carcinoma hepatocelular [16] y el carcinoma colorrectal [17]. Esto indica que CDH17 puede ser crucial en el proceso tumoral en el cáncer gástrico y el hígado.

En los seres humanos, CDH17 normalmente se expresa exclusivamente en la superficie basolateral de los hepatocitos y enterocitos. Después de que el primer informe de CDH17 como un marcador metapasia intestinal por Grotzinger et [9] al, varias investigaciones han evaluado la expresión CDH17 en el cáncer gástrico. CDH17 se expresó en 50 a 78% de los tejidos de cáncer gástrico de tipo intestinal con predominio [18], [19]. En el presente estudio, hemos demostrado que CDH17 es un oncogén y una atractiva diana terapéutica en el cáncer gástrico: CDH17 es altamente expresado en los tejidos tumorales, con casi la mitad de los cánceres gástricos son CDH17 positivos por IHC. Park y sus colegas evaluaron la expresión CDH17 en más de 200 muestras de tejido de carcinoma gástrico, e informaron que se expresa altamente en estadios TNM anteriores [20], Además, encontraron que la expresión reducida de CDH17 ha demostrado estar estrechamente asociado con la agresividad del tumor y los ganglios linfáticos metástasis de carcinoma gástrico humano [20]. Sin embargo, otros informaron que su expresión fue mucho mayor en avanzado metástasis en ganglios linfáticos [18], [21]. En nuestro estudio, no hubo relación entre la expresión CDH17 y otras características clinicopatológicas.

Como factor pronóstico, la expresión CDH17 mostró una tendencia hacia un indicador para la supervivencia desfavorable en múltiples cohortes de pacientes, incluso después de controlar la etapa del tumor. En este contexto, la mediana de supervivencia global de 15,9 meses en el grupo con expresión CDH17 positivo, frente a 26,6 meses en los pacientes con tumores negativos de IHC representa una relación clínicamente significativa. Además, un análisis exploratorio mostró pobre supervivencia global en pacientes con alta expresión de la proteína CDH17 (IHC 2+ y 3+) en comparación con pacientes con baja expresión de la proteína CDH17 (IHC +). Estos hallazgos son dignos de mención en vista del mal pronóstico en esta población. En conjunto, la expresión CDH17 es un marcador pronóstico útil en el carcinoma gástrico y parece estar relacionado con la progresión tumoral.

El presente estudio demuestra que shRNA mediada CDH17 caída en los altamente tumorigénicas de células de carcinoma líneas AGS gástricas y MKN-45 podría reprimir eficazmente el crecimiento celular, disminuir la formación de focos y la formación de colonias en agar blando, así como la invasividad y la capacidad metastásica de cáncer gástrico in vitro. G1-S transición de fase es un punto de control importante para la progresión del ciclo celular y p21 es uno de los reguladores negativos críticos durante esta transición [22]. El principal efecto del ciclo celular de CDH17 desmontables es la inhibición de la transición de fase G1-S a través de la activación de p21 se confirmó en estudios blots (Fig. 5). Un estudio reciente en células de HCC encontró que el agotamiento de CDH17 dio como resultado la inhibición de la invasión, el crecimiento y la metástasis en células de carcinoma hepatocelular MHCC97H [16]. CDH17 es un regulador positivo para migratorio, adhesivo, y los comportamientos invasivos. Es concebible que, en consonancia con N-cadherina. En el cáncer gástrico, CDH17 puede mediar la interacción de células de carcinoma gástrico y con estroma ser involucrado en la promoción de la metástasis del cáncer gástrico, facilitando la migración de células de carcinoma y el restablecimiento de la adhesión célula-célula homofílica en la metástasis. Nuestros estudios proporcionan nuevos conocimientos sobre su posible papel en la iniciación y progresión del cáncer gástrico. De acuerdo con nuestros resultados, CDH17 es un oncogén y una atractiva diana terapéutica en el cáncer gástrico
.

De acuerdo con ello, postulamos que la orientación CDH17 se puede utilizar para tratar el cáncer gástrico in vivo. Los modelos de ratón de cáncer gástrico se utilizaron para validar el efecto de la orientación CDH17 como un tratamiento potencial. La infección de las células de carcinoma gástrico por CDH17 shRNA abolió su carcinogenicidad en ratones. En los ratones portadores de tumores, la administración local de lentiviral basado CDH17 shRNA inhibe el crecimiento del tumor, mostrando un efecto de supresión llamativa en la formación de tumores. Estos resultados tienen importantes implicaciones clínicas para el tratamiento del cáncer gástrico. Actualmente, sólo hay una terapia dirigida aprobado por la FDA para el tratamiento de un subconjunto de cáncer gástrico: Trastuzumab, un anticuerpo monoclonal que interfiere con el receptor de HER2. Por desgracia, los tumores HER2-expresión son poco frecuentes, sólo el 22% de pacientes de cáncer gástrico podría beneficiarse de esta terapia [23]. Por el contrario, CDH17 fue altamente expresado en el cáncer gástrico en casi 50% de los pacientes (Tabla 1) .Actualmente, la terapia estándar para el cáncer gástrico incluye la cirugía de reducción de volumen con óptimo de la enfermedad, seguido de un tratamiento citotóxico. A pesar de estos esfuerzos, el 80% de los pacientes diagnosticados con cáncer gástrico desarrollar la enfermedad recurrente y sólo el 20% de estos pacientes sobreviven 5 años después del diagnóstico [24]. Nuestros resultados sugieren fuertemente que los pacientes con cáncer gástrico se pueden beneficiar de la terapia dirigida contra CDH17, y justificar la exploración y diseño de inhibidores potenciales CDH17.

Los mecanismos moleculares por los cuales CDH17 regula el crecimiento del cáncer gástrico aún no se han dilucidado. Un informe reciente mostró un trans-interacción entre E-cadherina y CDH17 en los enterocitos durante el desarrollo del epitelio intestinal [25], [26], lo que sugiere que CDH17 podría cruzarse con la vía Wnt a través de su coordinación con E-cadherina y /o asociada fogonadura. Estudios previos han encontrado que la orientación CDH17 inactiva señalización Wnt /β-catenina en el carcinoma hepatocelular [16]. La activación de la señalización /β-catenina Wnt se encuentra en aproximadamente 30% de cáncer gástrico, y modelos de animales transgénicos también han demostrado que la señalización de Wnt promueve la carcinogénesis gástrica [27].

• PLOS ONE: caveolina-1 nivel de expresión en cáncer fibroblastos asociados predice el resultado en gástrico Cancer
• PLoS ONE: Fase II estudio de evaluación de los programas de dosificación de 2 Foretinib oral (GSK1363089), CMET /VEGFR2 inhibidor, en los pacientes con metástasis gástrica Cancer