Extracto
La interleucina 17A (IL-17A), como una citoquina proinflamatoria, está implicado en la patología de enfermedades inflamatorias y microambiente tumoral. El objetivo de este estudio es investigar el efecto de la IL-17A en la invasividad del cáncer gástrico (GC). En el estudio, encontramos que la IL-17A podría promover la migración y la invasión de las células GC. Además, después tratados con IL-17A, las expresiones y las actividades de la metaloproteinasa de matriz 2 se upregulated (MMP-2) y MMP-9, mientras que las expresiones de TIMP-1 y TIMP-2 se downregulated. Por otra parte, las fracciones nucleares /generales de p65 y p50 fueron elevados de manera espectacular por la IL-17A. El pretratamiento con helenalina, un inhibidor de factor nuclear-kB (NF-kB), se probó para abolir el efecto promotor de la IL-17A en la capacidad de invasión de las células de GC y la regulación positiva de MMP-2 y MMP-9. En conclusión, nuestros resultados ilustran que la IL-17A podría promover la invasión de las células de GC mediante la activación de NF-kappa B y, posteriormente, la regulación positiva de la expresión de MMP-2 y MMP-9. Estos resultados pueden conducir a la identificación de nuevos marcadores de diagnóstico y dianas terapéuticas de GC
Visto:. Wang Y, Wu H, Wu X, Z Bian, Gao Q (2014) Interleucina 17A Promueve la invasividad del cáncer gástrico a través de NF -κB mediadas por metaloproteinasas de la matriz 2 y 9 Expresión. PLoS ONE 9 (6): e96678. doi: 10.1371 /journal.pone.0096678
Editor: Nikos K. Karamanos, Universidad de Patras, Grecia
Recibido: November 26, 2013; Aceptado: April 11, 2014; Publicado: 6 Junio 2014
Derechos de Autor © 2014 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El proyecto fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81.070.536) y jóvenes Fondos Científicas del hospital central de Taian (2011ZRQNO35). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Como una de las principales causas de muerte por cáncer en todo el mundo, GC es responsable de más de 700.000 muertes por año [1]. Es el segundo cáncer más común y la tercera causa principal de muerte entre los pacientes con cáncer en China [2]. La invasión y la metástasis capacidad potente de GC es uno de los factores importantes que conducen a mal pronóstico [3]. Por lo tanto, es importante para descubrir los mecanismos subyacentes, para identificar nuevas dianas terapéuticas moleculares que regulan la capacidad de invasión de las células GC, y por lo tanto el desarrollo de tratamientos para el avance de GC.
IL-17A es el miembro fundador de la IL -17 familia que va de IL-17A a la IL-17F [4] - [8]. IL-17 miembros de la familia juegan un papel activo en diversas enfermedades tales como enfermedades autoinmunes, enfermedades inflamatorias y enfermedades malignas. La inflamación persistente se ha considerado que se correlaciona con un mayor riesgo de GC [9]. Los primeros pasos en la carcinogénesis gástrica implican Helicobacter pylori En el presente estudio, se encontró que la IL-17A podría aumentar la motilidad celular GC upregulating MMP-2 y MMP -9 a través de la activación de factores de transcripción NF-kB. Materiales y Métodos Cell Cultura y línea celular humana GC AGS se adquirió de ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA) y se mantuvieron en DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS; Hyclone, Logan, UT), 100 U /L penicilina y 100 mg /L de estreptomicina. líneas celulares GC humanos BGC-823 y SGC-7901 se obtuvieron de la Academia de Ciencias de China (Shanghai, China), y se cultivaron en medio RPMI-1640 que contiene 10% de suero bovino, penicilina (100 U /ml) y estreptomicina (100 mg /ml). Todas las células se cultivaron a 37 ° C, 5% de CO 2 atmósfera de aire. GC células fueron cultivadas como monocapas confluentes en una placa de 6 pocillos y fueron heridos mediante la eliminación de una tira de 1 mm de diámetro del pozo con una punta de pipeta cuando se adhieren a la superficie de la placa. A continuación, las monocapas de heridos se lavaron dos veces con PBS para eliminar las células no adherentes antes de 1 ml de medio con o sin IL-17A (50 ng /ml) (amp I +; Sistema D, Minneapolis, MN) se añadieron. Después de 12 h de incubación, los distintos grupos de concentración fueron fotografiados por micrografías invertidas. El in vitro lisados de células enteras a partir de células de GC se recogieron con tampón de lisis celular. lisados nucleares de las células cultivadas se recogieron con el Kit de NucBusterTM Protein Extraction (Novagen, Alemania) según las instrucciones del fabricante. análisis de transferencia de Western se realizaron con el protocolo estándar utilizando anticuerpos contra MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2, p52 y β-actina (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), NF-KB-p50, p65 /Rela c-Rel, RelB, y la histona H1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Zymography Las células fueron tratadas con diferentes concentraciones de IL-17A a 37 ° C durante 24 h, y las muestras de medio condicionado fueron recogidos. volúmenes apropiados de las muestras (ajustados por el número de células vitales) se separaron mediante electroforesis SDS-PAGE 0,1% de gelatina-8%. Después de la electroforesis, los geles se lavaron dos veces en 2,5% de Triton X-100 a temperatura ambiente durante 30 min y después se incubaron en tampón de reacción (mM CaCl 10 2, 40 mM Tris-HCl y 0,01% NaN 3, pH 8,0) a 37 ° C durante 12 h. A continuación se usó azul brillante de Coomassie R-mancha gel 250 para teñir el gel. Las intensidades de las bandas en los geles se calcularon utilizando un sistema de análisis de imágenes (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA). Todos los datos se expresan como las medias ± SD. El análisis estadístico se realizó utilizando el software SPSS 16.0 (SPSS Inc., Chicago, Illinois, EE.UU.) para evaluar las diferencias estadísticas. Estudiante de t-test IL-17A aumenta la motilidad celular en las células GC Se realizó un ensayo de los arañazos de la herida para determinar el efecto de la IL-17A sobre la migración en AGS, BGC-823, y las células SGC-7901. La extensión de la migración celular se cuantificó mediante el cálculo del porcentaje de recolonización de la superficie de la herida después de 24 h. En el grupo control, el movimiento no era evidente. En presencia de IL-17A, este movimiento se promovió significativamente después de 12 h de incubación (Figura 1A). análisis de cuantificación indicó que la diferencia era significativa (Figura 1B). Además, el ensayo de invasión mostraron que la capacidad invasiva de la IL-17A células tratadas fue significativamente más fuerte que el control de células parentales en las tres líneas celulares analizadas (Figura 1C y 1D). Estos datos mostraron que la IL-17A podría mejorar la migración de células GC y la invasividad. Además, también se observó que la IL-17A no tiene ningún efecto significativo sobre la proliferación de células AGS (Figura S1) BGC-823, SGC-7901 y, lo que sugiere que el efecto promotor de la IL-17A en la migración y la invasión no son interferidos por célula proliferación. Efecto de la IL-17A en Upregulation de MMP-2 y MMP-9 y regulación a la baja de TIMP-1 y TIMP-2 en células de GC Desde la sobreexpresión de las MMP pueden promover la metástasis del cáncer [18], [19], el próximo investigó el efecto de la IL-17A en la expresión de las MMP en las líneas celulares de GC. Como se muestra en la Figura 2 y la Figura S2, las expresiones de MMP-2 y MMP-9 se compararon mediante transferencia de Western entre las células tratadas y no tratadas IL-17A. El resultado mostró que MMP-2 y MMP-9 se upregulated en IL-17A células tratadas (AGS y BGC-823) (Figura 2A y 2B). Al mismo tiempo, las expresiones de TIMP-1 y TIMP-2 se downregulated (Figura 2A y 2B). También se realizó zimografía de gelatina para evaluar la actividad de MMP-2 y MMP-9 en células de GC tratadas con o sin IL-17A. Los resultados mostraron que la IL-17A mejorado la actividad de MMP-2 y MMP-9 en células de GC (AGS y BGC-823) (Figura 2C y 2D). Resultados similares se han observado en las células SGC-7901 (Figura S2). Estos resultados sugieren que el efecto pro-metástasis de IL-17A en la GC podría ser a través de la regulación del balance MMP /TIMP y nos llevó a explorar más a fondo su mecanismo de acción. NF-B ha sido reportado como un objetivo corriente abajo de la vía de señalización de IL-17A en muchas células [17], [20], [21], que es capaz de regular al alza MMP-2 y MMP-9 expresiones [14], [17]. Y la IL-17A también se informó para aumentar la expresión de MMPs a través de la activación de NF-kappa B en muchas células [14], [17]. Por lo tanto, el próximo comprobado si la IL-17A upregulated MMP-2 y MMP-9 expresión en células de GC a través de la activación de NF-kB. Como se muestra en la Figura 3, la expresión y translocación de las subunidades de NF-kB en el núcleo se analizaron por transferencia Western. Hemos observado que el nivel de p65 y p50 en los núcleos fue elevado dramáticamente en las células AGS después de tratamiento con IL-17A, mientras que el nivel de p65 en general y p50 no tiene ningún cambio (Figura 3A-D). Además, el /fracción nuclear general de estas moléculas se incrementó tras el tratamiento de IL-17A (Figura 3E). Resultados similares se observaron en la línea celular BGC-823 (Figura S3 A-E), lo que indica que la IL-17A activa NF-kB en las líneas celulares de GC. Además, cuando Helenalina (5 M) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), un inhibidor de NF-kappa B, se añadió a AGS o células BGC-823 medio antes del tratamiento de IL-17A, los niveles de expresión de MMP-2 y MMP-9 se redujo significativamente (Figura 4C-D, la figura S4C-D). El resultado demostró que la IL-17A induce MMP-2 y MMP-9 expresión en células GC a través de la activación de NF-kB. En consecuencia, la IL-17A invasividad celular inducida por GC también podría sido bloqueado por helenalina in vitro gratis (Figura 4A-B, Figura S4A-B). Por lo tanto, estos resultados sugieren que la IL-17A se activa ruta de NF-kB, posteriormente regula la expresión de MMP, y por lo tanto afecta a la migración y la invasión de las células GC. GC es una de las la mayoría de las enfermedades malignas fatales en el mundo debido a su alta tasa de recurrencia tras tratamiento curativo [3], [22]. GC está estrechamente relacionada con enfermedades inflamatorias crónicas, en la que un montón de citoquinas inflamatorias se infiltran. IL-17A es una de las citoquinas inflamatorias importantes en el desarrollo de muchas enfermedades inflamatorias y también se detecta con frecuencia en microentorno del tumor [23] - [26]. estudio anterior sugiere que los niveles de expresión de IL-17 en el tumor podría ser un indicador pronóstico independiente en pacientes con adenocarcinoma gástrico [27]. La comparación de las tasas de supervivencia entre los pacientes con niveles altos y bajos de IL-17 encontró que los pacientes con altos niveles de IL-17 tuvieron una tasa de supervivencia a 5 años del 47% en comparación con el 84% en pacientes con niveles bajos [28]. Sin embargo, los mecanismos moleculares para tal correlación, que pueden ayudar a comprender mejor el papel de la IL-17 en el desarrollo y progreso de la GC, aún no se han dilucidado. En el presente estudio, se encontró que la IL 17A promovió la invasión de las células GC. La metástasis es una de las principales causas de muerte por cáncer entre los pacientes con cáncer gástrico. La degradación de la ECM de los vasos sanguíneos o linfáticos es crítico para la metástasis, ya que la pérdida de la ECM permite a las células cancerosas invadan la sangre o el sistema linfático y se extendió a otros tejidos y órganos [29]. MMPs, especialmente MMP-2 y MMP-9, son responsables de la degradación de la ECM [19], [29]. IL-17A se ha informado que la promoción de la invasión de las células cancerosas a través de la regulación positiva de la expresión de MMP-2 y MMP-9 [17], [26]. En general se acepta que las actividades de las MMP son inhibidas por TIMPs para evitar una degradación de ECM [29]. Para aclarar el mecanismo de acción de la IL-17A, se investigó si el efecto promotor de la IL-17A en la invasión de células es a través de la regulación de la expresión de MMP-2, MMP-9, TIMP-1 y TIMP-2. Nuestros resultados mostraron que la IL-17A elevó las expresiones y actividades de MMP-2 y MMP-9, y regulado por disminución la expresión de TIMP-1 y TIMP-2, lo que explica además que la IL-17A promueve la migración celular en la curación de cero herida ensayo. Por lo tanto, el efecto pro-metástasis de IL-17A en la GC podría ser a través de la regulación del balance MMP /TIMP. NF-B ha sido reportado como un objetivo corriente abajo de la vía de señalización de IL-17A en muchas células [17] , [20], [21], que es capaz de regular por incremento MMP-2 y MMP-9 expresiones [14], [17]. Y la IL-17A también se informó para aumentar la expresión de MMPs a través de la activación de NF-kappa B en muchas células [14], [17]. Así se investigó si la regulación al alza de MMP-2 y MMP-9 inducida por la IL-17A es a través de la activación de NF-kB. Los resultados mostraron IL-17A promueve la translocación nuclear de la p65 y p50 subunidades de células GC y posteriormente upregulated la expresión de MMP-2 y MMP-9. Este efecto podría ser bloqueado eficazmente por el inhibidor de NF-kappa B, lo que sugiere que la activación de NF-kappa B es el mecanismo potencial para regular positivamente la MMP-2 y MMP-9 por la IL-17A En conclusión., Nuestros hallazgos sugieren que la IL-17A fue capaz de promover la migración y la invasividad de las células de GC mediante la activación de NF-kappa B, que posteriormente se upregulated la expresión de MMP-2 y MMP-9 y con ello afectada la migración y la invasividad de las células de GC. Además de la caracterización del efecto de la IL-17A en la invasión y la metástasis GC puede conducir a la identificación de nuevos marcadores de diagnóstico y dianas terapéuticas.
(H. pylori) que conduce a la gastritis crónica atrófica activa y con la producción de mediadores proinflamatorios [10] - [13], tales como IL-1b, TNF, IFN, IL-6, y IL-8. Sin embargo, el papel de la IL-17A en el cáncer era incompatible acuerdo con informes anteriores. Algunas pruebas reveló que la IL-17A podría promover el crecimiento del tumor mediante la estimulación de la angiogénesis y la capacidad invasiva de las células tumorales [14]. Por el contrario, otros estudios sugieren que la IL-17A mostró un efecto protector contra el desarrollo de la leucemia linfocítica crónica, promoviendo mediada por sistema inmune de rechazo de tumores [15]. Además, la IL-17A mejora los efectos citotóxicos de las células NK contra las células tumorales mediante el aumento de la expresión de moléculas citotóxicas [16]. Hasta ahora, hay menos informe sobre el papel de la IL-17A en la invasión de GC.
Curación de Heridas Ensayo
in vitro
Invasión Ensayo
ensayo de invasión se realizó a través el sistema de ensayo de invasión de Bio-Coat Matrigel (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) como se describe anteriormente [17]. Después de tratada con o sin IL-17A (50 ng /ml), las células de GC se sembraron en 200 l de medio libre de suero y se colocaron en las cámaras superiores a 2 × 10 5 células y el medio de crecimiento normal se colocaron en cámaras de debajo . Veinticuatro horas más tarde, las células de la superficie superior de la membrana se retiraron con hisopos de algodón, mientras que las células en el lado inferior del filtro se fijaron, se tiñeron y se miden. El porcentaje de la frecuencia invasiva se expresó como un porcentaje de control.
Western Blotting Análisis
Análisis estadístico
se utilizó para las comparaciones entre los dos grupos y en un solo sentido o análisis de dos vías de varianza se utilizó para analizar las diferencias estadísticas entre los grupos en diferentes condiciones. Un p valor
inferior a 0,05 se consideró estadísticamente significativa. Todas las pruebas estadísticas fueron de dos caras.
Resultados
IL-17A favorece la expresión de MMP-2 y MMP 9 Las expresiones a través de Activación de NF-kB Camino
Discusión
Información de Apoyo
figura S1. Francia El efecto de la IL-17A en la proliferación de BGC-823, SGC-7901 y las células AGS
doi:. 10.1371 /journal.pone.0096678.s001 gratis (TIF)
figura S2. hotels, IL-17A promueve la expresión de MMP-2 y MMP-9 y suprime la expresión de TIMP-1 y TIMP-2 en células SGC-7901. (A) Las expresiones de las MMP en las células SGC-7901 se compararon por el Western Blot entre las células tratadas con y sin IL-17A (50 ng /ml) durante 24 h. (B) Cuantificación de los niveles de proteína de MMP-2 y MMP-9. Los valores representan la media ± SD de tres experimentos independientes realizados por triplicado. . * p Hotel < 0,05, en comparación con el grupo control
doi: 10.1371 /journal.pone.0096678.s002 gratis (TIF)
Figura S3. hotels, IL-17A activa NF-kB en las células BGC-823. (A) Se utilizó el análisis de transferencia Western para detectar p50 general, p65, p52, c-Rel, y RelB expresión en células BGC-823 tratadas con IL-17A (50 ng /ml) en los puntos de tiempo indicados. (B) Cuantificación de los niveles de proteína de p50 en general, p65, p52, c-Rel, y RelB. (C) Análisis de transferencia de Western se utilizó para detectar p50 nuclear, p65, p52, c-Rel, y RelB expresión en células BGC-823 tratadas con IL-17A (50 ng /ml) en los puntos de tiempo indicados. (D) La cuantificación de los niveles de proteína de p50 nuclear, p65, p52, c-Rel, y RelB. (E) la proporción relativa de nuclear a la fracción global de p50, p65, p52, c-Rel, y RelB. Los valores representan la media ± SD de tres experimentos independientes realizados por triplicado. . * p Hotel < 0,05, en comparación con el grupo control
doi: 10.1371 /journal.pone.0096678.s003 gratis (TIF)
figura S4.
Efectos de helenalina y IL-17A en la invasión de células y la expresión de MMP-2 y MMP-9 en células BGC-823. (A) 1 × 10 6 BGC-823 células fueron pretratadas con helenalina (5 M) y después se incubaron en presencia o ausencia de IL-17A (50 ng /ml) durante 24 h. invasividad celular se midió usando el ensayo transwell invasión. (B) La tasa de invasión por ciento se expresó como un porcentaje de control. (C, D) Los niveles de proteína de MMP-2 y MMP-9 fueron detectados por Western Blot, cuando las células BGC-823 fueron tratados con helenalina y /o IL-17A. Los valores representan la media ± SD de tres experimentos independientes realizados por triplicado. * p Hotel < 0,05, en comparación con el grupo control
doi:. 10.1371 /journal.pone.0096678.s004 gratis (TIF)
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