PLoS ONE: Interleukin 17A Fremmer Gastric Cancer invasiv via NF-KB Mediated matrixmetalloproteinaser 2 og 9 Expression

Abstrakt

Interleukin 17A (IL-17A), som et pro-inflammatorisk cytokin, der er involveret i patologien af ​​inflammatoriske sygdomme og tumormikromiljøet. Formålet med denne undersøgelse er at undersøge virkningen af ​​IL-17A på invasivitet af gastrisk cancer (GC). I undersøgelsen fandt vi, at IL-17A kunne fremme migration og invasion af GC-celler. Endvidere efter behandling med IL-17A, udtryk og aktiviteter af matrixmetalloproteinase 2 (MMP-2) og MMP-9 blev opreguleres, mens udtrykkene for TIMP-1 og TIMP-2 blev nedreguleret. Desuden blev de nukleare /samlede fraktioner af p65 og p50 dramatisk forhøjet med IL-17A. Forbehandling med helenalin, en nuklear faktor-KB (NF-KB) inhibitor, blev bevist at afskaffe fremmende virkning af IL-17A på invasionen evne GC-celler og opregulering af MMP-2 og MMP-9. Afslutningsvis vores resultater vist, at IL-17A kunne fremme invasion af GC-celler ved at aktivere NF-KB-vejen, og efterfølgende at opregulere ekspressionen af ​​MMP-2 og MMP-9. Disse resultater kan føre til identifikation af nye diagnostiske markører og terapeutiske mål for GC

Henvisning:. Wang Y, Wu H, Wu X, Bian Z, Gao Q (2014) Interleukin 17A Fremmer Gastric Cancer invasiv via NF -κB Mediated matrixmetalloproteinaser 2 og 9 ekspression. PLoS ONE 9 (6): e96678. doi: 10,1371 /journal.pone.0096678

Redaktør: Nikos K. KARAMANOS, University of Patras, Grækenland

Modtaget: November 26, 2013; Accepteret 11. april 2014 Udgivet: 6 juni 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Projektet blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr 81.070.536) og Ungdom videnskabelige midler fra Central Hospital i Taian (2011ZRQNO35). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Som en af ​​de øverste årsager til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan, GC er ansvarlig for mere end 700.000 dødsfald om året [1]. Det er den anden mest almindelige cancer og den tredje hyppigste dødsårsag blandt kræftpatienter i Kina [2]. Den potente invasion og metastase evne GC er en af ​​de vigtige faktorer, der fører til dårlig prognose [3]. Derfor er det væsentligt at afdække de underliggende mekanismer, at identificere nye molekylære terapeutiske mål, der regulerer invasion evner GC celle, og dermed til at udvikle fremrykkende behandlinger for GC.

IL-17A er stiftende medlem af IL -17 familie, som spænder fra IL-17A til IL-17F [4] - [8]. IL-17 familiemedlemmer spiller en aktiv rolle i forskellige sygdomme, såsom autoimmune sygdomme, inflammatoriske sygdomme og maligne sygdomme. Vedvarende inflammation er blevet anset for at være korreleret med øget risiko for GC [9]. Tidlige trin i gastrisk carcinogenese involverer Helicobacter pylori Hotel (H. pylori) infektion, der fører til kronisk aktiv og atrofisk gastritis med produktion af proinflammatoriske mediatorer [10] - [13], såsom IL-1b, TNF, IFNy, IL-6 og IL-8. Men rollen som IL-17A i kræft var inkonsekvent i henhold til tidligere rapporter. Nogle beviser afslørede, at IL-17A kan fremme tumorvækst ved at stimulere angiogenese og invasive kapacitet af tumorceller [14]. I modsætning hertil er andre undersøgelser antydet, at IL-17A viste en beskyttende virkning mod kronisk lymfatisk leukæmi udvikling ved at fremme immunsystem-medieret tumorafstødning [15]. Endvidere IL-17A forbedret de cytotoksiske virkninger af NK-celler mod tumorceller ved at øge ekspressionen af ​​cytotoksiske molekyler [16]. Indtil nu, er der mindre rapport om den rolle, IL-17A i invasionen af ​​GC.

I den foreliggende undersøgelse, fandt vi, at IL-17A kunne øge GC celle motilitet ved opregulering MMP-2 og MMP -9 via aktivering NF-KB transcript faktorer.

Materialer og metoder

Cell Culture

Menneskelig GC cellelinje AGS blev købt fra ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA) og holdt i DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS; Hyclone, Logan, UT), 100 U /l penicillin og 100 mg /l streptomycin. Humane GC cellelinier BGC-823 og SGC-7901 blev opnået fra Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina), og dyrket i RPMI-1640-medium indeholdende 10% bovint serum, penicillin (100 U /ml) og streptomycin (100 ug /ml). Alle celler blev dyrket ved 37 ° C, 5% CO _{2 luftatmosfære.}

sårheling Assay Salg

GC-celler blev dyrket som konfluerende monolag i en plade med 6 brønde og blev såret ved at fjerne et 1 mm strimmel tværs brønden med en pipettespids, når de klæbes til pladens overflade. De sårede monolag blev derefter vasket to gange med PBS for at fjerne ikke-adhærerende celler før 1 ml medium med eller uden IL-17A (50 ng /ml) (R &D System, Minneapolis, MN) blev tilsat. Efter 12 timers inkubation blev forskellige koncentration grupper fotograferet af omvendte mikrografier.

In vitro
Invasion Assay

in vitro
invasion assay blev udført ved hjælp af Bio-Coat Matrigel invasion assaysystem (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) som tidligere beskrevet [17]. Efter behandlet med eller uden IL-17A (50 ng /ml), blev GC-celler podet i 200 pi serumfrit medium og anbringes i de øvre kamre ved 2 × 10 ^{5 celler og normalt vækstmedium blev anbragt i nedenunder kamre . Fireogtyve timer senere blev cellerne på den øvre overflade af membranen fjernes med vatpinde, mens cellerne på undersiden af ​​filteret blev fikseret, farvet og måles. Procentdelen af ​​invasiv sats blev udtrykt som en procentdel af kontrol.}

Western blotting-analyse

Helcellelysater fra GC-celler blev høstet med cellelyse-buffer. Nukleare lysater fra dyrkede celler blev høstet med NucBusterTM Protein Extraction Kit (Novagen, Tyskland) ifølge producentens instruktioner. Western blotting-analyser blev udført med standardprotokollen under anvendelse af antistoffer mod MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2, p52 og β-actin (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), NF-KB-p50, p65 /RelA, c-Rel, RelB, og histon H1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA).

Zymografi

Celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af IL-17A ved 37 ° C i 24 timer, og prøver af konditioneret medium blev opsamlet. Passende volumener af prøverne (justeret med vital celleantal) blev adskilt ved 0,1% gelatine-8% SDS-PAGE-elektroforese. Efter elektroforese blev gelerne vasket to gange i 2,5% Triton X-100 ved stuetemperatur i 30 minutter og derefter inkuberet i reaktionsbuffer (10 mM CaCl _{2, 40 mM Tris-HCI og 0,01% NaN 3, pH 8,0) ved 37 ° C i 12 timer. Coomassie brilliant blue R-250 gel pletten blev derefter anvendt til at farve gelen. De intensiteter af bånd på gelerne blev beregnet ved hjælp af et billede analysesystem (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA).}

Statistisk analyse

Alle data blev udtrykt som middel ± SD. Den statistiske analyse blev udført under anvendelse af SPSS 16.0 software (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA) for at evaluere statistiske forskelle. Studerendes t
-test blev anvendt til sammenligninger mellem to grupper og en-vejs eller to-vejs variansanalyse blev anvendt til at analysere statistiske forskelle mellem grupper under forskellige forhold. En s Drømmeholdet værdi mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Alle statistiske tests var tosidet.

Resultater

IL-17A Øger Cell motilitet i GC Celler

En scratch-sår assay blev udført for at bestemme virkningen af ​​IL-17A på migration i AGS, BGC-823, og SGC-7901 celler. Forlængelsen af ​​cellemigrering blev kvantificeret ved at skønne rekolonisering af såret overflade efter 24 timer. I kontrolgruppen, bevægelsen var ikke indlysende. I nærvær af IL-17A, blev denne bevægelse fremmes signifikant efter 12 h inkubation (figur 1A). Kvantificering analyse viste, at forskellen var signifikant (figur 1B). Desuden viste invasionen assay, at den invasive evne IL-17A-behandlede celler var signifikant stærkere end styre parentale celler i alle tre testede cellelinjer (figur 1C og 1D). Disse data viste, at IL-17A kunne forbedre GC cellevandring og invasionsevne. Desuden er vi også observeret, at IL-17A har ingen signifikant virkning på spredning af BGC-823, SGC-7901 og AGS celler (Figur S1), hvilket tyder på, at den fremmer virkningen af ​​IL-17A om migration og invasionsevne ikke forstyrret af celle proliferation.

Virkning af IL-17A på opregulering af MMP-2 og MMP-9 og nedregulering af TIMP-1 og TIMP-2 i GC Celler Salg

Da overekspression af MMP'er kan fremme cancermetastase [18], [19], Derefter undersøgte vi virkningen af ​​IL-17A på MMP'er ekspression i GC cellelinier. Som vist i figur 2 og figur S2, blev udtrykkene for MMP-2 og MMP-9 sammenlignet ved anvendelse Western blotting mellem IL-17A behandlede og ubehandlede celler. Resultatet viste, at MMP-2 og MMP-9 blev opreguleret i IL-17A behandlede celler (AGS og BGC-823) (figur 2A og 2B). Samtidig blev de udtryk for TIMP-1 og TIMP-2 nedreguleret (figur 2A og 2B). Gelatinezymografi blev også udført for at vurdere aktiviteten af ​​MMP-2 og MMP-9 i GC-celler behandlet med eller uden IL-17A. Resultaterne viste, at IL-17A forstærkede aktiviteten af ​​MMP-2 og MMP-9 i GC-celler (AGS og BGC-823) (figur 2C og 2D). Lignende resultater er blevet observeret i SGC-7901-celler (Figur S2). Disse resultater antydede, at pro-metastase virkningen af ​​IL-17A på GC kan være gennem regulering MMP /TIMP balance og fik os til yderligere at udforske dets virkningsmekanisme.

IL-17A opregulerer MMP-2 og MMP- 9 udtryk via Aktivering NF-KB pathway

NF-KB er blevet rapporteret som en downstream mål for IL-17A signalvejen i mange celler [17], [20], [21], som er i stand til at opregulere MMP-2 og MMP-9 udtryk [14], [17]. Og IL-17A blev også rapporteret at øge ekspressionen af ​​MMP'er via aktivering NF-KB-vejen i mange celler [14], [17]. Derfor næste kontrolleres vi, om IL-17A opreguleret MMP-2 og MMP-9 udtryk i GC celler gennem aktivering NF-KB. Som vist i figur 3, blev ekspressionen og translokation af NF-KB-underenheder i nucleus analyseret ved Western blotting. Vi observerede, at niveauet af p65 og p50 i kerner dramatisk var forhøjet i AGS celler efter IL-17A behandling, mens niveauet for den samlede p65 og p50 har ingen ændring (Figur 3A-D). Desuden blev den nukleare /samlet fraktion af disse molekyler forøget ved IL-17A behandling (figur 3E). Lignende resultater blev observeret i BGC-823 cellelinje (figur S3A-E), hvilket indikerer, at IL-17A aktiveret NF-KB i GC cellelinier.

Når endvidere helenalin (5 uM) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), et NF-KB inhibitor, blev sat til AGS eller BGC-823 celler medium før IL-17A behandling, ekspressionsniveauerne af MMP-2 og MMP-9 blev signifikant reduceret (figur 4C-D, fig S4C-D). Resultatet viste, at IL-17A-induceret MMP-2 og MMP-9-ekspression i GC cellen via NF-KB-aktivering. Følgelig kunne IL-17A-induceret GC celle invasionsevne også blevet blokeret af helenalin in vitro
(Figur 4A-B, fig S4A-B). Derfor tyder disse resultater, at IL-17A aktiverer NF-KB-vejen, efterfølgende regulerer ekspressionen af ​​MMP'er og derved påvirker migration og invasivitet af GC-celler.

Diskussion

GC er en af ​​de de fleste dødelige maligne sygdomme i verden på grund af sin høje tilbagefald sats efter helbredende behandlinger [3], [22]. GC er tæt korreleret med kroniske inflammatoriske sygdomme, i hvilke masser af inflammatoriske cytokiner infiltrere. IL-17A er en af ​​de vigtige inflammatoriske cytokiner i udviklingen af ​​mange inflammatoriske sygdomme og er også ofte påvist i tumormikromiljøet [23] - [26]. Tidligere undersøgelse antydede, at ekspressionsniveauerne af IL-17 i tumoren kan være en uafhængig prognostisk indikator i gastrisk adenocarcinom patienter [27]. Sammenligning af overlevelsesrater mellem patienter med høje og lave niveauer af IL-17, at patienter med høje niveauer af IL-17 havde en 5-års overlevelsesrate på 47% mod 84% hos patienter med lave niveauer [28]. Men de molekylære mekanismer for en sådan sammenhæng, som kan hjælpe os til bedre at forstå den rolle IL-17 i udvikling og fremskridt i GC, er endnu ikke klarlagt.

I den foreliggende undersøgelse, fandt vi, at IL 17A fremmet invasionen af ​​GC-celler. Metastase er en af ​​de førende årsager til kræft-relaterede dødsfald blandt GC patienter. Nedbrydning af ECM af blod eller lymfekar er kritisk for metastase, fordi tab af ECM'en tillader kræftceller at invadere blodet eller lymfesystemet og sprede sig til andre væv og organer [29]. MMP'er, især MMP-2 og MMP-9, er ansvarlige for nedbrydning ECM [19], [29]. IL-17A er blevet rapporteret at fremme invasion af cancerceller via opregulere ekspressionen af ​​MMP-2 og MMP-9 [17], [26]. Det er almindeligt accepteret, at MMP aktiviteter inhiberes af TIMP'er at forhindre omfattende ECM nedbrydning [29]. At klarlægge virkningsmekanismen af ​​IL-17A, undersøgte vi, om den fremmende virkning af IL-17A på celleinvasion er gennem regulering af udtrykkene for MMP-2, MMP-9, TIMP-1 og TIMP-2. Vores resultater viste, at IL-17A eleveret de udtryk og aktiviteter af MMP-2 og MMP-9, og nedreguleret udtrykkene for TIMP-1 og TIMP-2, som yderligere forklaret, at IL-17A fremmes cellemigrering i bunden sårheling assay. Derfor kan den pro-metastaser effekt af IL-17A på GC være gennem regulering af MMP /TIMP balance.

NF-KB er blevet rapporteret som en downstream mål for IL-17A signalvejen i mange celler [17] [20], [21], som er i stand til at opregulere MMP-2 og MMP-9 udtryk [14], [17]. Og IL-17A blev også rapporteret at øge ekspressionen af ​​MMP'er via aktivering NF-KB-vejen i mange celler [14], [17]. Så vi undersøgt, om opregulering af MMP-2 og MMP-9 induceret af IL-17A er gennem aktivering NF-KB-vejen. Resultaterne viste IL-17A fremmet nuklear translokation af p65 og p50-underenhederne af GC-celler og efterfølgende opreguleres ekspressionen af ​​MMP-2 og MMP-9. Denne virkning kan blokeres effektivt ved NF-KB inhibitor, hvilket antyder, at aktivering af NF-KB er den potentielle mekanisme til at opregulere MMP-2 og MMP-9 med IL-17A.

Som konklusion foreslået vores resultater at IL-17A var i stand til at fremme migration og invasivitet af GC-celler ved at aktivere NF-KB-vejen, som efterfølgende opreguleret udtrykkene for MMP-2 og MMP-9 og derved påvirkes migration og invasivitet af GC-celler. Yderligere karakterisering af virkningen af ​​IL-17A på GC invasion og metastase kan føre til identifikation af nye diagnostiske markører og terapeutiske mål.

Støtte Information
figur S1.
effekt af IL-17A om spredning af BGC-823, SGC-7901 og AGS celler
doi:. 10,1371 /journal.pone.0096678.s001
(TIF)
Figur S2.
IL-17A fremmer udtrykkene for MMP-2 og MMP-9 og undertrykker udtrykkene for TIMP-1 og TIMP-2 i SGC-7901 celler. (A) Udtryk af MMP'er i SGC-7901 celler blev sammenlignet ved western blotting mellem celler behandlet med og uden IL-17A (50 ng /ml) i 24 timer. (B) Kvantificering af proteinniveauer af MMP-2 og MMP-9. Værdier repræsenterer middel ± SD af tre uafhængige forsøg udført in triplo. . * s
< 0,05, sammenlignet med kontrolgruppen
doi: 10,1371 /journal.pone.0096678.s002
(TIF)
figur S3.
IL-17A aktiverer NF-KB i BGC-823 celler. (A) Western blotting-analyse blev anvendt til at detektere den samlede p50, p65, p52, c-Rel og RelB ekspression i BGC-823-celler behandlet med IL-17A (50 ng /ml) ved angivne tidspunkter. (B) Kvantificering af protein niveauer for generel p50, p65, p52, c-Rel og RelB. (C) Western blotting-analyse blev anvendt til at detektere nukleare p50, p65, p52, c-Rel og RelB ekspression i BGC-823-celler behandlet med IL-17A (50 ng /ml) ved angivne tidspunkter. (D) Kvantificering af protein niveauer af nukleare p50, p65, p52, c-Rel og RelB. (E) Den relative forhold mellem nuklear til den samlede brøkdel af p50, p65, p52, c-Rel og RelB. Værdier repræsenterer middel ± SD af tre uafhængige forsøg udført in triplo. . * s
< 0,05, sammenlignet med kontrolgruppen
doi: 10,1371 /journal.pone.0096678.s003
(TIF)
figur S4. Salg Virkninger af helenalin og IL-17A på celle invasion og udtryk for MMP-2 og MMP-9 i BGC-823 celler. (A) 1 x 10 6 BGC-823-celler blev forbehandlet med helenalin (5 uM) og derefter inkuberet i nærvær eller fravær af IL-17A (50 ng /ml) i 24 timer. Cellulær invasionsevne blev målt under anvendelse af transwell invasion assay. (B) Den procentvise invasion sats blev udtrykt som en procentdel af kontrol. (C, D) De proteinniveauer af MMP-2 og MMP-9 blev detekteret ved western blotting, når BGC-823 celler blev behandlet med helenalin og /eller IL-17A. Værdier repræsenterer middel ± SD af tre uafhængige forsøg udført in triplo. * s
< 0,05, sammenlignet med kontrolgruppen
doi:. 10,1371 /journal.pone.0096678.s004
(TIF)

• PLoS ONE: Ændret Ekspression af Hypoxi-Inducerbar Factor-1α (HIF-1α) og dens regulatoriske gener i Gastric Cancer Væv
• PLoS ONE: Cirkulerende tumorceller (CTCs) Fundne ved RT-PCR og dens Prognostisk Rolle i Gastric Cancer: En metaanalyse af Udgivet Literature